[논문]막걸리에서 분리한 Lactobacillus plantarum의 biogenic amine 생성능

곽희정; 김재영; 이현숙; 김순미

doi:10.9721/kjfst.2014.46.4.438

막걸리에서 분리한 Lactobacillus plantarum의 biogenic amine 생성능
Formation of Biogenic Amines by Lactobacillus plantarum Isolated from Makgeolli 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.46 no.4, 2014년, pp.438 - 445

곽희정 (식품의약품안전평가원 식품위해평가부 영양기능연구팀) , 김재영 (가천대학교 생명과학과) , 이현숙 (동서대학교 식품영양학과) , 김순미 (가천대학교 영양학과)

초록
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본 연구는 시판되고 있는 막걸리의 저장 온도에 따른 BA 생성의 차이를 비교하고, 시판 막걸리의 우점종을 찾아내어, 이 균을 멸균 막걸리에 접종함으로써 BA 생성여부를 확인하고자 하였다. 시판 막걸리 11종을 구입해 $4^{\circ}C$와 $20^{\circ}C$에서 각각 10일 동안 저장한 뒤 BA 함량을 확인한 결과, 생막걸리는 $4^{\circ}C$에 비해 $20^{\circ}C$에서 10일간 저장함에 따라 BA 양이 급격히 증가하였고, 살균막걸리는 온도에 따른 BA 변화가 없었다. 시판 막걸리에서 가장 많이 검출된 BA는 histamine과 putrescine이었다. $4^{\circ}C$에서 저장한 막걸리에 비해 $20^{\circ}C$에서 저장한 막걸리에서 미생물의 변성된 DNA band가 다양하게 나타났다. $4^{\circ}C$에서 저장한 시판 막걸리의 주된 bacteria는 Staphylococcus succinus와 Staphylococcus gallinarum, Lactobacillus (L). brevis, L. plantarum, L. fermentum였고, $20^{\circ}C$ 막걸리에서 공통적으로 증식한 균은 L. perolens, L. harbinensis, LBARR16SI L. brevis, L. plantarum, L. satsumensis이었다. 막걸리에서 분리한 18종의 colony 중 3종의 L. plantarum strains을 $4^{\circ}C$에서 3일간 보관한 신선한 막걸리를 멸균한 후 접종하고 BA 생성능을 비교한 결과, PLP나 아미노산을 첨가하지 않은 경우는 접종 후 15일까지 BA가 검출되지 않았다. 멸균막걸리에 PLP를 추가해준 경우 3종의 colony를 접종해준 모든 막걸리에서 15일까지 미량의 tyramine만 검출되었으며 PLP와 아미노산을 둘다 추가해준 경우 3종의 colony 모두 10일째와 15일째에 tyramine과 histamine이 검출되었다. $20^{\circ}C$에서 21일간 저장한 막걸리는 멸균 후 PLP만 추가해주어도 3종의 colony 모두 5일, 10일, 15일에 과량의 tyramine, histamine, putrescine, cadaverine이 검출되었다. 이런 결과로 볼 때, 막걸리를 저온 저장하지 않을 경우 막걸리 성분의 분해로 인하여 BA 양이 증가하며, 막걸리 저장 온도는 막걸리 미생물 양상에 매우 큰 영향을 미칠 수 있음을 알 수 있었다. 또한 막걸리 유산균의 우점종인 L. plantarum은 막걸리에서 histamine, tyramine, putrescine과 cadaverine을 생성할 수 있음을 밝혀, 이것이 막걸리 BA 생성의 주요 원인균 중 하나임을 알 수 있었다. 이후 막걸리의 BA를 낮추기 위한 조건을 탐색하는 연구가 계속 진행될 필요가 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

We examined biogenic amine (BA) production as well as the diversity of bacterial flora in 11 types of commercial makgeolli stored at 4 and $20^{\circ}C$. Moreover, we studied the BA-producing activity of three L. plantarum strains isolated from makgeolli. At $20^{\circ}C$, the BA content was highly increased and the denatured DNA bands were more variable in non-sterilized makgeolli compared to sterilized makgeolli. The major BAs produced in commercial makgeolli were histamine and putrescine. Histamine, tyramine, putrescine, and cadaverine were produced in excess by inoculation of the three L. plantarum isolates to makgeolli stored at $20^{\circ}C$ for 21 days. These results suggest that some L. plantarum strains in makgeolli can produce different types of BAs, depending on the extent of degradation of makgeolli.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

아직 까지 막걸리 내 BA 생성과 유산균에 관한 연구는 거의 없다. 본 연구는 시판되고 있는 11종의 막걸리를 4℃ 또는 20℃에서 저장하여 BA 생성을 살펴보고 이 중 한 종의 막걸리에서 우점종인 유산균을 찾아낸 후 멸균한 막걸리에 이 균주를 첨가하여 BA 생성여부를 확인하고자 하였다. 또한 활성조효소, 아미노산의 첨가 여부에 따른 이들 유산균의 BA 생성능을 비교해 보았다.
본 연구는 시판되고 있는 막걸리의 저장 온도에 따른 BA 생성의 차이를 비교하고, 시판 막걸리의 우점종을 찾아내어, 이 균을 멸균 막걸리에 접종함으로써 BA 생성여부를 확인하고자 하였다.
42 mg/L로 증가되지 않고 유지되는 경향을 보이고, histamine이나 tyramine 등의 BA가 생성되지 않았다. 이것은 쌀로 만든 막걸리가 다른 원료로 제조한 막걸리에 비해 저온저장 시 BA 생성이 효과적으로 억제될 가능성을 제시해 주는 것이다. 실제로 Kim과 Han(5)은 최근 쌀과 밀가루 배합비율을 달리하여 막걸리를 담가 4℃와 20℃에 저장하며 BA 생성량을 살펴 본 결과 쌀만으로 제조되었거나 쌀 배합비율이 높은 막걸리는 밀가루 비율이 높은 막걸리에 비해 4℃ 뿐만 아니라 20℃에서도 BA 생성이 크게 감소했다는 결과를 보고한 바 있다.
plantarum을 접종한 경우는 유리 아미노산의 부족으로 해당 colony가 BA를 생성하지 못한 것으로 보인다. 조효소 PLP를 첨가해준 경우 tyramine만 미량 검출되는 것과 조효소 PLP에 6종의 아미노산을 추가해주었을 때 tyramine 이외 추가로 histamine만 생성된 결과가 이런 추측을 뒷받침해준다. 따라서 L.

제안 방법

2 M HCl 10 µL을 첨가하여 반응을 종료시키고 HPLC로 BA 생성을 확인하였다.
8가지 BA 표준물질(histamine, tryptamine, tyramine, phenylethylamine, putrescine, cadaverine, spermidine, spermine; ≥99%)을 동일한 과정으로 측정하여 분석한 peak 시간과 면적을 바탕으로 표준곡선을 작성한 후, 시료 BA의 분석 시 검출된 BA peak 그래프의 정량을 위한 기준으로 이용하였다(Fig. 1).
, Wilmington, DE, USA)이었다. HPLC의 측정은 이동상의 flow rate를 1 mL/min, 농도 구배는 eluent A를 초기 70%에서 100%가 되게 프로그램 하여 총 22분간 시행하였다. 이동상으로 acetonitrile (eluent A)과 sodium acetate buffer (0.
L. plantarum 균주의 BA 생성능을 확인하기 위해 막걸리를 멸균하고 여기에 분리한 L. plantarum을 접종 한 후 배양하여 BA 를 측정하였다. 각각의 L.
증폭조건은 94℃에서 5분간 최초 변성과정을 진행한 뒤 94℃에서 30초 동안 변성, 58℃에서 30초 동안 primer 붙이기, 72℃에서 30초 동안 DNA 연장을 35회 반복한 뒤 마지막 72℃에서 10분간 최종 DNA 연장을 진행하였다. PCR 산물은 1.5% agarose gel을 0.5X TBE buffer (T2004, Biosesang, Seongnam, Korea)에 넣고 전기영동(Mupid-2 plus, OPTIMA, Tokyo, JAPAN)을 하여 Dual UV transilluminator (UVT-260D, OPTIMA, Tokyo, JAPAN)와 GS-700 Imaging Densitometer, Digital Gel Documentation (BioRad Lab Inc., CA, USA)으로 bacteria specific band를 확인한 뒤 DGGE 분석을 하였다.
PCR은 10× PCR buffer, 0.25 mM의 각각의 dNTPs, 5IU Taq DNA polymerase, 0.3 µM의 각각의 primer에 1.5 µL의 DNA를 넣어 30 µL의 반응혼합물을 만들어 주고 PCR Thermal Cycler를 이용하여 진행하였다.
멸균 막걸리 배양액에 PLP, 또는 PLP와 아미노산을 같이 첨가하여 이들 첨가여부에 따라 BA 생성능이 달라지는지를 확인하였다. PLP는 L. plantarum의 아미노산 탈탄산반응에 관여하는 조효소이므로 첨가하였고, 아미노산은 멸균에 의해 BA의 전구체인 아미노산이 변성되었을 것을 우려해 BA의 전구체로 사용되는 아미노산 6가지(tyrosine, histidine, phenylalanine, ornithine, lysine, tryptophan)를 각각 2 g/L씩 첨가해 주었다.
각각의 L. plantarum colony는 MRS broth 배지에서 OD600 nm=0.5 정도가 되었을 때 멸균한 막걸리 3 mL에 30 µL 씩 접종하여 진탕배양기(VS-8480SF, Vision Scientific, Daejon, Korea)에서 28℃로 유지하면서 배양한 후 Tang 등(38)의 방법을 응용하여 HPLC로 BA를 검출하였다.
실험에 사용한 시판 막걸리는 인천광역시 대형마트, 탁·약주 대리점 및 소규모 상점에서 구입한 총 11종 이었다(Table 1). 구입한 막걸리는 4℃ 또는 20℃에 각각 10일간 보관한 후 BA 및 미생물 분석에 사용하였다. Histamine (H7250), tryptamine (193747), tyramine (H8502), phenylethylamine (P6513), putrescine (P7505), cadaverine (D22606), spermidine (S2626), spermine (S3256) 등 8종의 biogenic amine과 pyridoxal phosphate (P3657), methanol (34860), 4-chloro-3,5-dinitrobenzotrifluoride (CNBF, 197017), H₃BO₃ (B0252), Na₂B₄O₇ (B9876), sodium acetate (S8750), phenol (P4557), chloroform (C2432), urea (U6504), formamide (47670)는 Sigma-Aldrich (St.
2, eluent B)를 이용하였다. 더 높은 검출 한계값을 얻기 위해 CNBF 유도반응 종료 후, 시료 주입 전의 여과 과정을 생략하였다. 컬럼 온도는 35℃, UV detector 파장은 254 nm에서 측정하였다.
본 연구는 시판되고 있는 11종의 막걸리를 4℃ 또는 20℃에서 저장하여 BA 생성을 살펴보고 이 중 한 종의 막걸리에서 우점종인 유산균을 찾아낸 후 멸균한 막걸리에 이 균주를 첨가하여 BA 생성여부를 확인하고자 하였다. 또한 활성조효소, 아미노산의 첨가 여부에 따른 이들 유산균의 BA 생성능을 비교해 보았다.
막걸리에서 분리한 colony를 동정하기 위하여 API 50CH (BioMerieux, Lyon, France)로 탄수화물 대사시험(carbohydrates metabolic test)을 진행하였다. 이후 분리한 균주로부터 추출한 DNA를 주형으로 16s rRNA 유전자를 PCR 반응으로 증폭시켰다.
이 때 멸균한 막걸리는 Table 1의 D 제품으로서, 4℃에서 3일 보관한 신선한 막걸리와 20℃에서 21일 보관한 오래된 막걸리를 각각 121℃에서 15분간 가열하여 멸균하였다. 멸균 막걸리 배양액에 PLP, 또는 PLP와 아미노산을 같이 첨가하여 이들 첨가여부에 따라 BA 생성능이 달라지는지를 확인하였다. PLP는 L.
, Hercules, CA, USA)으로 band 를 확인하였다. 멸균한 날로 젤 안의 band를 자른 뒤, 증류수와 섞어 튜브에 넣고 상온에 보관한 뒤 (주)솔젠트(Daejeon, Korea)에서 DNA를 추출하여 염기서열을 분석하였다. 이후 NCBI BLAST search를 이용해 확인하였다.
본 연구진은 이미 시판되는 한 종의 막걸리를 4℃와 20℃에서30일간 저장하는 동안의 미생물 변화를 PCR-DGGE를 통해 살펴본 바 있다(21). 본 연구에서는 4℃와 20℃에서 10일간 저장한 시판 막걸리 11종으로부터 DNA를 추출하고 16s rRNA gene을 PCR로 증폭시켜 DGGE를 수행한 결과 비슷한 결과를 얻을 수 있었다(Fig.
PCR 반응에는 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R (5'- GGCTACCTTGTTACGACT-3')을 primer로 사용하였다. 염기서열 분석은 (주)솔젠트(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 진행하였다. API 50CH test와 16s rRNA 염기서열 분석을 통해 분리된 균주가 Table 2와 같이 Lactobacillus plantarum 균주임을 확인하였고 이후의 실험에 사용하였다.
멸균한 날로 젤 안의 band를 자른 뒤, 증류수와 섞어 튜브에 넣고 상온에 보관한 뒤 (주)솔젠트(Daejeon, Korea)에서 DNA를 추출하여 염기서열을 분석하였다. 이후 NCBI BLAST search를 이용해 확인하였다.
막걸리에서 분리한 colony를 동정하기 위하여 API 50CH (BioMerieux, Lyon, France)로 탄수화물 대사시험(carbohydrates metabolic test)을 진행하였다. 이후 분리한 균주로부터 추출한 DNA를 주형으로 16s rRNA 유전자를 PCR 반응으로 증폭시켰다. PCR 반응에는 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R (5'- GGCTACCTTGTTACGACT-3')을 primer로 사용하였다.
5:1, BIO-RAD) polyacrylamide gel을 만들어 14시간 동안 1x TAE buffer 안에서 60℃, 80V (Power Pac^TM HC, BIO-RAD, Hercules, CA, USA)로 일정한 전압과 온도를 유지하면서 진행하였다. 전기영동 후 DGGE gel은 GelStar Stain^TM (Lonza, Rockland, ME, USA)을 이용해 15분간 염색한 뒤 Dual UV transilluminator와 Digital Gel Documentation (GelDoc 1000, Bio-Rad Lab Inc., Hercules, CA, USA)으로 band 를 확인하였다. 멸균한 날로 젤 안의 band를 자른 뒤, 증류수와 섞어 튜브에 넣고 상온에 보관한 뒤 (주)솔젠트(Daejeon, Korea)에서 DNA를 추출하여 염기서열을 분석하였다.
, Hercules, CA, USA)을 이용하였다. 전기영동은 urea와 formamide (47670) 변성제가 30-60% 농도차가 있는 8% (w/v, acrylamide-bisacrylamide 37.5:1, BIO-RAD) polyacrylamide gel을 만들어 14시간 동안 1x TAE buffer 안에서 60℃, 80V (Power Pac^TM HC, BIO-RAD, Hercules, CA, USA)로 일정한 전압과 온도를 유지하면서 진행하였다. 전기영동 후 DGGE gel은 GelStar Stain^TM (Lonza, Rockland, ME, USA)을 이용해 15분간 염색한 뒤 Dual UV transilluminator와 Digital Gel Documentation (GelDoc 1000, Bio-Rad Lab Inc.
즉 막걸리를 13,000 rpm (28,756×g), 4℃에서 5분간 원심분리 하여 얻은 상층액을 0.2 µm filter로 여과한 후 앞에서 기술한 것과 동일한 CNBF 유도과정과 HPLC 분석법을 사용하였다.
5 µL의 DNA를 넣어 30 µL의 반응혼합물을 만들어 주고 PCR Thermal Cycler를 이용하여 진행하였다. 증폭조건은 94℃에서 5분간 최초 변성과정을 진행한 뒤 94℃에서 30초 동안 변성, 58℃에서 30초 동안 primer 붙이기, 72℃에서 30초 동안 DNA 연장을 35회 반복한 뒤 마지막 72℃에서 10분간 최종 DNA 연장을 진행하였다. PCR 산물은 1.
추출한 DNA는 박테리아에 특이적인 primer, p338f (5'-ACGGG GGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')와 p518r (5'-ATTACCGC GGCTGCTGG-3')을 이용하여 polymerase chain reaction (PCR)을 진행하였고 이후 변성 구배 젤 전기영동(DGGE) 분석을 위해 oligo-GC clamp (5'-CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG GGC-3')를 붙인 GC-p338f를 사용하였다.

대상 데이터

염기서열 분석은 (주)솔젠트(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 진행하였다. API 50CH test와 16s rRNA 염기서열 분석을 통해 분리된 균주가 Table 2와 같이 Lactobacillus plantarum 균주임을 확인하였고 이후의 실험에 사용하였다.
Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. Acetonitrile은 Fisher Scientific Inc. (Seoul, Korea)에서 구입하였으며, acetic acid (HAc, 99.7%)는 Showa (Tokyo, Japan), Tris buffer (0826), sodium dodecyl sulfate (0227), EDTA (0105)는 AMRESCO (Solon, OH, USA) 제품을 각각 사용하였다. 또한 Proteinase K와 RNase A는 iNtRon Biotechnology (Seongnam, Korea), PCR buffer와 Taq DNA polymerase는 BEAMS Biotech (Seongnam, Korea), PCR Thermal Cycler Dice는 TaKaRa Bio Inc.
DGGE는 Dcode^TM Universal Mutation Detection System (BioRad Lab Inc., Hercules, CA, USA)을 이용하였다. 전기영동은 urea와 formamide (47670) 변성제가 30-60% 농도차가 있는 8% (w/v, acrylamide-bisacrylamide 37.
구입한 막걸리는 4℃ 또는 20℃에 각각 10일간 보관한 후 BA 및 미생물 분석에 사용하였다. Histamine (H7250), tryptamine (193747), tyramine (H8502), phenylethylamine (P6513), putrescine (P7505), cadaverine (D22606), spermidine (S2626), spermine (S3256) 등 8종의 biogenic amine과 pyridoxal phosphate (P3657), methanol (34860), 4-chloro-3,5-dinitrobenzotrifluoride (CNBF, 197017), H₃BO₃ (B0252), Na₂B₄O₇ (B9876), sodium acetate (S8750), phenol (P4557), chloroform (C2432), urea (U6504), formamide (47670)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. Acetonitrile은 Fisher Scientific Inc.
PCR 반응에는 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R (5'- GGCTACCTTGTTACGACT-3')을 primer로 사용하였다.
막걸리의 원재료도 소맥분 100% 또는 쌀 100%인 제품 이외에도 쌀, 소맥분, 전분, 전분당 등의 비율을 달리한 제품 등 다양하였으며, 제조일 부터 구입 시까지의 경과일도 당일에서 26일(살균제품)까지 다양하였다(Table 1). 구입한 제품은 실험 시까지 4℃와 20℃에 10일간 보관한 후 BA 및 미생물 동정에 사용하였다.
7%)는 Showa (Tokyo, Japan), Tris buffer (0826), sodium dodecyl sulfate (0227), EDTA (0105)는 AMRESCO (Solon, OH, USA) 제품을 각각 사용하였다. 또한 Proteinase K와 RNase A는 iNtRon Biotechnology (Seongnam, Korea), PCR buffer와 Taq DNA polymerase는 BEAMS Biotech (Seongnam, Korea), PCR Thermal Cycler Dice는 TaKaRa Bio Inc. (TP 600, Shiga, Japan)에서 각각 구입하였으며, TBE buffer는 (주)바이오세상(Seongnam, Korea)에서 구입하였다.
본 연구에서 사용한 시판 막걸리는 총 11종이었다. 이중 살균 막걸리는 2종이었고 나머지 9종은 생막걸리였다.
사용한 기기와 컬럼은 각각 L9100 HPLC System (Younglin Int. Co., Anyang, Korea)과 Zorbax Eclipse XDB-C18 컬럼(4.6 ×250 mm, 5 µm, Agilent Technologies Co., Wilmington, DE, USA)이었다.
실험에 사용한 시판 막걸리는 인천광역시 대형마트, 탁·약주 대리점 및 소규모 상점에서 구입한 총 11종 이었다(Table 1).
2 µm filter로 여과한 후 앞에서 기술한 것과 동일한 CNBF 유도과정과 HPLC 분석법을 사용하였다. 이 때 멸균한 막걸리는 Table 1의 D 제품으로서, 4℃에서 3일 보관한 신선한 막걸리와 20℃에서 21일 보관한 오래된 막걸리를 각각 121℃에서 15분간 가열하여 멸균하였다. 멸균 막걸리 배양액에 PLP, 또는 PLP와 아미노산을 같이 첨가하여 이들 첨가여부에 따라 BA 생성능이 달라지는지를 확인하였다.

이론/모형

시판 막걸리 내에 BA를 생성하는 미생물을 동정하기 위해 막걸리 시료 2-3 mL을 13,000 rpm (28,756×g), 4℃에서 5분간 원심 분리 하여 얻은 pellet을 이용하였고, 분석 전까지 −20℃ 이하에서 보관하였다. DNA 추출은 phenol 법(39-41)을 이용하였다.
막걸리의 BA는 Tang 등(38)의 방법을 응용하여 HPLC로 측정하였다. 막걸리 시료 1 mL을 원심분리기(Micro 17TR, Hanil Science Industrial Co.

성능/효과

그리고 아미노산과 PLP를 함께 첨가한 경우는 3종의 막걸리에서 모두 10일과 15일 후에 tyramine과 histamine이 검출되었다. 20℃에서 21일간 저장하는 동안 미생물의 활발한 대사과정으로 유리아미노산 함량이 많을 것으로 예상되는 오래된 막걸리는 멸균 후 PLP만 추가해주었음에도 불구하고 3종의 colony 모두 5일, 10일, 15일째에 과량의 tyramine, histamine, putrescine, cadaverine이 검출되었다. 이는 신선한 생막걸리에 아미노산을 추가하는 것 보다 20℃에서 오래 동안 저장하면서 막걸리 전체의 다양한 미생물 군집이 만들어낸 유리 아미노산들이 BA 생성에 더 유리할 수 있다는 증거이다.
멸균막걸리에 PLP를 추가해준 경우 3종의 colony를 접종해준 모든 막걸리에서 15일까지 미량의 tyramine만 검출되었으며 PLP와 아미노산을 둘다 추가해준 경우 3종의 colony 모두 10일째와 15일째에 tyramine 과 histamine이 검출되었다. 20℃에서 21일간 저장한 막걸리는 멸균 후 PLP만 추가해주어도 3종의 colony 모두 5일, 10일, 15일에 과량의 tyramine, histamine, putrescine, cadaverine이 검출되었다.
즉, 4℃에 비해 20℃에서 저장한 막걸리에서 미생물의 변성된 DNA band가 다양하게 나타났다. 4℃에서 저장한 막걸리는 비교적 유사한 세균 집단이 나타난 반면, 20℃에서 저장한 막걸리에서는 각각의 막걸리마다 독특한 세균 집단을 구성하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 4℃에서 나타난 밴드가 20℃에서 선명도가 약해진 것은 해당 미생물의 수가 줄어들었거나 다른 미생물들의 증식이 상대적으로 증가하여 초기에 비해 우점종이 변화한 것일 수 있다.
시판 막걸리에서 가장 많이 검출 된 BA는 histamine과 putrescine이고 spermine과 spermidine은 극소량 검출되었다. Putrescine은 저장온도 및 살균 여부에 관계없이 검출되어 putrescine이 막걸리의 주된 BA임을 알 수 있었다. 와인의 주요 3대 BA는 histamine, tyramine, putrescine이라고 보고된 바 있어 (42,43), 본 연구와 유사하였다.
4℃에서 저장한 시판 막걸리의 주된 bacteria는 Staphylococcus succinus와 Staphylococcus gallinarum, Lactobacillus (L). brevis, L. plantarum, L. fermentum였고, 20℃ 막걸리에서 공통적으로 증식한 균은 L. perolens, L. harbinensis, LBARR16SI L. brevis, L. plantarum, L. satsumensis이었다. 막걸리에서 분리한 18종의 colony 중 3종의 L.
이것은 아직 국내에 있는 막걸리 회사들의 원료, 제조공정 및 유통과정이 표준화되어 있지 않은 결과로 보인다. 그리고 E와 K 막걸리는 생막걸리임에도 불구하고 20℃에서 10일 동안 저장했을 때에도 histamine이 검출되지 않은 것은 매우 바람직한 결과이며 원료 및 제조공정 표준화에 따라서 막걸리의 품질 향상을 크게 기대할 수 있다는 사실을 시사한다. 현재 막걸리 제품의 유통기한은 따로 정해진 것이 없이 제조사가 정하는 것이지만 이에 대한 객관적인 지침이 필요하며, 특히 외부 기온 및 유통방법에 따라 차별화되어야 할 것으로 생각된다.
PLP를 첨가해준 경우 3종의 colony를 접종한 모든 막걸리에서 15일까지 미량의 tyramine만 검출되었다. 그리고 아미노산과 PLP를 함께 첨가한 경우는 3종의 막걸리에서 모두 10일과 15일 후에 tyramine과 histamine이 검출되었다. 20℃에서 21일간 저장하는 동안 미생물의 활발한 대사과정으로 유리아미노산 함량이 많을 것으로 예상되는 오래된 막걸리는 멸균 후 PLP만 추가해주었음에도 불구하고 3종의 colony 모두 5일, 10일, 15일째에 과량의 tyramine, histamine, putrescine, cadaverine이 검출되었다.
sakei, Weissella koreensis, Leuconostoc inha가 주종을 이루고 있는 것을 보고했고, Kim 등(51)은 된장에 있는 미생물을 분석한 결과 Enterococcus faecium, Leuconostoc mesenteroides, Tetragenococcus halophilus가 주종을 이루고 있는 것을 보고했다. 김치와 된장, 막걸리는 한국을 대표하는 발효식품이지만 원료 및 제조과정이 각각 다르기 때문에 발효식품에서 우세한 미생물들에도 확연한 차이가 있음을 알 수 있었다.
조효소 PLP를 첨가해준 경우 tyramine만 미량 검출되는 것과 조효소 PLP에 6종의 아미노산을 추가해주었을 때 tyramine 이외 추가로 histamine만 생성된 결과가 이런 추측을 뒷받침해준다. 따라서 L. plantarum 3종의 strains 은 막걸리에서 histamine과 tyramine을 생성할 수 있음을 알 수 있었다.
이런 결과로 볼 때, 막걸리를 저온 저장하지 않을 경우 막걸리 성분의 분해로 인하여 BA 양이 증가하며, 막걸리 저장 온도는 막걸리 미생물 양상에 매우 큰 영향을 미칠 수 있음을 알 수 있었다. 또한 막걸리 유산균의 우점종인 L. plantarum은 막걸리에서 histamine, tyramine, putrescine과 cadaverine을 생성할 수 있음을 밝혀, 이것이 막걸리 BA 생성의 주요 원인균 중 하나임을 알 수 있었다. 이후 막걸리의 BA를 낮추기 위한 조건을 탐색하는 연구가 계속 진행될 필요가 있다.
satsumensis이었다. 막걸리에서 분리한 18종의 colony 중 3종의 L. plantarum strains 을 4℃에서 3일간 보관한 신선한 막걸리를 멸균한 후 접종하고 BA 생성능을 비교한 결과, PLP나 아미노산을 첨가하지 않은 경우는 접종 후 15일까지 BA가 검출되지 않았다. 멸균막걸리에 PLP를 추가해준 경우 3종의 colony를 접종해준 모든 막걸리에서 15일까지 미량의 tyramine만 검출되었으며 PLP와 아미노산을 둘다 추가해준 경우 3종의 colony 모두 10일째와 15일째에 tyramine 과 histamine이 검출되었다.
plantarum strains 을 4℃에서 3일간 보관한 신선한 막걸리를 멸균한 후 접종하고 BA 생성능을 비교한 결과, PLP나 아미노산을 첨가하지 않은 경우는 접종 후 15일까지 BA가 검출되지 않았다. 멸균막걸리에 PLP를 추가해준 경우 3종의 colony를 접종해준 모든 막걸리에서 15일까지 미량의 tyramine만 검출되었으며 PLP와 아미노산을 둘다 추가해준 경우 3종의 colony 모두 10일째와 15일째에 tyramine 과 histamine이 검출되었다. 20℃에서 21일간 저장한 막걸리는 멸균 후 PLP만 추가해주어도 3종의 colony 모두 5일, 10일, 15일에 과량의 tyramine, histamine, putrescine, cadaverine이 검출되었다.
본 연구진은 이미 시판되는 한 종의 막걸리를 4℃와 20℃에서30일간 저장하는 동안의 미생물 변화를 PCR-DGGE를 통해 살펴본 바 있다(21). 본 연구에서는 4℃와 20℃에서 10일간 저장한 시판 막걸리 11종으로부터 DNA를 추출하고 16s rRNA gene을 PCR로 증폭시켜 DGGE를 수행한 결과 비슷한 결과를 얻을 수 있었다(Fig. 2). 즉, 4℃에 비해 20℃에서 저장한 막걸리에서 미생물의 변성된 DNA band가 다양하게 나타났다.
시판 막걸리 11종을 구입해 4℃와 20℃에서 각각 10일 동안 저장한 뒤 BA 함량을 확인한 결과, 생막걸리는 4℃에 비해 20℃에서 10일간 저장함에 따라 BA 양이 급격히 증가하였고, 살균 막걸리는 온도에 따른 BA 변화가 없었다. 시판 막걸리에서 가장 많이 검출된 BA는 histamine과 putrescine이었다.
시판 막걸리 중 쌀을 90% 이상 함유한 B, D, E, K 생막걸리는 4℃에서 저장할 경우 10일 뒤에도 총 BA의 양이 16.86-33.42 mg/L로 증가되지 않고 유지되는 경향을 보이고, histamine이나 tyramine 등의 BA가 생성되지 않았다. 이것은 쌀로 만든 막걸리가 다른 원료로 제조한 막걸리에 비해 저온저장 시 BA 생성이 효과적으로 억제될 가능성을 제시해 주는 것이다.
생막걸리는 4℃에 비해 20℃에서 저장한 경우 저장기간이 증가함에 따라 BA 양이 급격히 증가한 반면, 살균 막걸리는 저장온도에 따른 BA 변화가 거의 없었다. 시판 막걸리에서 가장 많이 검출 된 BA는 histamine과 putrescine이고 spermine과 spermidine은 극소량 검출되었다. Putrescine은 저장온도 및 살균 여부에 관계없이 검출되어 putrescine이 막걸리의 주된 BA임을 알 수 있었다.
이런 결과로 볼 때, 막걸리를 저온 저장하지 않을 경우 막걸리 성분의 분해로 인하여 BA 양이 증가하며, 막걸리 저장 온도는 막걸리 미생물 양상에 매우 큰 영향을 미칠 수 있음을 알 수 있었다. 또한 막걸리 유산균의 우점종인 L.

후속연구

BA 생성을 낮출 수 있는 조건을 알아내는 것은 막걸리의 안전성을 확보하여 한국 전통주로서의 위상을 높이고 국내·외 시장을 확대하는데 기여할 수 있을 것으로 본다.
plantarum에서 BA를 확인한 논문은 없다. 앞으로 막걸리에서 분리한 균의 BA 생성 배지 조건 등을 확립할 추가 연구가 필요하며 이러한 연구는 앞으로 막걸리의 BA 생성을 억제하는 기술을 개발함에 있어서 중요한 기초 자료가 될 것이다.
이와 같이 막걸리에는 많은 수의 유산균이 존재하며, 특히 여러 종의 Lactobacillus가 존재하므로 술이지만 잠재적인 건강기능식품으로서의 효과가 기대된다. 그러나 유산균, 육류, 치즈, 와인 등에서 biogenic amine (BA)이 생성되는데(22), BA는 와인을 비롯한 발효주와 각종 발효식품에서 흔히 발견되며, 주로 미생물에 의한 아미노산의 탈탄산반응 결과로 생성된다(23-27).
plantarum은 막걸리에서 histamine, tyramine, putrescine과 cadaverine을 생성할 수 있음을 밝혀, 이것이 막걸리 BA 생성의 주요 원인균 중 하나임을 알 수 있었다. 이후 막걸리의 BA를 낮추기 위한 조건을 탐색하는 연구가 계속 진행될 필요가 있다.
plantarum 균종의 증가가 뚜렷함을 확인한 바 있다. 한편 L. plantarum 균주 중에는 생성된 BA를 분해시키는 균주도 있는 만큼(37) 막걸리의 BA의 형성과 BA 형성 균주 및 이를 분해시킬 수 있는 균주에 대한 연구가 이루어져야 할 필요가 있다.
그리고 E와 K 막걸리는 생막걸리임에도 불구하고 20℃에서 10일 동안 저장했을 때에도 histamine이 검출되지 않은 것은 매우 바람직한 결과이며 원료 및 제조공정 표준화에 따라서 막걸리의 품질 향상을 크게 기대할 수 있다는 사실을 시사한다. 현재 막걸리 제품의 유통기한은 따로 정해진 것이 없이 제조사가 정하는 것이지만 이에 대한 객관적인 지침이 필요하며, 특히 외부 기온 및 유통방법에 따라 차별화되어야 할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	막걸리의 미생물은 무엇이 있습니까?	막걸리 미생물로는, 막걸리 누룩에서 Aspergillus oryzae, A. niger, A. kawachii, A. shirousamii, Saccharomyces cerevisiae, Rhizopus tritici 등 여러 누룩곰팡이와 효모들이 분리되었고(7-15), 막걸리에서 Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus, P. damnosus, Lactobacillus plantarum, L. murinus, L. coprophilus, L. collinoides, L. brevis, L. casei, Lactococcus lactis subsp. lactis, Enterococcus faecium 등의 다양한 유산균이 분리되었다(8,10,13,14,16-19). Jin 등(18)과 Kim 등(19)은 15종의 시판 막걸리에서 16S rRNA 유전자 sequencing을 통해 7종의 Lactobacillus (L. paracasei, L. arizonensis, L. plantarum, L. harbinensis, L. parabuchneri, L. brevis, L. hilgardii) 유산균을 동정하였다. Min 등(20)과 Kim 등(21)은 막걸리를 4℃와 20℃로 저장하면서 효모와 유산균의 변화를 확인한 결과, 4℃에서는 미생물의 수는 유지되고 P.
	막걸리란?	막걸리는 쌀을 주원료로 하고 누룩을 종균 배양하여 발효시킨 뒤 여과과정 없이 혼탁하게 거른 술로써, 이 중 누룩은 각종 효소와 함께 자연 발생한 곰팡이, 효모, 세균을 비롯한 발효 미생물의 급원이 된다(1,2). 막걸리는 알코올 발효 과정만을 거치는 와인과 달리 누룩의 곰팡이에 의한 전분의 당화과정과 효모에 의한 알코올 발효가 동시에 일어나는 이중 발효 과정을 거쳐 제조된다(3).
	막걸리 제조 특성은?	막걸리는 쌀을 주원료로 하고 누룩을 종균 배양하여 발효시킨 뒤 여과과정 없이 혼탁하게 거른 술로써, 이 중 누룩은 각종 효소와 함께 자연 발생한 곰팡이, 효모, 세균을 비롯한 발효 미생물의 급원이 된다(1,2). 막걸리는 알코올 발효 과정만을 거치는 와인과 달리 누룩의 곰팡이에 의한 전분의 당화과정과 효모에 의한 알코올 발효가 동시에 일어나는 이중 발효 과정을 거쳐 제조된다(3). 하지만 시판 막걸리는 쌀 이외에도 밀, 옥수수, 고구마 등의 다양한 전분 원료를 사용하며, 누룩 이외에도 효모, 고지 등을 첨가하여 발효시키기도 하고, 과일이나 약초를 첨가하기도 한다(4-6).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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