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문제 정의
- 또한 이전의 발효 천마에 대한 연구들은 천마를 1차 발효시켰을 때 항산화 및 항암 활성(Heo 등 2006; Park 등 2012)과 품질특성(Kim 등 2010)을 평가하였다. 따라서 본 연구에서는 식품 발효에 널리 사용되어온 상황버섯균사체(Phellinus linteus)를 이용하여 천마 분말을 1차 발효한 다음, 동일한 발효공정을 2회 반복 실시하여 3차 발효물을 생산하여 발효 횟수에 따른 기능성 물질 함량의 변화와 항산화 활성을 분석하여 기능성 식품 소재화 연구의 기초자료로 활용하고자 하였다. 또한 다중 발효 천마 분말의 생리활성을 살펴본 선행연구에서 1차 발효물과 2차 발효물의 유효물질 함량과 항산화 활성이 유의한 차이가 없어 본 연구에서는 1차 발효물과 3차 발효물의 생리활성을 분석하였다.
- 본 연구는 Phellinus linteus를 이용하여 천마를 발효시켜 발효 횟수에 따른 기능성 물질 함량의 변화와 항산화 활성을 분석하였다. 비발효 천마 추출물과 발효 천마 추출물의 항산화 활성을 평가하기 위해 DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼 소거능을 비교하였다.
제안 방법
- 0.1 M sodium acetate buffer(pH 5.5)를 이용하여 각 농도별로 희석한 시료 40 μL에 ABTS 용액 4 mL를 혼합하여 1분간 반응시킨 후 413 nm에서 흡광도를 측정하여 다음과 같은 식에 의해 저해율을 산출하였으며, 자유라디칼의 활성을 50%로 저해하는데 필요한 농도인 IC50 값을 구하였다.
- 그 후 반응액을 2,038×g에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 0.22 μm filter로 여과한 다음 HPLC로 분석하였다.
- 선행연구에서 균주별로 배지 종류, 천마 분말 함량, 배양 온도 및 시간에 따른 진균 생육 상태를 탐색한 결과, 상황버섯(Phellinus linteus KCTC 6190)을 15%의 천마 분말을 함유한 potato dextrose agar(PDA) 배지에서 25℃, 4~7일간 배양하였을 때 균사의 생장이 가장 활발한 것으로 나타났다. 따라서, 본 연구에서는 발효균주인 Phellinus linteus를 PDA 배지에 접종하여 25℃의 배양기에서 7일 동안 배양한 후 cork borer로 절취하여 증류수 1 L에 글루코오즈 20 g, sugar 10 g을 포함하는 균사체 배양배지에 5~10%(v/w) 접종하여 25~30℃에서 4~7일간 배양하였다. 이 후 배양균주를 분쇄기로 균질화하여 배양배지 200 L가 들어있는 액체배양기에 1 L를 접종하여 25℃에서 4~7일간 배양하여 종균으로 사용하였다.
- 따라서 본 연구에서는 식품 발효에 널리 사용되어온 상황버섯균사체(Phellinus linteus)를 이용하여 천마 분말을 1차 발효한 다음, 동일한 발효공정을 2회 반복 실시하여 3차 발효물을 생산하여 발효 횟수에 따른 기능성 물질 함량의 변화와 항산화 활성을 분석하여 기능성 식품 소재화 연구의 기초자료로 활용하고자 하였다. 또한 다중 발효 천마 분말의 생리활성을 살펴본 선행연구에서 1차 발효물과 2차 발효물의 유효물질 함량과 항산화 활성이 유의한 차이가 없어 본 연구에서는 1차 발효물과 3차 발효물의 생리활성을 분석하였다.
- 대조군으로는 합성항산화제인 BHA를 사용하였으며, 시료의 전자공여능은 아래와 같은 식에 산출하였다. 또한 시료농도와 저해능(inhibition) 사이의 관계식을 구하여 자유라디칼의 활성을 50%로 저해하는데 필요한 농도인 IC50 값을 구하였다.
- 멸균 처리한 천마 분말을 배양액에 수분율이 15~30% 되도록 혼합한 후, 25℃, 습도 65~80%에서 7일간 발효하였다. 1차 발효 후 발효 분말의 수분율이 7% 이하가 되도록 70℃에서 8~12시간 열풍건조하여 121℃에서 15분 간 멸균하였다.
- 1차 발효 후 발효 분말의 수분율이 7% 이하가 되도록 70℃에서 8~12시간 열풍건조하여 121℃에서 15분 간 멸균하였다. 멸균처리한 1차 발효 천마 분말은 동일한 발효조건으로 2회 반복 발효한 후 121℃에서 15분간 멸균하여 미생물과 효소를 불활성화하고 동결건조하였다.
- 본 연구는 Phellinus linteus를 이용하여 천마를 발효시켜 발효 횟수에 따른 기능성 물질 함량의 변화와 항산화 활성을 분석하였다. 비발효 천마 추출물과 발효 천마 추출물의 항산화 활성을 평가하기 위해 DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼 소거능을 비교하였다. 모든 추출물에서 농도 의존적으로 라디칼 소거능이 증가하였으나, 500 ppm과 1,000 ppm의 농도 범위에서 비발효와 1차 발효 천마 추출물에 비해 3차 발효 천마 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하였다.
- 혼합액에 2 mL의 1% ethanolic solution을 첨가하고, 1분 동안 상온에서 반응시킨 후 2,038×g에서 20분 동안 원심분리하였다. 상등액 3 mL를 농축하여 50 mM sodium phosphate와 3% acetonitrile에 녹여서 HPLC로 분석하였다. 표준용액은 ergothioneine(SigmaAldrich Co.
- 천마 분말과 1차 및 3차 발효 천마 분말의 에탄올 추출물은 시료 80 g에 70% 에탄올 800 mL를 가하여 실온에서 24시간 동안 추출하였다. 이를 2,515×g에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 수집한 후 여과지(Whatman No.
- 반응물에 7% Na2CO3 10 mL를 첨가하고, 증류수로 최종 부피를 25 mL로 맞추어 상온에서 2시간 방치한 후 UV/Visible spectrometer를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid(Sigma- Aldrich Co., LLC, USA)를 사용하여 표준 검량선을 구하고, 시료추출물의 총 폴리페놀 함량을 산출하였다.
- 반응 후 반응액의 흡광도 값을 510 nm에서 측정하였다. 표준물질로는 quercetin(SigmaAldrich Co., LLC, USA)를 사용하였으며, 표준 검량선 구한 후 시료 추출물의 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.
- 표준용액은 ergothioneine(SigmaAldrich Co., LLC, USA)를 증류수에 용해시켜 6, 12, 25, 50 ng/μL의 농도로 희석하여 사용하였다.
- 표준용액은 gastrodin(Tauto Biotech, China)과 vanillyl alcohol (TCI laboratories, USA)을 증류수에 각각 30, 60, 125, 250 ng/μL의 농도로 희석하여 사용하였다.
대상 데이터
- HPLC column은 Luna C18 (250×21.2 mm, 5 M)을 사용하였고, 이동상은 0.5% formic acid water와 0.5% formic acid methanol을 이용하였다.
- , Korea)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 합성항산화제인 BHA를 사용하였으며, 시료의 전자공여능은 아래와 같은 식에 산출하였다. 또한 시료농도와 저해능(inhibition) 사이의 관계식을 구하여 자유라디칼의 활성을 50%로 저해하는데 필요한 농도인 IC50 값을 구하였다.
- 본 연구에 사용한 천마는 2012년 무주 안성 천마 영농조합 법인에서 재배 수확한 건조 천마(Gastrodia elata Blume) 슬라이스를 구입하여 이용하였다. 천마 분말은 건조 천마 슬라이스를 증류수로 세척하여 이물질을 제거하고, 70℃ 열풍건조기로 수분율이 7%가 되도록 건조한 후, 분쇄기를 이용하여 80~100 mesh 정도의 입자 크기로 분쇄한 다음 실험재료로 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 천마는 2012년 무주 안성 천마 영농조합 법인에서 재배 수확한 건조 천마(Gastrodia elata Blume) 슬라이스를 구입하여 이용하였다. 천마 분말은 건조 천마 슬라이스를 증류수로 세척하여 이물질을 제거하고, 70℃ 열풍건조기로 수분율이 7%가 되도록 건조한 후, 분쇄기를 이용하여 80~100 mesh 정도의 입자 크기로 분쇄한 다음 실험재료로 사용하였다.
데이터처리
- 5) Mean with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.
- Mean with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.
- 그룹간의 유의성을 분석하기 위해 일원분산분석(one-way ANOVA)을 실시한 다음 Duncan’s multiple range test로 p<0.05 수준에서 사후검정하였다.
- 모든 결과는 Statistical Package for the Social Science Program (SPSS, version 21)을 사용하여 산출하였다. 모든 측정값은 3회 반복 측정하여 평균±표준편차로 나타내었다.
- 모든 측정값은 3회 반복 측정하여 평균±표준편차로 나타내었다.
- 모든 측정값은 3회 반복 측정하여 평균±표준편차로 나타내었다. 시료의 에르고티오닌 함량과 ABTS 라디칼 소거능 사이의 상관성을 보고자 단일회귀분석을 수행하였다. 그룹간의 유의성을 분석하기 위해 일원분산분석(one-way ANOVA)을 실시한 다음 Duncan’s multiple range test로 p<0.
이론/모형
- 2. The electron donating ability of ethanol extract from non-fermented and fermented Gastrodia elata Blume powder using the ABTS assay. NFGP: Non-fermented Gastrodia elata Blume powder, 1st FGP: Once fermented Gastrodia elata Blume powder, 3rd FGP: Fermented Gastrodia elata Blume powder repeated thrice.
- 1. The electron donating ability of ethanol extract from non-fermented and fermented Gastrodia elata Blume powder using the DPPH assay. NFGP: Non-fermented Gastrodia elata Blume powder.
- 시료에 함유된 ergothioneine 함량은 Lee 등(2009)의 방법에 따라 분석하였다. 시료 0.
- 시료의 ABTS 라디칼 소거능의 측정은 Re 등(1999)의 방법에 의해 측정하였다. 7 mM 2,2-azinobis(3-ethylbenzothiazoline6-sulfonic acid)(ABTS, Sigma-Aldrich Co.
- 시료의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 법에 의해 측정 하였다(Pellegrini 등 1999). 시료 1 mL에 증류수 5 mL, FolinCiocalteu reagent(Sigma-Aldrich Co.
- 천마 분말과 1차 및 3차 발효 천마 분말의 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 Blois MS(1958)의 방법에 의해 측정하였다. 우선 시료를 0.
- 천마에 함유된 유효성분인 gastrodin과 vanillyl alcohol 함량은 Ong 등(2007)의 방법에 의해 분석하였다. 즉, 시료 50 mg에 50% methanol 2.
- 플라보노이드 함량은 Moreno 등(2000)의 방법에 따라 측정하였다. 10% aluminum nitrite 100 μL와 1 M potassium acetate 100 μL, 80% 에탄올 4.
성능/효과
- 비교적 저농도인 125 ppm과 250 ppm에서는 비발효 천마와 1차 및 3차 발효 천마의 라디칼 소거능에 유의한 차이가 없었다. 그러나 추출물의 농도 500 ppm, 1,000 ppm의 범위에서는 비발효 천마 추출물이 27.21%, 55.79%, 1차 발효 천마 추출물이 23.83%, 53.72%의 소거율을 나타내어 1차 발효에 의한 활성의 증가는 없었으나, 3차 발효 천마 추출물은 36.58%, 70.07%의 소거율을 나타내어 1차 발효에 비해 항산화 활성이 유의적으로 증가하였다. 또한 3차 발효 천마 추출물은 1,000 ppm의 농도에서 합성항산화제인 BHA와 유사하게 높은 항산화 활성을 나타내었다.
- 이는 버섯의 기능성 물질과 항산화 활성을 살펴 본 이전의 연구들(Dubost 등 2006; Lee 등 2009)에서 버섯의 항산화 활성이 ergothioneine이 아니라, 페놀성 화합물과 상관관계가 있다고 보고한 것과 유사한 결과이다. 따라서 본 연구에서 천마 발효 횟수의 증가에 따른 라디칼 소거능의 증가는 gastrodin, vanillyl alcohol 및 ergothioneine의 영향보다는 정량 되지 않은 다른 물질들을 포함한 페놀성 물질들의 총체적인 기여효과로 보인다.
- 천마에 함유된 대표적인 기능성 성분인 ergothioneine 함량이 발효 전에 비해 1차 발효 후에 약 8배, 3차 발효 시 5배 증가하였다. 따라서, 천마를 발효함에 따라 기능성 물질의 함량이 증가하고, 우수한 항산화 활성을 가지는 것으로 나타나, 천연항산화제 및 기능성 식품 신소재로서의 발효 천마의 이용 가능성을 확인하였다. 또한, 본 연구 결과를 기초로 하여 3차 다중 발효공정에서 천마 분말의 적정 첨가농도 및 발효균주의 생장량과 기능성 물질 함량과의 관계에 대한 연구가 이루어져 다중 발효에 대한 효과가 확인이 된다면 기능성 식품으로서 천마의 부가가치를 증대시킬 수 있을 것으로 사료된다.
- 07%의 소거율을 나타내어 1차 발효에 비해 항산화 활성이 유의적으로 증가하였다. 또한 3차 발효 천마 추출물은 1,000 ppm의 농도에서 합성항산화제인 BHA와 유사하게 높은 항산화 활성을 나타내었다. 에탄올 추출물의 IC50값은 비발효 천마가 101.
- 모든 추출물에서 농도 의존적으로 라디칼 소거능이 증가하였으나, 500 ppm과 1,000 ppm의 농도 범위에서 비발효와 1차 발효 천마 추출물에 비해 3차 발효 천마 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하였다. 또한 3차 발효 천마 추출물의 ABTS 라디칼 제거 능력도 발효 전과 1차 발효 추출물에 비해 높은 것으로 나타났다. 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 발효 횟수에 따라 증가하여 이들 항산화 물질이 3차 발효 천마 추출물의 항산화 효과에 영향을 미치는 것으로 보인다.
- 발효 전에 비해 발효 후에 ergothioneine 함량이 증가하였으나, 다중 발효 시 1차 발효에 비해 수치가 감소하는 것으로 나타났다. 또한 IC50 수치로 나타낸 ABTS 라디칼 소거능과 ergothioneine 함량과의 상관성을 살펴보았을 때 유의적인 상관관계를 보이지 않았다(Fig. 4). 이는 버섯의 기능성 물질과 항산화 활성을 살펴 본 이전의 연구들(Dubost 등 2006; Lee 등 2009)에서 버섯의 항산화 활성이 ergothioneine이 아니라, 페놀성 화합물과 상관관계가 있다고 보고한 것과 유사한 결과이다.
- 4 mg GAE/g으로 나타나, 발효 후에 천마의 총 폴리페놀 함량이 증가하였다. 또한 발효 횟수가 증가할수록 총 폴리페놀 함량이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다. 본 연구의 발효 천마 추출물의 폴리페놀 함량은 가시오가피 상황버섯 발효 에탄올 추출물(29.
- 비발효 천마 추출물과 발효 천마 추출물의 항산화 활성을 평가하기 위해 DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼 소거능을 비교하였다. 모든 추출물에서 농도 의존적으로 라디칼 소거능이 증가하였으나, 500 ppm과 1,000 ppm의 농도 범위에서 비발효와 1차 발효 천마 추출물에 비해 3차 발효 천마 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하였다. 또한 3차 발효 천마 추출물의 ABTS 라디칼 제거 능력도 발효 전과 1차 발효 추출물에 비해 높은 것으로 나타났다.
- 3 μg/g DW가 함유되어 있었다. 발효 전에 비해 발효 후에 ergothioneine 함량이 증가하였으나, 다중 발효 시 1차 발효에 비해 수치가 감소하는 것으로 나타났다. 또한 IC50 수치로 나타낸 ABTS 라디칼 소거능과 ergothioneine 함량과의 상관성을 살펴보았을 때 유의적인 상관관계를 보이지 않았다(Fig.
- Vanillyl alcohol의 경우에는 항염증 및 혈관 생성 억제 기능이 있으며, 간질과 폐암 등에 효과가 큰 것으로 보고되고 있다(Liu 등 2002). 본 연구에서 발효가 진행됨에 따라 gastrodin과 vanillyl alcohol의 함량은 유의하게 감소하는 것으로 나타났다.
- 식물 중에 함유된 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 항산화 활성과 유의적인 상관관계가 있어 항산화 활성을 측정하는데 중요한 척도로 사용되며, 당뇨병, 고혈압, 심장질환 및 암에 효과가 있는 것으로 보고되었다(Kim 등 2004). 본 연구에서도 발효가 진행 됨에 따라 폴리페놀과 폴라보노이드 함량이 증가하였고, 이에 비례해서 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성이 높아지는 것을 볼 때 다중 발효에 의해 증대된 플라보노이드와 여러 페놀성 화합물들이 발효 천마의 항산화 활성 증가에 기여하는 것으로 보인다. 발효에 의해 항산화 활성이 증가하는 기전으로 Park 등(2012)은 발효 중에 분비된 protease, amylase, lipase 등의 효소가 페놀성 물질들을 증가시킨 것으로 설명하고 있다.
- 본 연구의 1차 발효 천마 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 효모균을 이용하여 천마를 발효시킨 Park 등(2012)의 연구에서 보고된 발효 천마 추출물에 비해 높은 활성을 나타내었다. 이전의 연구들(Jeng 등 1994; Park 등 2012)에서는 DPPH와 ABTS가 소거하는 라디칼의 종류가 다르고, 기질과 반응물의 결합 정도에 차이가 있어 라디칼 제거능력에도 차이가 있다고 보고하였으나, 본 연구의 발효 천마 추출물은 DPPH 라디칼 소거 활성과 ABTS 라디칼 제거 능력이 유사한 것으로 나타났다.
- 비발효 및 발효 천마 추출물의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 측정한 결과는 Table 1에 나타내었다. 비발효 천마 추출물의 총 폴리페놀 함량은 95.8 mg GAE/g이었으며, 1차 발효 추출물은 143.5 mg GAE/g, 3차 발효 추출물은 338.4 mg GAE/g으로 나타나, 발효 후에 천마의 총 폴리페놀 함량이 증가하였다. 또한 발효 횟수가 증가할수록 총 폴리페놀 함량이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다.
- 1과 같다. 비발효 천마와 발효 천마 모두 추출물의 농도가 증가함에 따라 DPPH 라디칼에 대한 전자공여능 효과가 증가하였다. 비교적 저농도인 125 ppm과 250 ppm에서는 비발효 천마와 1차 및 3차 발효 천마의 라디칼 소거능에 유의한 차이가 없었다.
- 58%)에서 활성이 증가하였다. 시료 에탄올 추출물의 IC50 값은 비 발효 천마가 14.8 ppm이었으며, 1차 발효 천마는 18.6 ppm, 3차 발효 천마는 16.8 ppm으로 비발효 천마에 비해 1차 발효 시에는 오히려 증가하였으나, 3차 발효 시 감소하는 것으로 나타났다.
- 시료의 에탄올 추출물의 수율은 비발효 천마, 1차 및 3차 발효 천마 추출물이 각각 16.3, 13.6, 10.9%로 나타나, 발효 횟수에 따라 추출수율은 감소하였다.
- 또한 3차 발효 천마 추출물은 1,000 ppm의 농도에서 합성항산화제인 BHA와 유사하게 높은 항산화 활성을 나타내었다. 에탄올 추출물의 IC50값은 비발효 천마가 101.3 ppm 이었으며, 1차 발효 천마는 62.2 ppm, 3차 발효 천마는 61.3 ppm으로 발효가 진행됨에 따라 낮아져 항산화 활성이 증가하는 것으로 나타났다. 또한 1차 발효 및 3차 발효 천마 추출물의 경우, 합성항산화제인 BHA의 IC50 값(74.
- 2에 제시하였다. 추출물의 농도에 따라 발효 전과 1차 및 3차 발효 후의 활성을 비교한 결과, 대조군으로 사용된 합성항산화제 BHA에 의해 전반적으로 낮게 나타났으나, 31.25 ppm의 농도에서는 비발효 천마(68.6%)와 1차 발효 천마 추출물(66.06%)에 비해 3차 발효 추출물(71.58%)에서 활성이 증가하였다. 시료 에탄올 추출물의 IC50 값은 비 발효 천마가 14.
- 플라보노이드 함량은 비발효, 1차 및 3차 발효 천마 에탄올 추출물이 각각 147.7, 925.0, 1,993.0 mg QCE/g으로 발효 횟수 증가에 따라 유의적으로 높게 나타났다. 천마와 발효 천마 추출물은 인진쑥 에탄올 추출물, 토사자 에탄올 추출물, 둥글레 및 하수오 열수 추출물 등 다른 약용식물에 비해 더 많은 플라보노이드를 함유하는 것으로 나타났다(Jeon 등 2008; Kim 등 2012).
후속연구
- 또한 천마의 ergothioneine은 버섯의 스트레스 반응 기작과 관련된 물질로 알려져 있어(Kim & Park 2013) 상황버섯 균주의 생장량과 상관이 있을 것으로 유추되므로, 추후 상황버섯균주의 생장량에 따른 기능성 물질 함량 분석에 대한 연구가 이루어져야 할 것이다.
- 따라서, 천마를 발효함에 따라 기능성 물질의 함량이 증가하고, 우수한 항산화 활성을 가지는 것으로 나타나, 천연항산화제 및 기능성 식품 신소재로서의 발효 천마의 이용 가능성을 확인하였다. 또한, 본 연구 결과를 기초로 하여 3차 다중 발효공정에서 천마 분말의 적정 첨가농도 및 발효균주의 생장량과 기능성 물질 함량과의 관계에 대한 연구가 이루어져 다중 발효에 대한 효과가 확인이 된다면 기능성 식품으로서 천마의 부가가치를 증대시킬 수 있을 것으로 사료된다.
- 발효 단계에서 ergothioneine의 생합성은 배지에 포함되어 있는 천마 성분에 의해 활성화 되는 것으로 보인다. 본 연구에서는 3차 발효 시에 1차 발효 천마 분말에 균사체를 접종하여 동일한 과정을 반복하였으므로, 각 발효 단계마다 천마 분말을 포함시키고, 기능성 물질 함량 증진에 대한 천마 분말의 적정 농도를 결정하는 연구가 필요할 것으로 보인다. 또한 천마의 ergothioneine은 버섯의 스트레스 반응 기작과 관련된 물질로 알려져 있어(Kim & Park 2013) 상황버섯 균주의 생장량과 상관이 있을 것으로 유추되므로, 추후 상황버섯균주의 생장량에 따른 기능성 물질 함량 분석에 대한 연구가 이루어져야 할 것이다.
- 그러나 Kim 등(2010)은 일반천마와 발효 천마의 전자공여능을 측정한 결과, 비타민 C는 90%, 일반천마는 91%, 발효 천마는 92%로 발효 후에도 항산화 활성이 유지된다고 보고하여 본 연구결과와 유사하였다. 이상과 같이 본 연구에서는 발효 횟수가 증가함에 따라 천마의 항산화 활성이 증대 되는 것으로 나타나, 천마를 이용한 기능성 식품을 제조할 경우, 다중 발효에 의한 생리활성 증대 효과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
- 발효에 의해 항산화 활성이 증가하는 기전으로 Park 등(2012)은 발효 중에 분비된 protease, amylase, lipase 등의 효소가 페놀성 물질들을 증가시킨 것으로 설명하고 있다. 향후 연구에서는 발효에 의해 천마의 기능성 성분 및 생리활성이 증가하는 가능한 기전에 대한 연구가 이루어져야 할 것이다.
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