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문제 정의
- 우리나라에서 새로운 기주식물로 처음 밝혀진 인삼에 발생하는 WMV의 전염 특성과 생태는 아직 밝혀진 바 없다. 따라서 본 연구에서는 인삼에서 이 바이러스병의 진딧물 전염과 즙액전염의 특성을 밝힘으로써 예방대책을 수립하는 기초자료로 활용하고자 수행하였다.
제안 방법
- RT-PCR의 primer는 WMV의 특이적 유전자 부위인 613 bp를 합성할 수 있도록 설계되었으며 RT-PCR 진단에 사용된 프라이머들은 WMV2-N40(5’-GTTTAACACTCGAGCAA-3’)와 WMV2-C20(5’-CTTATAACGACCCGAAATGCTA)이었다. RT-PCR 조건은 42℃ 1시간 역전사 반응 및 94℃ 5분 동안 변성 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 60초 과정을 35회 반복하였고 최종 72℃ 10분 동안 반응을 시켰다. 합성된 RT-PCR 산물은 0.
- RT-PCR의 primer는 WMV의 특이적 유전자 부위인 613 bp를 합성할 수 있도록 설계되었으며 RT-PCR 진단에 사용된 프라이머들은 WMV2-N40(5’-GTTTAACACTCGAGCAA-3’)와 WMV2-C20(5’-CTTATAACGACCCGAAATGCTA)이었다.
- persicae vector acquired WMV from infected zucchini (A) and ginseng plants (B) and the aphid vector transmitted the virus to healthy ginseng plants. The aphids were grown in paprika plants and the plants were placed in the ginseng growing plots designed to investigate whether or not Korean ginseng was infected by aphid transmission of WMV isolates. The virus was detected using RT-PCR analysis and electron microscopy.
- WMV-gin에 감염된 인삼 잎과 WMV-wm에 감염된 쥬키니 잎을 10 mM 인산완충액(pH7.2)을 넣은 후 마쇄(1/10, w/v)하여 인삼, 호박, 오이, 수박 등의 검정식물에 600 mesh Carborundum®을 뿌린 후 즙액 접종하였다.
- WMV의 기주작물로 수박을 재배하는 인근 포장에서 인삼 식물체에 이 바이러스의 발병여부를 조사하였다. 전북 고창군에서 WMV 발생이 확인된 수박재배 포장의 인접 인삼 포장을 2013년 8월 20일에 선정하였다.
- 면적의 셀로 구획하였다. 각각의 셀에서 생육하고 있는 3년근 인삼을 대상으로 건전 인삼 식물체로 유시 복숭아혹진딧물이 WMV를 매개하는지 연구를 수행하였으며, WMV 감염 여부는 RT-PCR법으로 검정하였다(Fig. 1). 처리구 A 셀에서는 복숭아혹진딧물이 다량 증식한 파프리카 식물체의 주변에 WMV-wm이 감염된 쥬키니 식물체를 배치하였다.
- 무시 진딧물로 접종한 인삼은 차광막이 설치한 망실, 박과작물은 격리 온실에 보존하면서 병징의 발현여부 및 감염여부를 조사하였다. 또한 3년근 인삼이 생육하는 시험 포장 내에서 유시 복숭아혹진딧물의 전염을 조사하였다. 유시 진딧물의 유기는 파프리카에서 높은 밀도로 증식한 무시 진딧물이 유시충으로 자연적으로 전환되게 하였다.
- 진딧물이 증식한 1개 파프리카 포트와 WMV-wm이 감염된 쥬키니 3개의 포트를 인삼 생육 포장에 배치하여 3년근 인삼으로 이 바이러스의 전염 확산을 조사하였다. 또한 다른 인삼 포장 시험구에는 WMV-gin이 감염된 1주의 인삼 식물체에서 30 cm 떨어진 곳에 복숭아혹진딧물이 다량 증식한 파프리카 식물체 1주를 배치 후, 바이러스의 확산 여부를 조사하였다. 한편 WMV-wm의 감염이 100% 확인된 인삼 포장의 가장자리에 쥬키니 25주를 정식하여 복숭아혹진딧물이 감염 인삼에서 건전 쥬키니로 이 바이러스의 전이 여부를 조사하였다.
- 감염 식물에서 흡즙한 진딧물을 포트에서 생육하고 있는 건전 인삼 및 박과작물에 각각 검정 식물체 1주당 5마리를 옮긴 후, 다음 날 아세타미프라드 수화제를 살포하여 진딧물을 사멸시켰다. 무시 진딧물로 접종한 인삼은 차광막이 설치한 망실, 박과작물은 격리 온실에 보존하면서 병징의 발현여부 및 감염여부를 조사하였다. 또한 3년근 인삼이 생육하는 시험 포장 내에서 유시 복숭아혹진딧물의 전염을 조사하였다.
- 한편 WMV-wm의 감염이 100% 확인된 인삼 포장의 가장자리에 쥬키니 25주를 정식하여 복숭아혹진딧물이 감염 인삼에서 건전 쥬키니로 이 바이러스의 전이 여부를 조사하였다. 이들 각각 인삼 시험구의 면적은 60 m2이고 외부로부터 진딧물의 유입 방지와 인삼의 생육을 위하여 차광망과 방충망을 설치하였다.
- 복숭아혹진딧물은 건전 배추, 목화진딧물은 건전 쥬키니 식물체에서 각각 증식하였다. 이들 진딧물을 2-3시간 동안 절식시킨 후, WMV-gin 감염 인삼 및 WMV-wm 감염 쥬키니의 잎에서 10-15분 동안 흡즙을 하도록 하였다. 감염 식물에서 흡즙한 진딧물을 포트에서 생육하고 있는 건전 인삼 및 박과작물에 각각 검정 식물체 1주당 5마리를 옮긴 후, 다음 날 아세타미프라드 수화제를 살포하여 진딧물을 사멸시켰다.
- 2010년 풍기인삼시험장 시험포장의 인삼 잎에 엽맥 녹대 증상이 나타난 식물체를 표기한 후, 다음해인 2011년에 인삼 잎이 출현하기 직전에 3년근 인삼 뿌리 5 개체들을 캐어 포트에 옮겨 심었으며, 이들을 바이러스 전염원으로 사용하였다. 이식한 인삼의 생육조건은 외부로부터 진딧물의 유입을 차단한 23 메쉬 (mesh) 망실에 빛 투과율이 80%인 차광망을 설치하였다. WMV의 분리주명은 이 바이러스를 처음 동정된 기주에 따라 구분하여 인삼에 감염된 바이러스를 WMV-gin이라 명명하였으며, 농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 보존하고 있는 수박에서 분리한 WMV-wm를 대조 바이러스로 사용하였다.
- 인삼 잎과 보독 진딧물은 2% phosphototungstic acid로 염색하여 투과전자현미경(Carl Zeiss EM LEO 906E, Germany)를 이용하여 바이러스의 감염 및 보독 유무를 결정하였다. WMV의 특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR 검정에 사용된 검정 식물체와 진딧물의 전체 RNA는 식물체와 진딧물을 막자사발 내에서 액체질소로 마쇄한 후, RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, USA)를 사용하여 제조회사의 추천된 방법에 의해서 추출되었다.
- 절식한 복숭아혹진딧물과 목화진딧물을 각각 WMV-gin에 감염된 인삼 및 WMV-wm에 감염된 쥬기니의 잎에서 흡즙을 시킨 후 2년생 건전 인삼 및 쥬키니 호박 본엽에 각각 하나의 식물체당 진딧물 5마리를 인위적으로 접종하였다. 접종한 식물체에서 바이러스의 감염률은 접종 30일 후, RT-PCR과 전자현미경으로 바이러스의 감염여부를 분석하였다 (Table 2).
- 2)을 넣은 후 마쇄(1/10, w/v)하여 인삼, 호박, 오이, 수박 등의 검정식물에 600 mesh Carborundum®을 뿌린 후 즙액 접종하였다. 접종한 식물체는 격리 온실에 보존하면서 65일 동안 병징 발현 및 바이러스 감염 여부를 조사하였다.
- 절식한 복숭아혹진딧물과 목화진딧물을 각각 WMV-gin에 감염된 인삼 및 WMV-wm에 감염된 쥬기니의 잎에서 흡즙을 시킨 후 2년생 건전 인삼 및 쥬키니 호박 본엽에 각각 하나의 식물체당 진딧물 5마리를 인위적으로 접종하였다. 접종한 식물체에서 바이러스의 감염률은 접종 30일 후, RT-PCR과 전자현미경으로 바이러스의 감염여부를 분석하였다 (Table 2). WMV-gin 및 WMV-wm을 흡즙한 2종의 진딧물들은 건전 인삼 식물체에 20-70%, WMV-wm을 흡즙한 이들 진딧물은 쥬키니 식물체에 50-90%의 WMV 전염률을 보였다.
- 진딧물 외부 유입 방지와 인삼의 생육조건을 맞추기 위하여 차광망과 방충망이 설치한 60 m2 면적의 셀로 구획하였다. 각각의 셀에서 생육하고 있는 3년근 인삼을 대상으로 건전 인삼 식물체로 유시 복숭아혹진딧물이 WMV를 매개하는지 연구를 수행하였으며, WMV 감염 여부는 RT-PCR법으로 검정하였다(Fig.
- 유시 진딧물의 유기는 파프리카에서 높은 밀도로 증식한 무시 진딧물이 유시충으로 자연적으로 전환되게 하였다. 진딧물이 증식한 1개 파프리카 포트와 WMV-wm이 감염된 쥬키니 3개의 포트를 인삼 생육 포장에 배치하여 3년근 인삼으로 이 바이러스의 전염 확산을 조사하였다. 또한 다른 인삼 포장 시험구에는 WMV-gin이 감염된 1주의 인삼 식물체에서 30 cm 떨어진 곳에 복숭아혹진딧물이 다량 증식한 파프리카 식물체 1주를 배치 후, 바이러스의 확산 여부를 조사하였다.
- 1). 처리구 A 셀에서는 복숭아혹진딧물이 다량 증식한 파프리카 식물체의 주변에 WMV-wm이 감염된 쥬키니 식물체를 배치하였다. 배치 1개월 후인 5월 23일에 검정한 인삼 20주 중 12주(60%)이 WMV에 의해서 감염되었으며, 배치 2개월 후인 6월 26일에는 뿌리썩음병으로 고사한 1주를 제외하고 인삼이 100% 이병율을 보였다(Fig.
- 또한 다른 인삼 포장 시험구에는 WMV-gin이 감염된 1주의 인삼 식물체에서 30 cm 떨어진 곳에 복숭아혹진딧물이 다량 증식한 파프리카 식물체 1주를 배치 후, 바이러스의 확산 여부를 조사하였다. 한편 WMV-wm의 감염이 100% 확인된 인삼 포장의 가장자리에 쥬키니 25주를 정식하여 복숭아혹진딧물이 감염 인삼에서 건전 쥬키니로 이 바이러스의 전이 여부를 조사하였다. 이들 각각 인삼 시험구의 면적은 60 m2이고 외부로부터 진딧물의 유입 방지와 인삼의 생육을 위하여 차광망과 방충망을 설치하였다.
- 1A). 한편 처리구 B 셀은 WMV-gin이 감염된 인삼 식물체 주변에 A 셀과 동일한 조건의 파프리카 식물체를 배치한 후, WMV-gin의 전염을 검정하였다. 배치 1개월 후인 5월 23일에는 감염된 식물체가 없었으며, 배치 2개월 후인 6월 26일에는 4주(20%), 7월 23일에는 15주(75%) 인삼이 감염되었다(Fig.
- RT-PCR 조건은 42℃ 1시간 역전사 반응 및 94℃ 5분 동안 변성 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 60초 과정을 35회 반복하였고 최종 72℃ 10분 동안 반응을 시켰다. 합성된 RT-PCR 산물은 0.5X TBE 완충액을 이용하여 1.2% 아가로스 겔에서 전기 영동하여 자외선조사장치에서 확인하였다.
대상 데이터
- 2010년 풍기인삼시험장 시험포장의 인삼 잎에 엽맥 녹대 증상이 나타난 식물체를 표기한 후, 다음해인 2011년에 인삼 잎이 출현하기 직전에 3년근 인삼 뿌리 5 개체들을 캐어 포트에 옮겨 심었으며, 이들을 바이러스 전염원으로 사용하였다. 이식한 인삼의 생육조건은 외부로부터 진딧물의 유입을 차단한 23 메쉬 (mesh) 망실에 빛 투과율이 80%인 차광망을 설치하였다.
- 이식한 인삼의 생육조건은 외부로부터 진딧물의 유입을 차단한 23 메쉬 (mesh) 망실에 빛 투과율이 80%인 차광망을 설치하였다. WMV의 분리주명은 이 바이러스를 처음 동정된 기주에 따라 구분하여 인삼에 감염된 바이러스를 WMV-gin이라 명명하였으며, 농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 보존하고 있는 수박에서 분리한 WMV-wm를 대조 바이러스로 사용하였다.
- WMV의 기주작물로 수박을 재배하는 인근 포장에서 인삼 식물체에 이 바이러스의 발병여부를 조사하였다. 전북 고창군에서 WMV 발생이 확인된 수박재배 포장의 인접 인삼 포장을 2013년 8월 20일에 선정하였다. 이 시기는 인삼 잎에 바이러스 병징이 은폐되고 일부분의 잎이 황색으로 변색하는 생육 단계였다.
- 진딧물은 국립원예특작과학원에서 사육하고 있는 복숭아혹진딧물(Myzus persicae)과 목화진딧물(Aphis gossypii)을 WMV-gin 및 WMV-wm의 매개충으로 이용하였다. 복숭아혹진딧물은 건전 배추, 목화진딧물은 건전 쥬키니 식물체에서 각각 증식하였다.
성능/효과
- 접종한 식물체에서 바이러스의 감염률은 접종 30일 후, RT-PCR과 전자현미경으로 바이러스의 감염여부를 분석하였다 (Table 2). WMV-gin 및 WMV-wm을 흡즙한 2종의 진딧물들은 건전 인삼 식물체에 20-70%, WMV-wm을 흡즙한 이들 진딧물은 쥬키니 식물체에 50-90%의 WMV 전염률을 보였다. 그러나 WMV-gin이 감염된 인삼에서 흡즙한 복숭아혹진딧물 및 목화 진딧물은 건전한 쥬키니 식물체에 WMV-gin 계통을 전혀 매개하지 못하였다.
- 또한 쥬키니에 감염되어 있는 WMV-wm을 진딧물로 매개하여 인삼에서 증식한 이 바이러스 분리주도 즙액접종이 되지 않은 동일한 결과를 얻었다. WMV에 감염된 쥬키니 잎과 건전 인삼 잎을 1:1(W/W)로 혼합하여 건전 쥬키니와 N. benthamiana에 즙액접종에서도 감염이 되지 않은 결과(자료 생략)를 미루어 볼 때, 인삼 식물체에 함유하고 있는 억제물질이 즙액 전염을 저해하는 것으로 추론되었다.
- 진딧물 전염의 확산 속도는 쥬키니를 전염원으로 하는 A 처리구가 B 처리구보다 빠른 것으로 나타났다. 또한 WMV-wm의 100% 발병률을 나타낸 인삼 포장의 가장자리에 어린 쥬키니 묘 25주를 정식하여 62일 후에 검정하였으나, 모든 정식 식물체에서 바이러스는 검출되지 않았다.
- 그러나 WMV-gin이 감염된 인삼에서 흡즙한 복숭아혹진딧물 및 목화 진딧물은 건전한 쥬키니 식물체에 WMV-gin 계통을 전혀 매개하지 못하였다. 또한 WMV-wm이 매개하여 감염된 인삼 식물체에서 복숭아혹진딧물 및 목화진딧물은 쥬키니 식물체로 WMV-wm을 매개시키지 못하는 동일한 결과를 보였다. 흥미롭게도, 기주 식물에서의 WMV의 감염률을 조사한 결과 WMV 매개는 복숭아혹진딧물이 인삼에서 20-30%, 쥬키니 호박에서 40% 감염률이 목화진딧물보다 더 높았다.
- 2). 또한 이 인삼포장에 황색수반 트랩을 설치하여 포집한 유시 진딧물 20개체 중 3개체에서 WMV의 유전자가 검출되어 인삼 포장에서 유시 진딧물에 의한 인삼으로의 WMV 매개가 이루어지고 있음을 확인하였다.
- benthamiana에 즙액접종으로 감염이 잘되었지만, 인삼에서 발생하는 WMV-gin는 이들 기주식물에 즙액접종이 되지 않았다(Table 1). 또한 쥬키니에 감염되어 있는 WMV-wm을 진딧물로 매개하여 인삼에서 증식한 이 바이러스 분리주도 즙액접종이 되지 않은 동일한 결과를 얻었다. WMV에 감염된 쥬키니 잎과 건전 인삼 잎을 1:1(W/W)로 혼합하여 건전 쥬키니와 N.
- 이 시기는 인삼 잎에 바이러스 병징이 은폐되고 일부분의 잎이 황색으로 변색하는 생육 단계였다. 무작위로 인삼 8주를 채집하여 RT-PCR 검정 결과, 4주에서 이 바이러스의 감염이 확인되었다(Fig. 2). 또한 이 인삼포장에 황색수반 트랩을 설치하여 포집한 유시 진딧물 20개체 중 3개체에서 WMV의 유전자가 검출되어 인삼 포장에서 유시 진딧물에 의한 인삼으로의 WMV 매개가 이루어지고 있음을 확인하였다.
- 처리구 A 셀에서는 복숭아혹진딧물이 다량 증식한 파프리카 식물체의 주변에 WMV-wm이 감염된 쥬키니 식물체를 배치하였다. 배치 1개월 후인 5월 23일에 검정한 인삼 20주 중 12주(60%)이 WMV에 의해서 감염되었으며, 배치 2개월 후인 6월 26일에는 뿌리썩음병으로 고사한 1주를 제외하고 인삼이 100% 이병율을 보였다(Fig. 1A). 한편 처리구 B 셀은 WMV-gin이 감염된 인삼 식물체 주변에 A 셀과 동일한 조건의 파프리카 식물체를 배치한 후, WMV-gin의 전염을 검정하였다.
- 한편 처리구 B 셀은 WMV-gin이 감염된 인삼 식물체 주변에 A 셀과 동일한 조건의 파프리카 식물체를 배치한 후, WMV-gin의 전염을 검정하였다. 배치 1개월 후인 5월 23일에는 감염된 식물체가 없었으며, 배치 2개월 후인 6월 26일에는 4주(20%), 7월 23일에는 15주(75%) 인삼이 감염되었다(Fig. 1B). 진딧물 전염의 확산 속도는 쥬키니를 전염원으로 하는 A 처리구가 B 처리구보다 빠른 것으로 나타났다.
- 유사하게 수박에서 분리한 WMV-wm 계통은 2종의 진딧물들에 의하여 인삼으로 매개되지만 인위적 즙액 접종으로 인삼을 감염시키지 못하였다. 복숭아혹진딧물과 목화진딧물을 이용한 전반 실험들에 의해서 WMV-gin과 WMV-wm 계통들 모두 인삼에서 WMV의 증식 기주 식물들인 박과 식물들로 전반되지 못함이 밝혀졌다. 이런 결과들은 인삼에서 발생하는 WMV병이 생태학적 접근법에 의해서 방제될 수 있음을 제시해 준다
- 이 바이러스는 Potyvirus 속 중에 기주범위가 비교적 넓고 주로 즙액과 진딧물 전염하는 바이러스로 알려져 있다(Purcifull 등, 1984). 수박에서 분리하여 쥬키니 식물체에서 증식한 WMV-wm은 수박 등 박과작물과 이 바이러스의 기주식물인 N. benthamiana에 즙액접종으로 감염이 잘되었지만, 인삼에서 발생하는 WMV-gin는 이들 기주식물에 즙액접종이 되지 않았다(Table 1). 또한 쥬키니에 감염되어 있는 WMV-wm을 진딧물로 매개하여 인삼에서 증식한 이 바이러스 분리주도 즙액접종이 되지 않은 동일한 결과를 얻었다.
- 이들 진딧물 중 복숭아혹진딧물, 목화진딧물, 완두콩진딧물(Acyrthosiphon pisum)이 WMV의 매개능력이 높다고 보고되었다(Castle 등, 1992). 우리나라 인삼재배포장에서 인삼 식물체에 군락을 이루며 서식하는 진딧물은 3년간의 포장 관찰에서 찾아 볼 수가 없었고 진딧물을 인위적으로 인삼 잎에 접종하여도 인삼에서 흡즙 등의 먹이를 기피하는 현상을 보였다. 하지만 인삼재배 포장에서는 WMV의 발생과 확산이 확인되어 복숭아혹진딧물과 목화진딧물을 대상으로 WMV 감염 식물체에서 인위적으로 이들 무시 진딧물을 보독시켜 전염능력을 조사한 결과, 복숭아혹진딧물이 목화진딧물보다 WMV의 매개능력이 인삼 식물체에서 다소 높은 것으로 나타났다(Table 2).
- rustica에서는 병징이 나타나지 않았다. 접종 30일 후 병징 발현이 나타나지 않은 식물체는 RT-PCR과 전자현미경 검경에서도 이 바이러스의 유전자의 검출 및 사상형의 바이러스 입자가 모두 관찰되지 않았다.
- 1B). 진딧물 전염의 확산 속도는 쥬키니를 전염원으로 하는 A 처리구가 B 처리구보다 빠른 것으로 나타났다. 또한 WMV-wm의 100% 발병률을 나타낸 인삼 포장의 가장자리에 어린 쥬키니 묘 25주를 정식하여 62일 후에 검정하였으나, 모든 정식 식물체에서 바이러스는 검출되지 않았다.
- 우리나라 인삼재배포장에서 인삼 식물체에 군락을 이루며 서식하는 진딧물은 3년간의 포장 관찰에서 찾아 볼 수가 없었고 진딧물을 인위적으로 인삼 잎에 접종하여도 인삼에서 흡즙 등의 먹이를 기피하는 현상을 보였다. 하지만 인삼재배 포장에서는 WMV의 발생과 확산이 확인되어 복숭아혹진딧물과 목화진딧물을 대상으로 WMV 감염 식물체에서 인위적으로 이들 무시 진딧물을 보독시켜 전염능력을 조사한 결과, 복숭아혹진딧물이 목화진딧물보다 WMV의 매개능력이 인삼 식물체에서 다소 높은 것으로 나타났다(Table 2). 인삼에서 증식한 WMV-gin은 인삼 식물체로 진딧물 전염이 되었으나, 쥬키니에는 전염이 되지 않았다.
- 또한 WMV-wm이 매개하여 감염된 인삼 식물체에서 복숭아혹진딧물 및 목화진딧물은 쥬키니 식물체로 WMV-wm을 매개시키지 못하는 동일한 결과를 보였다. 흥미롭게도, 기주 식물에서의 WMV의 감염률을 조사한 결과 WMV 매개는 복숭아혹진딧물이 인삼에서 20-30%, 쥬키니 호박에서 40% 감염률이 목화진딧물보다 더 높았다.
후속연구
- 2). 따라서 이 연구에서 수행한 인삼에 발생하는 WMV의 전염특성을 기반으로 인삼의 안정생산을 위하여 이 바이러스병의 생태적 예방대책에 대한 체계적인 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 인삼 식물체에서 증식한 WMV가 박과식물로 진딧물 전염이 되지 않은 이유는 본 연구에서 구명을 하지 못하였다. 이를 위하여 인삼 식물체에서 WMV를 보독한 진딧물이 쥬키니 식물체의 먹이 탐색과정에서 흡즙한 인삼즙액이 보독 바이러스를 불활성화로 이루어지는지 등 매개충의 생리생태적 경로 추정이 구명되어야 할 것이다. 진딧물이 비영속성 바이러스의 전염은 먹이를 탐색하는 과정에서 바이러스를 감염시킨다는 보고(Radcliffe와 Ragsdale, 2002)와 인삼 인삼 재배 포장에서 이 바이러스의 전염은 동일한 경로로 전파되는 것으로 추정하고 있다.
- 1). 인삼 식물체에서 증식한 WMV가 박과식물로 진딧물 전염이 되지 않은 이유는 본 연구에서 구명을 하지 못하였다. 이를 위하여 인삼 식물체에서 WMV를 보독한 진딧물이 쥬키니 식물체의 먹이 탐색과정에서 흡즙한 인삼즙액이 보독 바이러스를 불활성화로 이루어지는지 등 매개충의 생리생태적 경로 추정이 구명되어야 할 것이다.
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