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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 국내에서 다소비 되는 십자화과 새싹채소 7종(콜라비, 무순, 배추, 적무, 브로콜리, 다채 및 유채)의 in vitro 항산화활성과 3T3-L1 전지방세포에서 ROS 생성 저감 활성을 평가하였다.
- 본 연구에서는 국내에서 다소비 되는 십자화과 새싹채소 7종(콜라비, 적무, 브로콜리, 배추, 유채, 무순 및 다채)의 항산화 및 지방세포 내 ROS 생성 억제 활성을 측정하였다. 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 총 페놀 함량은 콜라비 새싹과 무순 추출물이 23.
제안 방법
- 2일 후 지방세포 분화유도 물질(10 μg/mL insulin, 1 μM DEX, 0.5 mM IBMX)과 FBS(10%) 및 P/S(1%) 를 함유한 DMEM으로 전지방세포를 지방세포로 분화유도하였다.
- 이러한 산화적 스트레스는 지방세포의 분화 및 지방의 축적과 밀접한 관계를 갖는 것으로 알려져 있다(13,21). 3T3-L1 전지방세포에 분화 유도 물질을 처리하여 지방세포로 분화 시킨 뒤 생성된 ROS 생성량을 측정하기 위하여 NBT assay를 이용하여 측정한 결과는 Fig. 3과 같다. 양성대조군으로 사용된 NAC는 thiol기를 포함하는 화합물로서 glutathione(GSH)의 전구체이며 천연 항산화제 중 하나로 잘 알려져 있다(22).
- 3T3-L1 지방세포에 대한 십자화과 새싹채소 추출물의 세포독성 평가는 Hanks와 Brent(12)의 방법을 변형하여 XTT assay kit를 이용하여 측정하였다. 3T3-L1 지방세포는 실험 전날 1×106 cell 농도로 96-well plate에 seeding 하고 시료를 100 μg/mL 농도로 처리하여 24시간 동안 37℃ CO2 incubator에서 배양하였다.
- Black well plate에 시료 25 μL와 40 nM fluorescein 150 μL을 첨가하고 측정 직전에 37℃에서 15분간 정치하고 150 mM AAPH 25 μL를 첨가한 후 fluorescence microplate reader(Spectramax GEMINI EM, Molecular Devices)를 이용하여 485 nm에서 전자여기 후 535 nm에서 방출되는 조건으로 37℃에서 90분간 3분마다 fluorescence의 감소율을 측정하였다.
- 이를 96-well medium 부피의 20%가 되는 양 만큼을 각각의 well에 첨가하여 혼합하였다. CO2 incubator에서 4시간 동안 배양 후, microplate reader를 이용하여 690 nm 흡광도 값에서 450nm의 흡광도 값을 뺀 결과 값으로 세포독성을 계산하였다.
- DPPH free radical 소거능은 Abdille 등(10)의 방법을 변형하여 시료의 항산화활성을 비교하였다. 시료 0.
- 4)에 녹여 peroxy radical의 생성과 소멸에 의한 fluorescent의 감소율을 측정하였다. Peroxy radical의 생성을 위해 AAPH를 사용하였고, 표준물질로 trolox를 사용하여 Ou 등(11)의 방법을 응용하여 ORAC value를 평가하였다. Black well plate에 시료 25 μL와 40 nM fluorescein 150 μL을 첨가하고 측정 직전에 37℃에서 15분간 정치하고 150 mM AAPH 25 μL를 첨가한 후 fluorescence microplate reader(Spectramax GEMINI EM, Molecular Devices)를 이용하여 485 nm에서 전자여기 후 535 nm에서 방출되는 조건으로 37℃에서 90분간 3분마다 fluorescence의 감소율을 측정하였다.
- 1 mg/mL의 농도로 제조한 시료 1 mL, 10% Folin-Ciocaltueu's reagent 1 mL과 2% sodium carbonate 용액 1 mL을 혼합하여 1시간 반응 시킨 후 microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. Tannic acid를 이용하여 표준검량선을 작성하였고, 이로부터 시료의 총 페놀 함량(mg tannic acid equivalent/g)을 산출하였다.
- 4)를 이용하여 2회 여과한 후 하루 동안 정치시킨 뒤 다시 한 번 여과하였다. 그 후 회전식 감압농축기(EYELA N-000, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축시킨 뒤, 동결건조기(FD5510 SPT, Ilshin, Seoul, Korea)를 이용하여 동결건조 하여 추출물을 제조하였다.
- 동결건조 된 7종의 새싹채소 추출물을 75 mM phosphate buffer(pH 7.4)에 녹여 peroxy radical의 생성과 소멸에 의한 fluorescent의 감소율을 측정하였다. Peroxy radical의 생성을 위해 AAPH를 사용하였고, 표준물질로 trolox를 사용하여 Ou 등(11)의 방법을 응용하여 ORAC value를 평가하였다.
- 이들 새싹채소의 항산화활성 평가를 위하여 다음의 방법에 따라 추출물을 제조하였다. 동결건조 후 분쇄된 새싹채소의 100배에 해당하는 80%에탄올을 가한 후, 실온에서 18시간 이상 일정 속도로 교반 하여 추출하였다. 그 후 추출액은 여과지(Whatman filter paper No.
- 본 연구에서는 십자화과 새싹채소 7종 추출물을 이용하여 전자전달을 이용한 항산화활성 측정과 수소전자의 전달을 이용한 항산화활성 측정 두 가지를 함께 진행하여 새싹 7종 사이의 항산화활성을 비교·분석 하였다(Fig. 1).
- 본 연구에서 사용한 십자화과 새싹채소인 콜라비, 적무, 브로콜리, 배추, 유채, 무순 및 다채는 한국식품연구원으로부터 제공받아 사용하였다. 이들 새싹채소의 항산화활성 평가를 위하여 다음의 방법에 따라 추출물을 제조하였다. 동결건조 후 분쇄된 새싹채소의 100배에 해당하는 80%에탄올을 가한 후, 실온에서 18시간 이상 일정 속도로 교반 하여 추출하였다.
- 지방세포 분화(day 0)시 DMEM에 새싹채소 7종 추출물을 각각 100 μg/mL의 농도로 처리하였고, 이때 시료의 효과를 관찰하기 위하여 음성 대조군(negative control)에는 아무것도 처리하지 않았으며, 양성 대조군(positive control)에는 항산화제인 NAC(5 mM)를 처리하여 비교하였다.
- 지방세포의 분화는 분화유도 물질을 처리한 후, 2일마다 지속적으로 10 μg/mL insulin, 1% P/S, 10% FBS가 함유된 배지에 각각의 시료를 처리하여 배양하였다.
- 총 페놀 함량은 Folin-Ciocaluteau의 방법(8)을 변형하여 측정하였다. 1 mg/mL의 농도로 제조한 시료 1 mL, 10% Folin-Ciocaltueu's reagent 1 mL과 2% sodium carbonate 용액 1 mL을 혼합하여 1시간 반응 시킨 후 microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 총 플라보노이드 함량 측정은 Moreno 등(9)의 방법을 변형하여 측정하였다. 1 mg/mL의 농도로 제조 한 시료 1mL에 4 mL의 double distilled water(DDW)와 0.
- Black well plate에 시료 25 μL와 40 nM fluorescein 150 μL을 첨가하고 측정 직전에 37℃에서 15분간 정치하고 150 mM AAPH 25 μL를 첨가한 후 fluorescence microplate reader(Spectramax GEMINI EM, Molecular Devices)를 이용하여 485 nm에서 전자여기 후 535 nm에서 방출되는 조건으로 37℃에서 90분간 3분마다 fluorescence의 감소율을 측정하였다. 표준물질인 trolox를 이용하여 the area under the curve(AUC)를 구하고 이로 표준검량선(y=1.1713x+0.266)을 작성하여 시료의 peroxy radical 저해능을 정량하였다.
대상 데이터
- 마우스 유래 지방세포 3T3-L1 세포주는 American type culture collection(ATCC, CL-173, Manassas, VA, USA)로부터 분양받아 사용하였다. 실험에 사용된 시약인 folin & ciocalteu's phenol reagent, sodium nitrite, aluminium chloride, sodium hydroxide, catechin, 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl(DPPH), potassium persulfate, 6-hydroxy2,5,7,8-tetramethlychroman-2-carboxylic acid(Trolox), 2,2'-azobis (2-methylpropionamidine) dihychloride(AAPH), 3- isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), nitrotetrazolium blue chloride(NBT), dexamethasone(DEX), quercetion, ascorbic acid, gallic acid, N-acetyl-L-cysteine(NAC), trichloroacetic acid(TCA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS), potassium ferricyanide, sodium carbonate, 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ), potassium persulfate, insulin, acetic acid 등은 Sigma(sigma-aldrich Co.
- 본 연구에서 사용한 십자화과 새싹채소인 콜라비, 적무, 브로콜리, 배추, 유채, 무순 및 다채는 한국식품연구원으로부터 제공받아 사용하였다. 이들 새싹채소의 항산화활성 평가를 위하여 다음의 방법에 따라 추출물을 제조하였다.
- 실험에 사용된 시약인 folin & ciocalteu's phenol reagent, sodium nitrite, aluminium chloride, sodium hydroxide, catechin, 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl(DPPH), potassium persulfate, 6-hydroxy2,5,7,8-tetramethlychroman-2-carboxylic acid(Trolox), 2,2'-azobis (2-methylpropionamidine) dihychloride(AAPH), 3- isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), nitrotetrazolium blue chloride(NBT), dexamethasone(DEX), quercetion, ascorbic acid, gallic acid, N-acetyl-L-cysteine(NAC), trichloroacetic acid(TCA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS), potassium ferricyanide, sodium carbonate, 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ), potassium persulfate, insulin, acetic acid 등은 Sigma(sigma-aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), bovine serum(BS), fetal bovine serum(FBS), phosphate-buffered saline(PBS), penicillinstreptomycin(P/S) 및 trypsin-EDTA는 Gibco(Gaithersburg, MD, USA)로부터 구입하였으며, XTT{2,3-bis(2-methoxy4-nitro-5-sulfophenyl)-2H- tetrazolium-5-carboxanilide innersalt)} assay kit는 WelGene(Seoul, Korea)로부터 구입하였고, fluorescein sodium salt는 Junsei(Junsei Chemical Co., Tokyo, Japan)로부터 사용하였다.
- DDW로 총 부피를 10 mL로 맞춘 후 microplate reader를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 catechin을 사용하였으며, 시료의 총 플라보노이드 함량은 작성된 표준곡선을 이용하여 catechin에 상응하는 양(mg catechin equivalent/g)으로 환산하였다.
데이터처리
- Statistical analysis was performed by the one-way ANOVA (p<0.05).
- 모든 실험은 세 번 이상 반복하였으며, 결과의 통계처리는 SAS(9.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 분석하였다. 유의성 분석은 one-way ANOVA 검정을 실시하고 Duncan의 다중검정법(Duncan's multiple range test)으로 유의성은 p<0.
- 유의성 분석은 one-way ANOVA 검정을 실시하고 Duncan의 다중검정법(Duncan's multiple range test)으로 유의성은 p<0.05 수준에서 검정하였다.
이론/모형
- Cell viability was determined by XTT assay. Each value is the mean±SD of the results from five different plates (n=5) and is representative of results from at least two different experiments.
성능/효과
- 100 μg/mL의 농도로 십자화과 새싹채소 7종 추출물을 처리한 후 실험을 진행한 결과, 다채를 제외한 6종에서는 독성이 나타나지 않았다.
- DPPH radical 소거능과 ORAC value를 측정한 결과, 콜라비가 DPPH radical 소거능(IC50=1.95 mg/mL)과 ORAC value(79,032.5 μM TE/g)에서 모두 항산화능이 뛰어난 것으로 나타났다.
- DPPH radical 소거능의 경우 각 시료의 소거능을 측정한 후 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 시료의 농도(inhibition concentration 50, IC50)로 나타내었다. 그 결과 콜라비 새싹 추출물(IC50=1.95 mg/mL)이 가장 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보였고 적무(IC50=2.90 mg/mL)와 무순(IC50=3.09 mg/mL) 새싹 추출물 순으로 나타났다. ORAC value의 경우 콜라비 새싹 추출물이 79.
- 이상의 결과를 볼 때, 콜라비 새싹 추출물의 경우 DPPH radical 소거능과 ORAC 효능 평가에서 모두 높은 항산화활성을 나타내었고, DPPH는 적무 새싹 추출물이, ORAC은 배추 새싹 추출물이 각각 두 번째로 항산화활성이 높게 나타났다. 무순 추출물 또한 DPPH radical 소거능과 ORAC 효능이 우수한 것으로 나타났다.
- 무순 추출물의 총 페놀 함량이 24.40±1.24 mg TAE/g으로 가장 낮은 브로콜리 새싹 추출물(18.30±0.80 mg TAE/g)에 비해 약 1.3배 높은 것으로 나타났다.
- 양성대조군으로 사용된 NAC는 thiol기를 포함하는 화합물로서 glutathione(GSH)의 전구체이며 천연 항산화제 중 하나로 잘 알려져 있다(22). 시료를 처리하지 않은 대조군과 십자화과 새싹채소 7종 추출물의 흡광도를 비교한 결과 다채 새싹 추출물을 제외한 콜라비 새싹, 적무 새싹, 브로콜리 새싹, 배추 새싹, 유채 새싹 및 무순 추출물 6종에서 모두 ROS 생성을 저감하는 것으로 나타났다. 다채 새싹 추출물의 경우는 control과 유의적 차이가 없었다.
- 36 mM TE/g) 추출물의 순서로 나타났다. 이상의 결과를 볼 때, 콜라비 새싹 추출물의 경우 DPPH radical 소거능과 ORAC 효능 평가에서 모두 높은 항산화활성을 나타내었고, DPPH는 적무 새싹 추출물이, ORAC은 배추 새싹 추출물이 각각 두 번째로 항산화활성이 높게 나타났다. 무순 추출물 또한 DPPH radical 소거능과 ORAC 효능이 우수한 것으로 나타났다.
- 이상의 결과를 통해 지방세포의 분화과정에서 콜라비, 적무, 브로콜리, 배추, 유채 및 무순 추출물의 처리는 지방세포 내 ROS의 생성을 억제하는 것으로 나타났다. 세포 내 산화적 스트레스는 지방세포의 분화 및 지방의 축적과 밀접한 관계를 갖는 것으로 알려져 있는데, 에너지대사 경로에 의해 생성된 NADPH는 NADPH Oxidase 4(NOX4)에 의하여 세포 내 superoxide를 생성한다.
- 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 총 페놀 함량은 콜라비 새싹과 무순 추출물이 23.97±0.46 mg TAE/g 및 24.40±1.24 mg TAE/g으로 유의적으로 가장 높은 값을 나타내었고, 총 플라보노이드 함량은 무순 추출물이 15.30±1.35 mg CE/g으로 다른 새싹채소 추출물에 비해 높은 값을 나타내었다.
- 37 mg CE/g으로 높은 값을 나타내었다. 총 페놀의 경우 무순과 콜라비 새싹 추출물이 유의적 차이가 없었지만 총 플라보노이드의 경우 무순추출물이 유채와 콜라비 새싹 추출물 보다 유의적으로 높게 나타났다. 플라보노이드는 페놀성 화합물로, 시료간의 유의성 차이가 비슷한 경향을 나타내는 경우가 많으며, 서양민들레의 부위별 추출물의 총 페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 분석한 Chon 등(17)의 연구와 같이 두 함량 사이의 상관계수(R2)가 0.
- 총 플라보노이드 함량의 분석 결과, 무순 추출물이 15.30±1.35 mgCE/g으로 가장 높은 결과를 나타냈고, 유채와 콜라비 새싹 추출물이 각각 13.34±0.58 및 13.08±0.37 mg CE/g으로 높은 값을 나타내었다.
- 콜라비 새싹 추출물의 총 페놀 함량이 23.97±0.46 mg TAE/g으로 높게 나타났으며 유채 새싹 추출물(22.17±0.18 mg TAE/g), 적무 새싹 추출물 (21.83±0.34 mg TAE/g), 다채 새싹 추출물(20.68±0.1 mg TAE/g), 배추 새싹 추출물(19.02±0.51 mg TAE/g) 및 브로콜리 새싹 추출물 순으로 총 페놀 함량을 나타냈다.
- 5 μM TE/g)에서 모두 항산화능이 뛰어난 것으로 나타났다. 한편, 다채를 제외한 새싹 채소 추출물 6종 모두에서 세포 내 ROS 생성량을 감소시킴을 확인하였다. 이상의 결과로부터, 십자화과 새싹채소 중 콜라비 새싹과 무순 추출물의 경우 항산화활성 및 지방세포내 ROS 생성 억제 활성을 가지며, 천연물 유래 항산화 소재로써 활용 가능성이 높은 것으로 기대된다.
후속연구
- 한편, 다채를 제외한 새싹 채소 추출물 6종 모두에서 세포 내 ROS 생성량을 감소시킴을 확인하였다. 이상의 결과로부터, 십자화과 새싹채소 중 콜라비 새싹과 무순 추출물의 경우 항산화활성 및 지방세포내 ROS 생성 억제 활성을 가지며, 천연물 유래 항산화 소재로써 활용 가능성이 높은 것으로 기대된다.
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