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문제 정의
- 본 연구에서는 식물의 질병 제어에 효과가 있다고 알려져 있는 식물근권세균을 이용하여 어류질병세균에 대한 항균활성의 확인을 통해 양식 어류의 세균성 질병에 대한 치료, 예방 대책으로서의 이용 가능성을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- BRH433-2, THJ609-3, TRH415-2의 계통학적 분석 결과는 각각 표준 균주와의 염기서열 분석 비교를 통해 이루어졌다. BRH433-2의 염기서열 분석결과는 Burkholderia gladioli와 99.
- 4가 되도록 희석하여 멸균된 면봉으로 Muller Hinton Agar (MHA, Difco, USA)에 고르게 도말하였다. 각각의 병원균이 도말된 MHA에 식물근권세균이 배양된 TSA를 절취하여(직경 8 mm) 접종하고, 25℃에서 48시간 배양하여 1차적으로 생육저해환(clear zone, mm) 의 생성여부를 확인하였다.
- , Korea). 분석한 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Blast와 EzTaxon-e (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)를 이용하여 Genbank에 보고된 균주와의 상동성을 조사하고 ClustalX로 multiple alignment를 수행하고, MEGA6.0으로 계통도(phylogenetic tree)를 작성하였다.
- 식물근권세균 12균주 중 억제환이 생성된 균을 선발하여 Tryptic Soy Broth (TSB, Difco, USA)에 48시간 동안 배양한 후 14,000x g 에서 15분간 원심하여 상층액과 균체를 분리하였다. 분리한 상층액은 0.
- 어류질병세균에 대한 항균효과를 확인하기 위해 식물근권 세균을 TSA에 접종하여 25℃에서 48시간 동안 배양하였다. 한국생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)로 부터 분양 받은 그람 양성균 Streptococcus iniae (KCTC 3757), S.
- 원심분리를 하지 않은 배양액과 상층액, 균체 현탁액을 각각 멸균한 8 mm paper disc (ADVANTEC, Japan)에 50 μl씩 분주, 건조시켜 병원균 4종의 O.D값(660 nm)이 0.4가 되도록 희석하여 각각 도말된 MHA에 부착한 후, 25℃에서 48시간 배양하였고 생성된 생육저해환의 크기를 측정하여 항균활성을 확인하였다.
- 추출한 genomic DNA 는 27F/1492R universal primer를 이용하여 Initial denaturation (95℃, 2분) 후, Denaturation (95℃, 30초), Annealing (55℃, 30초), Extension (72℃, 30초)으로 총 30 cycle을 반복하여 PCR을 수행하였다. 최종 cycle에서 Last Extension (72℃, 5분)까지 수행하여 16S rDNA 유전자를 증폭하고 염기서열을 분석하였다(Solgent co., Ltd., Korea). 분석한 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Blast와 EzTaxon-e (http://eztaxon-e.
- 생육저해환이 생성된 균주는 Chelex bead를 이용한 boiling 방법으로 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 genomic DNA 는 27F/1492R universal primer를 이용하여 Initial denaturation (95℃, 2분) 후, Denaturation (95℃, 30초), Annealing (55℃, 30초), Extension (72℃, 30초)으로 총 30 cycle을 반복하여 PCR을 수행하였다. 최종 cycle에서 Last Extension (72℃, 5분)까지 수행하여 16S rDNA 유전자를 증폭하고 염기서열을 분석하였다(Solgent co.
대상 데이터
- 10-7, 10-8 희석액을 각각 200 μl를 취하여 Tryptic Soy Agar (TSA, Difco, USA)에 배지에 도말 후, 25℃에서 48시간 배양하여 모양과 색이 서로 다른 colony를 분리하였다[14]. 분리된 200여개의 세균 중 식물 병원균에 대하여 항균효과가 확인된 12개의 균주를 항균활성 실험에 사용하였다[8, 9, 10, 11, 13, 22].
- 어류질병세균에 대한 항균효과를 확인하기 위해 식물근권 세균을 TSA에 접종하여 25℃에서 48시간 동안 배양하였다. 한국생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)로 부터 분양 받은 그람 양성균 Streptococcus iniae (KCTC 3757), S. parauberis (KCTC 3651)와 그람 음성균 Edwardsiella tarda (KCTC 12267)는 1.5%의 NaCl이 첨가된 Brain Heart Infusion (BHIB, Difco, USA)에, 그람 음성균 Vibrio anguillarum (KCTC 2711)은 Marine Broth (MB, Difco, USA)에 접종하여 25℃에서 24시간 동안 배양하였다. 병원균 배양액은 660 nm에서 Optical Density (O.
이론/모형
- 생육저해환이 생성된 균주는 Chelex bead를 이용한 boiling 방법으로 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 genomic DNA 는 27F/1492R universal primer를 이용하여 Initial denaturation (95℃, 2분) 후, Denaturation (95℃, 30초), Annealing (55℃, 30초), Extension (72℃, 30초)으로 총 30 cycle을 반복하여 PCR을 수행하였다.
성능/효과
- 저해환이 생성된 BRH433-2, THJ609-3, TRH415-2를 배양액과 상층액, 균체 현탁액으로 나누어 항균활성을 측정한 결과는 다음과 같다(Table 2). 3종의 균주 모두 균체 현탁액에서 항균활성이 가장 높게 나타났다. 특히 BRH433-2은 23 mm (S.
- BRH433-2, THJ609-3, TRH415-2의 계통학적 분석 결과는 각각 표준 균주와의 염기서열 분석 비교를 통해 이루어졌다. BRH433-2의 염기서열 분석결과는 Burkholderia gladioli와 99.5%, B. plantarii 98.9%, B. ubonensis 98.5%, B. pyrrocinia 98.3%, B. glumae 98%로 나타났으며, 이에 대한 계통수를 작성 하였다(Fig. 4). THJ609-3은 Pseudomonas baetica와 97.
- 4). THJ609-3은 Pseudomonas baetica와 97.7%, P. moorei와 P. plecoglossicida에 대해서는 각각 97.6%, 97.5%의 상동성을 나타내었다. TRH415-2는 P.
- 1). THJ609-3은 S. iniae와 S. parauberis에 대하여 각각 24 mm, 17 mm, E. tarda에서 21 mm의생육저해환을 나타내었으며 V. anguillarum에 대해서는 항균 활성이 관찰되지 않았다(Fig. 2). 반면 THJ609-3은 그람 양성균인 S.
- 2). 반면 THJ609-3은 그람 양성균인 S. iniae, S. parauberis에 대해 각각 18 mm, 15 mm로 나타났 지만, 그람 음성균 2종에 대해서는 생육저해환이 관찰되지 않았다(Fig. 3). 세 균주 모두 상층액에서는 억제환이 생성되지 않았다.
- 또한 단백질이기 때문에 소화기관의 단백질 가수분해 효소에 의해 쉽게 분해되어 생체에 무독성이고 잔류성이 적어 천연 항생제 및 보존제로서 그 이용 가능성이 크다[20]. 본 연구에서 어류질병세균에 대해 항균 활성 효과를 나타낸 3종의 균주 모두 상층액에서는 항균효과가 관찰되지 않았다. 그러나 균체에서는 항균활성이 나타나는 것으로 보아, 본 실험균주는 항균성 2차 대사산물을 생산하지 않으며, bacteriocin을 생합성 하는 것으로 추측된다.
- 어류질병세균에 대하여 고체 배지에 배양된 식물근권세균의 균체를 이용한 항균활성 탐색결과는 다음과 같다(Table 1). 실험에 사용한 식물근권세균 12종 중, 어류질병세균에 대해 항균활성 효과가 있는 세균은 BRH433-2와 THJ609-3, TRH415-2로 나타났으며, 나머지 9종의 식물근권세균은 어류질병세균에 대한 항균활성 효과가 관찰되지 않았다.
- 3종의 균주 모두 균체 현탁액에서 항균활성이 가장 높게 나타났다. 특히 BRH433-2은 23 mm (S. iniae), 21 mm (S. parauberis), 21 mm (E. tarda), 16 mm (V. anguillarum) 로 세 균주 중 항균활성이 가장 높고, 그람 양성균과 음성균 모두에서 활성이 관찰되었기 때문에 항균범위가 넓은 것으로 나타났다(Fig. 1). THJ609-3은 S.
후속연구
- 3%의 염기서열 유사도를 나타내었다. 따라서 THJ609-3과 TRH415-2는 신속 또는 신종으로 보고될 가능성이 있다고 여겨지며, 그에 관해 표준 균주들과 비교하여 추가적인 신종 실험의 진행이 수행되어야 할 것으로 사료된다.
- 또 세 균주 모두 식물의 성장촉진 효과가 있다고 보고된 바 있다[8, 10]. 따라서 어류에 대한 충분한 안정성 실험을 거친 후, 양식 산업에 적용할 경우 질병의 제어뿐만 아니라 양식어류의 성장에 대해서도 유익한 효과를 기대할 수 있을 것이다.
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