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문제 정의
- 따라서 본 연구는 식품으로 널리 이용되고 있는 느타리버섯을 이용하여 농도를 달리한 느타리버섯 물 추출물이 마우스 비장세포에 직접 작용하여 면역세포를 증식시키는 활성이 있는지 검색하고, 동시에 사이토카인(IL-2, IFN-γ, TNF-α) 생성량을 측정하여 면역세포의 활성화에 관여함을 조사함으로써 면역증진 효과를 갖는 식품소재로서의 느타리버섯의 면역증진 식품으로서의 활용가능성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 느타리 물 추출물 0, 5, 10, 50, 100, 250, 500, 1,000 μg/mL 의 농도로 첨가하여 배양하였고, 음의 대조군(negative control)으로는 느타리 시료의 추출물 대신 배양액(10% FBS-RPMI 1640)을 첨가하고, 양의 대조군(positive control)으로는 ConA(5 μg/mL)와 LPS(15 μg/mL)를 첨가하여 배양하였다.
- 동결 건조된 시료를 증류수로 환류 냉각시키면서 80℃ 수욕상에서 3시간씩 3회 반복 추출한 후 감압 농축하여 물 추출물을 얻었다(Fig. 1). 본 연구에 사용된 동물은 7~8주령된 암컷 Balb/c mouse를 (주)대한실험동물센터로부터 공급받아 고형 사료와 물을 자유로이 공급하면서 7~8일 정도 실험동물실에서 적응시킨 후, 체중이 15 g 내외인 마우스를 실험에 사용하였다.
- 2)와 증류수에 현탁시켜 5분간 처리하여 적혈구를 제거하고, RPMI 1640 용액으로 2회 원심 세척하였다. 모아진 대식세포를 10%의 불활성화된 FBS를 함유한 RPMI 1640 용액에 분산시켜, trypan blue solution으로 염색한 후 hemocytometer를 이용하여 그 세포수를 측정하였다. 세포수를 1×106 cell/mL의 농도로 희석하여 24-well plate에 분주 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- 배양액을 분리하여 IL-2, IFN-γ, TNF-α의 분비량을 ELISA 사이토카인 kit(R&D system, NY, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 본 실험에서는 IL-2, IFNγ, TNF-α의 분비량을 측정하였고, 각 군별 양성 대조군으 로는 LPS(15 mg/mL)로 자극한 대식세포로부터 분비된 사이토카인을 측정함으로써 대식세포의 활성화에 대한 지표로 삼았다.
- 3에 나타내었다. 본 실험에서는 양의 대조군으로서 마크로파지에 LPS와 ConA를 처리하여 배양한후 상층액을 사용하였다. 마크로파지 세포에서 분비된 IFNγ 생성량은 음의 대조군에서 22.
- 3에 나타내었다. 본 실험에서는 양의 대조군으로서 마크로파지에 LPS와 ConA를 처리하여 배양한후 상층액을 사용하였다. 마크로파지 세포에서 분비된 IFNγ 생성량은 음의 대조군에서 22.
- 2에 나타내었다. 본 실험에서는 양의 대조군으로써 마크로파지에 LPS와 ConA를 처리하여 배양한 후 상층액을 사용하였다. IL-2 생성량에 있어 두 가지의 양의 대조군과 음의 대조군(0 μg/mL)을 비교하였을 때 유의적인 차이는 나타 나지 않았다.
- 실험동물실 온도는 22±2℃, 습도는 40~60%로 유지하였고, 명암주기(light and dark cycle)는 12시간 단위로 조절하였다.
- 음의 대조군은 490.81±38.68 pg/mL의 TNF-α를 생성하였고, 미토젠인 LPS(15 μg/mL)와 ConA(5 μg/mL)를 첨가한 경우에 각각 2,917.66±1,204.49, 842.70±79.90 pg/mL의 TNF-α 를 생성하여 대조군에 비해 유의적으로 높은 TNF-α를 생성하였다(p<0.05).
- 2)와 증류수에 현탁시켜 5분간 처리하여 적혈구를 제거하였다. 적혈구가 제거된 비장세포는 다시 RPMI medium 1640 용액에 분산시켜, trypan blue solution으로 염색한 후 hemocytometer를 이용하여그 세포수를 측정하였다. 세포농도 5.
대상 데이터
- 마우스는 경추 탈골법에 의해 희생시킨 후 복부의 표피를 절개하여 벗긴 다음, RPMI 1640 용액으로 복강을 가볍게 마사지한 후 세척액을 취하여 멸균 시험관에 수집하였다. 수집된 세척액을 4℃, 3,000 rpm에서 10분간 원심 침전시켜 cell pellet을 얻었다.
- 1). 본 연구에 사용된 동물은 7~8주령된 암컷 Balb/c mouse를 (주)대한실험동물센터로부터 공급받아 고형 사료와 물을 자유로이 공급하면서 7~8일 정도 실험동물실에서 적응시킨 후, 체중이 15 g 내외인 마우스를 실험에 사용하였다. 실험동물실 온도는 22±2℃, 습도는 40~60%로 유지하였고, 명암주기(light and dark cycle)는 12시간 단위로 조절하였다.
데이터처리
- 모든 연구 결과의 자료는 통계 프로그램인 SAS package (ver. 12.0)를 이용하여 평균 및 표준편차를 계산하였으며, 군간의 비교에서 각각의 요인은 분산분석(Analysis of Variance, ANOVA)을 사용하였고, Duncan's multiple range test로 p=0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- IFN-γ, TNF-α 사이토카인 모두 50, 100, 250, 500 μg/mL의 농도에서 높은 생성량을 나타내었다.
- In vitro 실험을 통한 느타리버섯 물 추출물 첨가가 마우스의 면역세포 증식에 미치는 영향에 대한 연구 결과, 음의 대조군에 비해 느타리 물 추출물을 첨가한 모든 농도에서 비장 세포 증식능이 증가하였으며, 특히 100~1,000 μg/mL 농도에서 유의적으로 증가하였다.
- 그러나 모든 느타리버섯 물 추출물은 양의 대조군인 LPS를 첨가에 의한 TNF-α 생성량보다 유의적으로 낮은 수치를 나타내었다.
- 그러나 모든 느타리버섯 물 추출물은 양의 대조군인 LPS를 첨가에 의한 TNF-α 생성량보다 유의적으로 낮은 수치를 나타내었다. 그러므로 본 연구에서 처리한 느타리버섯 물 추출물의 농도는 과도한 염증반응을 유도하는 것이 아닌 것으로 사료된다. 따라서 느타리버섯 물 추출물은 면역세포에 하나인 마크로파지를 활성화시켜 염증반응을 유도하는 것으로 사료된다.
- 느타리버섯 물 추출물 1,000 μg/mL 농도를 제외한 나머지 첨가농도는 음의 대조군보다 유의적으로 높은 IFN-γ 생성량을 나타났다.
- 느타리버섯 물 추출물 250, 500, 1,000 μg/mL 농도를 첨가한 경우 각각 1,514.86±286.15, 1,888.24±458.90, 1,834.03± 486.20 pg/mL로 음의 대조군보다 유의적으로 높은 TNF-α 생성량을 보였다(p<0.05).
- 느타리버섯 물 추출물 50 μg/mL 첨가농도에서 18.92±4.30 pg/mL로 양의 대조군과 느티리버섯 물 추출물 첨가농도에 비해 가장 높은 수치를 나타내었다.
- 느타리버섯 추출물과 양의 대조군을 비교하였을 때, 통계적인 차이는 나타나지 않았지만, 느타리버섯 추출물 50 μg/mL, 농도는 10 μg/mL, 농도보다는 유의적으로 높은 IL-2 생성량을 보였다.
- 또한 느타리버섯 물 추출물 5~500 μg/mL 첨가농도는 음의 대조군보다는 유의적인 차이를 나타냈다.
- 마크로파지 세포에서 분비된 IFNγ 생성량은 음의 대조군에서 22.44±5.28 pg/mL, 양의 대조군 LPS와 ConA에서는 각각 395.24±12.70, 228.72±15.16 pg/mL로유의적으로 양의 대조군에서 높은 IFN-γ 생성량이 나타났다.
- 반면, 사이토카인 생성의 경우, IL-2, IFN-γ, TNF-α 사이토카인 생성량을 측정한 결과, 느타리버섯 물 추출물 50~500 μg/mL 농도에서 생성된 IL-2, IFN-γ, TNF-α 사이토카인은 대조군보다 높은 생성량을 보였다.
- 음의 대조군에 비해 느타리 물 추출물을 첨가한 모든 농도에서 비장세포 증식능이 증가하였으며, 특히 100~ 1,000 μg/mL 농도에서 유의적으로 증가하였다.
- 이상의 본 연구결과를 종합해 보면 느타리버섯 물 추출물을 첨가한 50~500 μg/mL 농도 모두에서 유의적으로 높은 생성량을 나타내었고, 반면, IL-2 사이토카인의 경우, 50~1,000 μg/mL에서 IL-2 사이토카인 생성량이 증가하는 경향이 나타났지만, 통계적 유의성은 나타나지 않았다.
후속연구
- 한편, 생강 물 추출물과 율무 물 추출물 각각 10 μg/mL 농도에서 TNF-α 생성이 대조군에 비해 유의적으로 높게 나타난 연구결과가 있다(Ryu 등 2005; Lee 등 2001). 따라서 느타리버섯 물 추출물이 외부의 항원에 민감하게 대응하여 면역세포를 활발하게 분비할 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- IL-2의 경우, 생성량이 유의적인 차이는 보이지 않았지만, 50 μg/mL 이상에서 증가하는 경향을 보여주었다. 이상의 결과에 의하면 느타리버섯 물 추출물은 마우스 비장 세포를 증식시키고, 사이토카인 생성량에도 영향을 주어, 면역 기관의 주요 기능을 증진시킬 가능성이 있을 것으로 사료되며, 느타리버섯이 면역 증진 기능성 식품 개발의 소재로 활용될 가능성이 있을 것으로 기대된다.
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