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문제 정의
- 따라서 본 연구는 기존 연구[6, 10, 18, 20]에서 항비만에 효과가 있는 것으로 밝혀진 감귤박의 생리 활성 물질의 증대를 위하여 A. oryzae를 이용하여 생물전환시키고, 전환물의 항비만 0효과를 고지방식으로 유도된 생쥐모델에서 확인하였다.
- 본 연구에서는 ICR 생쥐에서의 감귤박과 생균제인 A. oryzae를 이용하여 생물전환시킨 감귤박의 항비만 효과를 비교하였다. 생쥐의 체중변화, 조직의 무게를 관찰하였고, 군별 혈청 지질 농도(total cholesterol, triglyceride, HDL- cholesterol)의 변화, 간 지질 농도(total cholesterol, triglyceride, HDLcholesterol)의 변화를 비교하였다.
제안 방법
- 4주간 사육한 생쥐는 희생시키기 전, 16시간 동안 절식시킨 후 ether (Junsei, Japan)로 마취하여 심장으로부터 혈액을 채취하였다. 실험군 별로 채취된 혈액은 상온에서 30분간 방치 후 4℃, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다.
- 각 군별 혈청을 대상으로 triglyceride (TG), total cholesterol (TC), high-density lipoprotein- cholesterol (HDL-C) 함량을 혈청 생화학적 측정기계(DRI-CHEM 3500i, FUJI Film, Japan) 로 측정하였다. 그 결과, 혈청 지질농도는 Fig.
- 간 조직의 TG, TC 및 HDL-C 농도를 측정하기 위해 Folch 등의 방법을 수정, 보완하여 지질 성분을 추출한 후 분석하였다[9]. Chloroform : methanol (2:1, v/v) 용액과 증류수를 3 : 1로 섞은 용액에 간 조직을 넣은 후 homogenizer (Heidolph DIAX900)를 사용하여 균질화시켰다.
- 감귤박과 A. oryze를 이용하여 발효한 감귤박을 ethyl acetate로 추출한 후 HPLC 분석을 통하여 비교하였다(Fig. 1). A.
- 6 g 이었다. 고지방식이를 투여하여 비만을 유도하고 한편으로는 6주간 감귤박을 투여한 후 측정한 체중의 변화는 Fig. 2A에 나타난 것과 같았다. 실험 종료 시 체중의 경우, NFD군은 28.
- oryzae를 10% (v/v) 접종하여 30℃에서 일주일간 배양한 후 75% (v/v) 메탄올로 추출하여 사용하였다. 모든 추출물은 filter paper (Quantitative Filter Paper, Korea)로 여과하여 evaporator (EYELA, Japan)로 농축 후, 10 mg/ml로 정량하여 동물실험하였다.
- 사육실 온도는 22±2℃, 습도 55±10%로 유지하였고, 명암은 12시간 간격으로 조절하였고, 물과 식이는 제한 없이 공급하였다.
- oryzae를 이용하여 생물전환시킨 감귤박의 항비만 효과를 비교하였다. 생쥐의 체중변화, 조직의 무게를 관찰하였고, 군별 혈청 지질 농도(total cholesterol, triglyceride, HDL- cholesterol)의 변화, 간 지질 농도(total cholesterol, triglyceride, HDLcholesterol)의 변화를 비교하였다.
- 시료는 10 μl씩 주입하였으며, 고정상은 Supelcosil TMLCPAH column (4.6×150, 5 μm)을 사용하였고, 이동상은 0.1% acetic acid (A)와 acetonitrile (C)을 사용하여 20-30% C (0-10 min), 30% (10-35 min)로 농도구배를 주면서 0.5 ml/min 의 속도로 흘렸다.
- oryzae, CPA) 등 4군으로 나누었다. 시료를 투여하는 CP군과 CPA군은 고지방식이를 섭취시킴과 동시에 48시간간격으로 추출물을 34.5 mg/kg, 총 20번 복강 투여하였고, 일반 식이섭취군과 고지방식이 섭취군에는 시료 투여군과 동일한 횟수로 saline을 복강주사하였으며, 실험기간 동안 이틀에 한번 체중을 측정하였다. 사육실 온도는 22±2℃, 습도 55±10%로 유지하였고, 명암은 12시간 간격으로 조절하였고, 물과 식이는 제한 없이 공급하였다.
- 일반식이와 고지방식이는 (주)중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 실험군은 일반식이섭취군(normal fat diet group, NFD), 고지방식이 섭취군(high fat diet group, HFD), 감귤박 추출물 투여군(high fat diet with citrus peel extract group, CP), A. oryzae로 발효한 감귤박 추출물 투여군(high fat diet with citrus peel extract fermented with A. oryzae, CPA) 등 4군으로 나누었다. 시료를 투여하는 CP군과 CPA군은 고지방식이를 섭취시킴과 동시에 48시간간격으로 추출물을 34.
- Chloroform : methanol (2:1, v/v) 용액과 증류수를 3 : 1로 섞은 용액에 간 조직을 넣은 후 homogenizer (Heidolph DIAX900)를 사용하여 균질화시켰다. 이 균질 액을 13,000rpm, 4℃, 10분간 원심분리하여 아래층인 chloroform 층을 지질분석에 사용하였다. TG 측정은 chloroform 층 10 μl를 1.
- 일반식이로 1주일간 적응시킨 후, 무작위로 일반식이 투여군(NFD), 고지방식이 투여군(HFD), 감귤박 추출물 투여군(CP), 감귤박 발효 추출물 투여군(CPA) 4군으로 나누었으며 실험 시작 시 체중은 평균 18±0.6 g 이었다.
- 혈청은 -70℃에 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다. 채혈한 후 간, 비장, 신장, 복부 내장 지방 등의 장기를 즉시 적출하여 phosphate-buffered saline (PBS)에 헹군 후 여과지를 이용하여 표면의 물기를 제거하고 무게를 측정하였다. 간은 지질측정을 위해서 무게 측정 후 즉시 PBS에 담아 사용하였다.
- 체중 증가량은 [마지막 체중–처음 체중]으로 계산하였고, 체중 증체율은 {[(마지막 체중–처음 체중) / 처음체중] ×100}으로 계산하였다.
- 체중은 2일 간격으로 측정하였고, 분리한 장기들도 미세저울을 이용하여 무게를 측정하였다. 체중 증가량은 [마지막 체중–처음 체중]으로 계산하였고, 체중 증체율은 {[(마지막 체중–처음 체중) / 처음체중] ×100}으로 계산하였다.
- 혈청 내 지질 농도를 알아보기 위해 혈청 중성지질(triglyceride, TG), 총 콜레스테롤(total cholesterol, TC) 및 고밀도 지단백 콜레스테롤(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C) 농도는 혈청 생화학적 측정기계(DRI-CHEM 3500i, FUJI Film, Japan)를 이용하여 비색측정하였다. 한편, TG, TC, HDL-C 수치를 이용하여 Lauer 등 [15]의 방법에 따라 HDL-C / TC 비 (HDL-C / TC ratio, HTR) 및 동맥경화지수(atherogenic index, AI)를 계산하였다
대상 데이터
- 5 ml/min 의 속도로 흘렸다. Detector는 SPD-M10A diode array detector(Shimadzu, Japan)을 이용하여 280 nm에서 측정하였다.
- 감귤박 시료는 ㈜일해(Jeju, Korea)에서 제공한 감귤박을 사용하였고, 감귤박 추출물을 만들기 위하여 10 μg의 감귤박을 함유한 감귤박 현탁액 100 ml를 75% (v/v) 메탄올로 추출하여 제조하였다.
- 본 실험에서는 평균체중 18.3±1.3 g인 4주령 ICR 암컷 생쥐를 구입하여 일반식이로 1주일간 적응시킨 후에, 일반식이군과 고지방식이 군으로 나누어 한 그룹 당 4마리로 나누었다(Table 1).
- 3 g인 4주령 ICR 암컷 생쥐를 구입하여 일반식이로 1주일간 적응시킨 후에, 일반식이군과 고지방식이 군으로 나누어 한 그룹 당 4마리로 나누었다(Table 1). 일반식이와 고지방식이는 (주)중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 실험군은 일반식이섭취군(normal fat diet group, NFD), 고지방식이 섭취군(high fat diet group, HFD), 감귤박 추출물 투여군(high fat diet with citrus peel extract group, CP), A.
데이터처리
- 모든 실험의 결과는 3번 반복 수행하여 얻어진 것으로, 통계분석은 ANOVA에 의해 분석하여 mean ± S.D로 표시하였고, 통계적 유의성은 p≤0.05로 판정하였다.
이론/모형
- 전환된 배양물질을 확인하기 위하여 high performance liquid chromatography (HPLC) 분석법을 이용하였으며, 각 감귤박 메탄올 추출물을 ethyl acetate 추출하여 분석하였다. 시료는 10 μl씩 주입하였으며, 고정상은 Supelcosil TMLCPAH column (4.
- 혈청 내 지질 농도를 알아보기 위해 혈청 중성지질(triglyceride, TG), 총 콜레스테롤(total cholesterol, TC) 및 고밀도 지단백 콜레스테롤(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C) 농도는 혈청 생화학적 측정기계(DRI-CHEM 3500i, FUJI Film, Japan)를 이용하여 비색측정하였다. 한편, TG, TC, HDL-C 수치를 이용하여 Lauer 등 [15]의 방법에 따라 HDL-C / TC 비 (HDL-C / TC ratio, HTR) 및 동맥경화지수(atherogenic index, AI)를 계산하였다
성능/효과
- 1). A.oryzae로 전환하여 다양한 변화가 있는 것을 확인할 수 있었다. 5.
- AI는 HFD군(0.62±0.10)이 NFD군(0.22±0.07), CP군(0.42±0.02), CPA군(0.19±0.05)에 비해 높았고, CPA군이 NFD군보다 약 13% 낮은 것을 확인하였다.
- 7 mg/dl)에 비해 유의적으로 높은 수치를 나타내었다. CP군과 CPA군은 NFD군에 비해 각각 약 21%, 18%로 유의적으로 낮았다. HTR은 HFD군(0.
- 14 g)은 HFD군에 비해 유의적으로 낮았다. CP군과 CPA군은 NFD군에 비해 각각 약 7%, 15% 낮았으며, 특히 CPA군이 다른 군들에 비해 낮았으나 유의적인 차이는 없었다. 비장의 무게 또한 HFD군(0.
- Fig. 4와 같이 혈청 지질 분석을 한 결과, CP와 CPA의 총 콜레스테롤이 고지방식을 먹은 HFD에 비하여 유의성 있게 낮으며, HDL-C은 HFD에 비해 오히려 증가하였는데 HDL-C이 동맥경화를 예방하는 유익한 cholesterol이라는 것을 고려해보면 감귤박이 유익한 cholesterol을 증가시켜 체내에 이로운 기능을 한다는 것을 알 수 있다. 또한 TC 분석결과, 감귤박과 감귤박 전환물을 처리한 군에서 현저히 낮게 나타난 것을 확인 하였다.
- 32 g 이었다. HFD군에 비해 감귤 투여군인 CP군에서는 34%, CPA군에서는 체중이 40% 낮게 측정되었으며, CPA군이 CP보다 체중이 8% 낮았다. 실험 기간 동안의 체중 증가량은 NFD군은 9.
- HTR은 HFD군(0.62±0.13)이 NFD군(0.82±0.07), CP군(0.70±0.02), CPA군(0.84±0.05) 비해 높았고, 특히 CPA군은 NFD군에 비해 2% 높았다.
- TC 농도는 CP군(165.3±3.6 mg/dl), CPA군(165.3±20.7mg/dl) 및 NFD군(152.7±2.2 mg/dl) 모두 HFD군(175.5±14.7mg/dl)에 비해 낮았고, CP군과 CPA군은 NFD군에 비해 약 8% 높았다.
- TG 농도는 HFD군(148.0±17.7 mg/dl)이 NFD군(131.0±14.1 mg/dl)에 비해 높았지만 유의적인 차이는 없었고, CP군(103.0±10.6 mg/dl), CPA군(107.3±24.7 mg/dl)에 비해 유의적으로 높은 수치를 나타내었다.
- TG 농도는 NFD군(142.4±18.7 mg/dl), CP군(150.3±27.3 mg/dl), CPA군(151.0±22.2 mg/dl)이 HFD군(193.8±17.3mg/dl)에 비해 유의적으로 낮았지만, CP군, CPA군은 NFD군보다는 각각 약 5%, 6% 유의적으로 높았다.
- 간의 무게는 HFD군(1.92±0.19g)이 NFD군(1.66±0.17 g) 보다 높았으나 유의적 차이는 없었고, CP군(1.53±0.06g), CPA군(1.40±0.14 g)은 HFD군에 비해 유의적으로 낮았다.
- oryzae를 이용하여 생물전환시킨 soybean에서 증가된 antioxidant 효과를 관찰하였다. 감귤박에 A. oryzae를 이용하여 생물전환 시킨 후 TLC 분석으로 확인한 결과, 감귤박에서는 나타나지 않았던 성분이 증가된 것을 확인하였다. 기존 연구에서는 감귤박 함유 성분인 naringin의 무배당 형체인 naringenine의 항비만 효과에 대한 결과가 발표되어지고 있다.
- 그 결과, 혈청 지질농도는 Fig. 4와 Table 3에서와 같이, 혈청 TC 농도는 HFD군(121.5±6.4 mg/dl)이 NFD군(103.5±16.3 mg/dl), CP군(108.0±10.0 mg/dl), CPA군(95.0±16.0 mg/dl)에 비해 높은 수치를 보여 HFD군은 NFD군에 비해 17% 유의한 증가를 보였다.
- 05)에 비해 높았고, CPA군이 NFD군보다 약 13% 낮은 것을 확인하였다. 따라서 감귤박 추출물은 고지방식이 섭취로 비만이 유도된 생쥐에서 항비만 효과를 나타내었지만, A. oryzae로 발효시킨 경우, 감귤박 추출물의 지질개선 효과가 증가하는 것을 확인하였다.
- oryzae로 발효시킨 CPA가 체중 증가량이 가장 적었다. 따라서 감귤박를 투여한 것이 체중 증가를 억제하는 효과가 있으며 감귤박보다 감귤박에 A. oryzae로 발효시킨 것이 더 효과가 높다는 것을 확인하였다.
- 따라서 감귤박의 섭취로 체내 고지혈증, 심혈관계 질환, 비만 등의 지질 대사와 관련된 여러 질병을 예방할 수 있으며, A. oryzae를 이용하여 발효시킨 감귤박 발효산물은 생물전환으로 인해 증가된 성분이 항비만효과를 증대 시킬 수 있을 것으로 예상되어진다.
- 이러한 결과는 5%의감귤박을 식이와 혼합한 실험에서 항비만 효과를 보인 Jung 등의 결과와 일치하였다[14]. 따라서 같은 고지방식이를 섭취하더라도 감귤박 추출물에 의해 체중의 증가가 억제되었으며, 감귤박 추출물보다 A. oryzae에 의해 발효된 감귤박 추출물의 항비만 효과가 더 높았다.
- 4와 같이 혈청 지질 분석을 한 결과, CP와 CPA의 총 콜레스테롤이 고지방식을 먹은 HFD에 비하여 유의성 있게 낮으며, HDL-C은 HFD에 비해 오히려 증가하였는데 HDL-C이 동맥경화를 예방하는 유익한 cholesterol이라는 것을 고려해보면 감귤박이 유익한 cholesterol을 증가시켜 체내에 이로운 기능을 한다는 것을 알 수 있다. 또한 TC 분석결과, 감귤박과 감귤박 전환물을 처리한 군에서 현저히 낮게 나타난 것을 확인 하였다. 비만이나 고지혈증으로 유발되는 심혈관계의 대표적인 질병 중 하나인 동맥경화의 예상지표를 나타내는 atherogenic index (AI)는 고지방식이를 섭취한 군보다 감귤박추출물을 처리한 CP에서 유의성 있게 감소 하였고, 특히 A.
- 또한, 장기 및 지방조직 무게를 확인한 결과 간, 비장 지방 조직의 경우 HFD의 경우 NFD에 비하여 조직과 지방조직의 무게가 증가하였지만, CP와 CPA는 HFD보다 감소하여 NFD와 비슷한 양상을 보였다. 즉, 감귤박은 체중의 증가 뿐만 아니라 체내의 장기와 지방조직의 축적을 감소시키는 효과도 있다는 것을 확인하였다.
- 복부 내장 지방의 무게는 HFD군(1.40±0.41 g)이 NFD군(0.93±0.23 g)에 비해 높았으나 유의적 차이는 없었고, CP군(0.63±0.22 g), CPA군(0.52±0.21 g) 들에 비해 유의적으로 현저하게 높았다.
- 비장의 무게 또한 HFD군(0.34±0.02 g)이 NFD군(0.18±0.02 g), CP군(0.20±0.04 g), CPA군(0.18±0.02 g) 들에 비해 유의적으로 높았고, CP군과 CPA군은 NFD군에 비해 각각 약 11%, 1% 높았으나 유의적인 차이는 없었다.
- 시간에 따라 각 군별로 체중의 변화를 확인한 결과(Fig. 2), 일반식이를 투여한 NFD의 경우 4주의 실험 기간 동안 체중이 3.06±0.22 g 증가하였고, 고지방식이를 투여한 HFD은 6.63±0.36 g 증가하여 NFD에 비해 약 2배 더 증가하였다.
- 신장의 무게는 HFD군(0.72±0.13 g)은 NFD군(0.72±0.06 g)과 비슷한 양상을 보였지만 CP군(0.60±0.04 g)과 CPA군(0.56±0.04 g)은 NFD군과 HFD군과의 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다.
- HFD군에 비해 감귤 투여군인 CP군에서는 34%, CPA군에서는 체중이 40% 낮게 측정되었으며, CPA군이 CP보다 체중이 8% 낮았다. 실험 기간 동안의 체중 증가량은 NFD군은 9.83 g, HFD군은 15.94 g, CP군은 4.78 g, CPA군은 3.61g이었고, 초기 체중으로 나눈 체중 증체율은 Fig. 2B에서와 같이 NFD군은 52%, HFD군은 82%, CP군은 26%, CPA군은 20%의 증가를 보여 HFD군이 다른 실험군들에 비해 체중증 가가 가장 높았고, 감귤 추출물 투여군인 CP군과 CPA군의 경우 정상식이군이 NFD군보다 낮았다. 이러한 결과는 5%의감귤박을 식이와 혼합한 실험에서 항비만 효과를 보인 Jung 등의 결과와 일치하였다[14].
- 04 g)은 NFD군과 HFD군과의 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다. 이로 인해 감귤박 추출물이 비만을 유도한 생쥐 모델에서 장기 및 조직의 무게에 변화를 준다 것을 확인하였다
- 최근 연구에서는 naringenin이 human과 rat에서 hepatic lipid metabolism의 중요한 transcriptional factor인 PPARalpha, PPARgamma, LXRalpha를 조절하는 것으로 나타났다[10]. 즉, CYP4A11, ACOX, UCP1 and ApoAI와 같은 fatty acid oxidation gene을 조절하는 PPAR family 유전자의 발현을 유도하고, FAS, ABCA1, ABCG1, 그리고 HMGR와 같은 lipogenesis관련 유전자를 조절하는 LXRalpha의 발현을 억제하는 것으로 나타났다.
- 또한, 장기 및 지방조직 무게를 확인한 결과 간, 비장 지방 조직의 경우 HFD의 경우 NFD에 비하여 조직과 지방조직의 무게가 증가하였지만, CP와 CPA는 HFD보다 감소하여 NFD와 비슷한 양상을 보였다. 즉, 감귤박은 체중의 증가 뿐만 아니라 체내의 장기와 지방조직의 축적을 감소시키는 효과도 있다는 것을 확인하였다.
- 36 g 증가하여 NFD에 비해 약 2배 더 증가하였다. 하지만 고지방식이와 함께 감귤박을 투여한 CP와 감귤박에 A.oryzae로 발효시킨 CPA가 HFD보다 체중 증가량이 유의적으로 가장 감소하여 NFD투여군 보다 낮았다. 특히 감귤박에 A.
- 0 mg/dl)에 비해 높은 수치를 보여 HFD군은 NFD군에 비해 17% 유의한 증가를 보였다. 한편 CP군은 NFD군에 비해 약 4% 높은 양상을 보였으나, CPA군은 NFD보다 약 8% 낮았다. 혈청 HDL-C 농도는 HFD군(75.
- 한편, HDL-C농도는 NFD군(42.7±0.6mg/dl), CP군(44.1±2.2 mg/dl), CPA군(46.2±3.9 mg/dl) 모두 HFD군(42.3±0.9 mg/dl) 보다 낮았고, CPA군은 NFD군보다 약 8% 높았다.
- 혈청 HDL-C 농도는 HFD군(75.0±19.8mg/dl)이 NFD군(85.0±19.7 mg/dl), CP군(76.0±4.2 mg/dl), CPA군(80.0±8.5 mg/dl)에 비해 낮았고, CP군과 CPA군은 NFD군에 비해 각각 약 10%, 5% 낮은 수치를 보였지만 HFD군 보다는 각각 약 1%, 6% 높았다.
- 혈청내의 총 cholesterol 중 HDL cholesterol의 함량을 백분율로 나타내는 HTR은 CP군(0.27±0.01)과 CPA군(0.27±0.01)이 HFD군(0.24±0.02)보다 높았지만, NFD군(0.28±0.00)과 비슷한 양상을 보였다.
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