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문제 정의
- 본 실험에서는 최근 연구결과에서 항염증에 효과를 보인 약재들을 재구성한 청기해독탕의 AD 개선을 통한 항염증 효과를 실험적으로 입증하여 임상에서의 활용성을 제고함과 동시에 향 후 보다 효과적인 한의학적 치료제 개발을 위한 기초적 자료를 제공하고자 하였다. 실험은 RAW 264.
- 본 연구에서는 아토피피부염 동물 병태 모델을 통해 청기해독탕(CGT)의 항염증을 효과를 알아보고자 세포를 이용한 독성평가, NO의 억제능 측정 및 ROS 측정과 염증성 질환인 AD를 유발시킨 NC/Nga 생쥐를 이용하여 혈청 내 사이토카인, 면역글로불린 측정 및 조직변화 등을 통하여 확인하였다.
제안 방법
- 1% DNCB 용액 (아세톤 : 올리브 오일 = 3:1) 200 μl를 등 부위에 2주간 도포하고, 그 이후부터는 1주일에 3번씩 0.1% DNCB용액 150 μl를 4주간 등 부위에 도포하였다.
- NO의 농도는 배양액 내의 nitric oxide 농도를 griess reagent system을 이용하여 측정하였다. RAW 264.
- N1 buffer와 N2 buffer를 각각 10분 간 반응 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.
- RAW 264.7 세포를 96 well plate에 2×104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양 한 후 새로운 배양액으로 교체하였고 CGT를 각각 1, 10, 100 (μg/ml)의 농도와 LPS 1 μg/ml의 농도를 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다.
- 배양 후 10 μl의 EZ-cytox solution을 첨가하여 세포배양기 (37℃, 5% CO2)에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450 nm에서 ELISA reader기를 이용해 흡광도의 변화를 측정한 후 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시 하였다.
- 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였고 CGT를 각각 1, 10, 100 (μg/ml)의 농도와 LPS 1 μg/ml의 농도를 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다.
- 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였고 CGT를 각각 1, 10, 100 (μg/ml)의 농도와 LPS 1 μg/ml의 농도를 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 DCF-DA로 염색 한 후 유세포 분석기를 이용하여 형광 강도의 세기에 따른 변화를 분석하였다.
- 분리된 혈청을 가지고 IL-1β, IL-6, TNF-α는 custom-made 6-plex cytokine Milliplex panel을 이용하여 Luminex로 측정하였으며, IgE 생성량의 측정은 ELISA kit를 이용하여 ELISA reader 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 새로운 배양액으로 교체하였고, CGT를 각각 1, 10, 100 (μg/ml)의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다.
- 실험은 4개의 군으로 나누었으며 매일 1회, 오후 2시에 정상군, 대조군에는 증류수를, 양성대조군인 dexamethasone (이하, Dexa) 투여군과 CGT 투여군은 각각 200 μl (200 mg/kg) 씩 경구 투여하였으며, 실험이 진행되는 동안 자유 식이를 하였다.
- 본 실험에서는 최근 연구결과에서 항염증에 효과를 보인 약재들을 재구성한 청기해독탕의 AD 개선을 통한 항염증 효과를 실험적으로 입증하여 임상에서의 활용성을 제고함과 동시에 향 후 보다 효과적인 한의학적 치료제 개발을 위한 기초적 자료를 제공하고자 하였다. 실험은 RAW 264.7 cell을 이용한 항염증 및 항산화 검사와 AD 유발 동물모델인 NC/Nga 생쥐에 청기해독탕을 투여한 후 혈청에서 염증성 인자에 미치는 영향, 혈청 내 면역글로불린, 조직학적 변화 등을 확인하였다.
- 이와 같은 in vitro의 실험 결과를 바탕으로 in vivo 실험을 위해 NC/Nga 생쥐에 DNCB를 처리하여 AD를 유발시킨 후 4주 간 CGT를 200μl (200 mg/kg)씩 경구 투여하였다.
- 제작된 블럭은 박편절단기 (microtome)를 이용해 3∼4 μm 두께로 절편을 만들어 탈 파라핀 및 함수과정을 거친 다음 hematoxyline과 eosin (H&E) 염색을 각각 실시하여 광학현미경상에서 관찰 및 사진 촬영 하였다.
- 배부의 피부를 떼어내어 각 실험군 별로 적출한 조직은 10% 중성 포르말린에 48시간 고정하여 고정이 완료된 조직들을 흐르는 수돗물에서 12시간 수세한 뒤 조직 내의 고정액을 완전 제거하였다. 조직의 탈수를 위해 60%에서부터 100% 알코올에 이르기까지 농도 상승 순으로 탈수하고, xylene에 투명과정을 거친 다음 파라핀 블럭을 제작하였다. 제작된 블럭은 박편절단기 (microtome)를 이용해 3∼4 μm 두께로 절편을 만들어 탈 파라핀 및 함수과정을 거친 다음 hematoxyline과 eosin (H&E) 염색을 각각 실시하여 광학현미경상에서 관찰 및 사진 촬영 하였다.
대상 데이터
- 7주령이 된 NC/Nga 생쥐의 등 부위를 제모한 후 24시간 방치하였다. 1% DNCB 용액 (아세톤 : 올리브 오일 = 3:1) 200 μl를 등 부위에 2주간 도포하고, 그 이후부터는 1주일에 3번씩 0.
- The panels were representative photomicrographs of each of these risk at light microscope (Zeiss, ×200).
- 본 실험에 사용한 청기해독탕 (Chenggihaedok-tang 이하 CGT로 표기)의 구성 약재들은 ㈜옴니허브에서 구입하였고, 대전대학교 지역혁신센터 난치성 면역질환의 동서생명의학 연구센터 (TBRC)에서 자초, 금은화, 고삼 각 30 g, 사매, 인진, 어성초 각 20 g, 황백 10 g, 감초 4 g을 정선 후 사용하였다.
- 사용된 시약은 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM : Gibco BRL Co., U.S.A.), 우태아혈청 (fetal bovine serum: FBS, Invitrogen Co., U.S.A.), lipopolysaccharide (LPS : Sigma Co., U.S.A.), cell viability assay kit (Daeillab service, Korea), nitric oxide detection kit (Intron Biotechnology, Korea), penicillin (Hyclone, Co., U.S.A.), mouse cytokine milliplex map immunoassay kit (Millipore Co., U.S.A.), Mouse IgE ELISA kit (eBioscience CO., USA)을 사용하였으며, 기기는 rotary vacuum evaporator (Büchi B-480 Co., Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU-540 Co., Japan), spectrophotometer (Shimadzu Co., Japan), ELISA reader (Molecular Devices Co., U.S.A.), Flow cytometry system (BD Biosciences immunocytometry systems., U.S.A.) 등을 사용하였다.
- 실험동물인 수컷 4주령의 NC/Nga Mice (16∼22 g)는 ㈜오리엔트바이오에서 공급 받아 실험 당일까지 고형사료 (㈜퓨리나)와 물을 충분히 공급하고 온도 22 ± 2℃, 습도 55 ± 15%, 12시간 - 12시간 (light-dark cycle)의 환경에서 2주간 적응 시킨 후 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 한국 세포주 은행에서 구입하였다. 동결된 RAW 264.
데이터처리
- 실험 결과는 실험 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's T-test 및 ANOVA-test를 사용하여 통계처리하였으며 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 수준에서 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- AD가 발생하면 IgE 수치가 급격히 증가함을 보이는데 본 실험에서 CGT 투여 종료 후 혈청을 통해 IgE를 측정한 결과, 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 보였다.
- CGT 주정 추출물의 ROS 생성 저해 활성을 측정한 결과, 대조군을 100.0±1.0%로 나타냈을 때 정상군은 31.80±1.6%, CGT 추출물군은 1 μg/ml 농도에서 85.97±1.9%, 10 μg/ml 농도에서 71.49±3.9%, 100 μg/ml 농도에서 69.55±4.0%로 나타내, 대조군에 비하여 모든 농도에서 유의성 있는 (*** : p <0.001) 감소를 보였다[Fig. 3].
- CGT 투여 종료 후에 혈청 내 IgE를 측정한 결과, 대조군은 219.7 ± 7.8 ng/ml에 비하여 CGT 투여군은 95.6 ± 4.2 ng/ml로 나타나, 대조군에 비하여 유의성 있는(** : p <0.01) 감소를 보였다[Fig. 5].
- CGT가 아토피피부염이 유발된 NC/Nga 생쥐에서 혈청 내 사이토카인에 미치는 영향을 알아보기 위해 조사한 결과, IL-1β는 대조군이 21.4±1.5 MFI에 비하여 CGT 투여군은 10.0±0.9 MFI로 나타나, 대조군에 비하여 유의성 있는 (* : p <0.05) 감소를 보였으며, IL-6 역시 대조군이 418.1±11.8 MFI에 비하여, CGT 투여군은 116.7±9.4 MFI로 나타나, 대조군에 비하여 유의성 있는 (* : p<0.05) 감소를 보였다.
- RAW 264.7 세포의 세포 생존율을 측정한 결과, 대조군을 100.0±1.0%로 나타냈을 때 CGT 투여군 1, 10, 100 (μg/ml) 농도에서 110.3±3.1%, 111.0±1.1%, 101.0±3.7%의 세포 생존율을 나타내었다[Fig. 1].
- RAW 264.7 세포주에서 CGT 추출물의 NO 생성량을 측정한 결과, 대조군을 100.0±3.1%로 나타냈을 때 정상군은 34.7±3.2%, CGT 투여군은 1 μg/ml 농도에서 104.9±2.0%, 10 μg/ml 농도에서 103.1±1.0%, 100 μg/ml 농도에서 92.8±2.6%로 나타났으며, 대조군에 비하여 100 μg/ml 농도에서 유의성 있는 (*** : p <0.001) 감소를 보였다[Fig. 2].
- TNF-α는 대조군은 99.2±8.3 MFI에 비하여, CGT 투여군은 49.4±1.9 MFI로 나타나, CGT 투여군에서 대조군에 비하여 유의성 있는(* : p <0.05) 감소를 보였다[Fig. 4].
- 마지막으로 조직학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 H&E 염색을 실시한 결과 대조군은 등 조직을 촬영한 결과 피부가 두꺼워졌고, 세포의 침윤으로 인한 세포의 밀도가 높게 나타났다.
- 본 실험에서 혈청 내 IL-1β 사이토카인은 대조군에 비하여 CGT 투여군에서 유의성있는 감소를 보였다.
- IL-6은 염증 반응시 분비되는 친 염증성 사이토카인으로, helper T세포, 대식세포, 비만세포, 중성구, 상피세포, 섬유아세포 등에서 분비되어 면역반응, 조혈, 염증을 조절 한다[16]. 본 실험에서 혈청 내 IL-6 사이토카인은 대조군에 비하여 CGT 투여군에서 유의성 있는 감소를 보였다.
- 또한, IL-𝝱 1과 유사한 기능으로 서로의 생산을 유도하고, 생체 내에서 상승작용을 일으킨다고 보고 되어있다[16]. 본 실험에서 혈청 내 TNF-𝝰 사이토카인은 대조군에 비하여 CGT 투여군에서 유의성 있는 감소를 보였다.
- 본 실험에서는 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에 CGT를 처리하여 NO 생성 억제능과 세포 내 ROS를 측정한 결과, NO 생성 억제능은 대조군에 비하여 100 μg/ml의 농도에서 유의성 있는 NO 생성 저해 효능이 나타났으며 ROS는 대조군에 비하여 모든 농도에서 유의성 있는 ROS 생성 저해 효능이 나타났다.
- 본 연구에 앞서 실험에 대한 안전성을 확인하기 위해 세포독성을 평가한 결과, CGT가 100% 이상의 세포 생존율을 나타내어 안전한 것으로 나타나 안전성을 나타내었다.
- 7 세포에 CGT를 처리하여 NO 생성 억제능과 세포 내 ROS를 측정한 결과, NO 생성 억제능은 대조군에 비하여 100 μg/ml의 농도에서 유의성 있는 NO 생성 저해 효능이 나타났으며 ROS는 대조군에 비하여 모든 농도에서 유의성 있는 ROS 생성 저해 효능이 나타났다. 이와 같은 결과는 CGT가 NO와 ROS에 효과를 보임으로써 항염증뿐만 아니라 항산화를 통해 염증 반응을 억제시키는 것으로 나타났다
후속연구
- 위의 결과를 종합해 볼 때, 본 실험에서 사용한 CGT가 NO 생성 억제능 및 세포 내 ROS 측정을 통해 항염증 및 항산화에 효과가 있다고 기대가 되며, 염증의 대표적인 질환인 AD에서 CGT의 투여가 NC/Nga 생쥐의 면역글로불린, 혈청 사이토카인, 조직학적 변화 등에서 유의성 있는 결과가 확인됨에 따라 CGT가 EBM(Evidence-based medicine) 구축에 일조할 것으로 사료되는 바이다.
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