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문제 정의
- 연구에서는 성분분석을 통해 품질이 확인된 PNO의 항비만 효과를 세포수준에서 확인하고 기능성소재로서의 연구 가능성을 제시하고자 수행하였다. 그 결과 PNO는 기존에 알려진 바와 같이 linoleic acid, oleic acid, pinolenic acid, 및 palmitic acid가 분석되었으며 정량을 위한 표준물질인 undecanoic acid의 함량을 기준으로 확인한 결과 linoleic acid 43.
- 이에 본 연구는 PNO의 항비만 효능을 검증하기 위해 구성성분을 분석하고 지방세포로 분화가 가능한 3T3-L1 세포를 이용하여 PNO의 섭취가 유도할 수 있는 비만억제의 유익한 기능에 대한 기초자료를 확보하고자 실험을 진행하였으며, 이를 통해 확보된 기초자료들은 PNO의 기능을 이용한 다양한 제품의 생산 및 적용에 근거자료로 이용될 것이다.
제안 방법
- 2일 후 0.5 mM isobutylmethylxanthine (IBMX), 1 µM dexamethasone, 10 µg/mL insulin (MDI solution), 및 10% FBS 을 포함하는 DMEM에서 2일 동안 배양함으로써 분화를 개시한 다음, 10 µg/mL insulin 및 10% FBS (fetal bovine serum)를 포함하는 DMEM으로 교환하여 3일 동안 분화를 진행시켰다.
- 3T3-L1 분화유도세포에서 지방적 형성이 저해되는 것을 관찰하고 그 이유를 찾기 위해 지방의 합성과 축적에 관련되는 biomarker의 발현을 mRNA 수준에서 관찰하였다. 그 결과 Fig.
- 3T3-L1세포는 10% calf serum을 포함하는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA) 에 100 U/mL penicillin과 100 µg/mL streptomycin을 첨가하여 5% CO2, 37℃에서 배양, 유지하였다.
- First strand cDNA는 AmfiRiert Platinum cDNA Synthesis Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX, USA)를 이용하여 합성하였다. 추출한 RNA (2 µg)와 RNase free water로 9 µL을 맞추고 70℃에서 5분간 반응시킨 후 2× cDNA synthesis 완충용액 10 µL, cDNA synthesis enzyme mix 1 µL, 를 섞어 11 µL씩 각 PCR tube에 더한 후 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
- 실험에 사용한 primer sequence는 Table 2와 같다. PCR 산물은 0.002% ethidium bromide가 첨가된 1.0% agarose gel에 100 V에서 30분간 전기영동후 UV 광으로 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 Image J (National institutes of health, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다.
- PNO는 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 용매로 하여 본 실험에 사용되었으므로 PNO의 3T3-L1 세포에서의 독성실험은 DMSO 용매단독 처리군과 비교하여 확인하였다(Fig. 1). PNO는 농도에따라 0.
- PNO는 지방산 표준용액의 retardation time을 기준으로 그 구성 성분을 분석하였다. PNO에 함유된 성분을 분석한 결과는 Table 3에 나타내었다.
- PNO를 이용하여 항비만 효과에 대한 잠재적 기능 및 기전을 연구하기 위해 Oil Red O staining, PPARγ 및 aP2 mRNA 발현 확인 그리고 leptin의 분비량 측정을 진행하였다.
- PNO의 세포독성은 Cell Counting Kit (CCK)-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan)을 이용하여 Lee 등(20)의 방법을 응용하여 확인하였다. 3T3-L1 세포를 96 well에 1.
- PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ) 및 aP2 (adipocyte protein 2)의 mRNA 발현량 측정은 Go Tag Green Master (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 준비된 cDNA 를 manual에 따라 RT-PCR하여 진행하였다.
- mRNA 추출과 RT-PCR은 Baek 등(21)의 실험방법을 변형하여 사용하였다. 3T3-L1을 6-well plates에서 분화유도한 후 PNO 0.
- 0% agarose gel에 100 V에서 30분간 전기영동후 UV 광으로 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 Image J (National institutes of health, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다.
- 이후 30-40℃ 수욕상에서 1-2분 방치하여 완전히 냉각시켰다. 냉각된 PNO에 isooctane 2 mL와 층 분리를 잘 되게 하기 위하여 saturated NaCl 1 mL를 가하고, 이후 충분히 vortex하여 1-2분간 방치한 뒤 상층액을 회수하고 sodium sulfate를 이용하여 여과, 탈수 한 뒤 gas chromatography (Agilent 6890N GC/FID, Agilent Technologies, Beijing, China)로 분석 하였다.
- 24시간 후 배양중인 배지(200 µL)에 CCK-8 reagent를 20 µL씩 가해주고 3시간 동안 37℃에서 배양한 후 microplate reader (EL808; BioTek, Winooski, VT, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군(control)의 흡광도 값을 기준으로 세포독성을 비교하였다.
- PNO의 섭취가 식욕을 억제한다는 보고는 Hughes 등(8)과 Pasman 등(10)의 연구를 통해 이루어졌으며, endogenous cholecystokinin과 glucagon like peptide-1의 증가에 의한 것임을 규명하였다. 본 실험에서는 3T3-L1세포를 이용하여 PNO 0.05, 0.1 mg/mL을 처리하였을 때 방출되는 leptin의 함량을 배지에서 측정하였으며 그 결과는 Fig. 4와 같다. 발출되는 leptin의 함량은 MDI control (100%)대비 농도 의존적으로 PNO 0.
- 3T3-L1은 지방세포로의 분화가 가능하며 분화가 완료된 세포에서는 지방의 합성과 분해에 관련되는 다양한 메커니즘의 연구가 가능하다(21,22). 본 실험에서는 PNO 처리가 3T3-L1 adipocyte의 지방적(lipid droplet) 형성을 얼마나 저해할 수 있는지 Oil Red O staining을 통해 확인하였으며 그 결과는 Fig. 2와 같다. Pre-adipocyte에서 adipocyte로 분화가 완료된 MDI control 그룹과 adipocyte에 PNO 0.
- 지방산 표준용액은 지방산멜틸에스터 혼합(37종) 표준품 FAME Mix C4-C24 (Supelco Inc, Bellefonte, PA, USA) 100 mg을 isooctane 1 mL에 녹여 조제하였다. 지방산의 정량을 위해 gas chromatography (Agilent 6890N GC/FID, Agilent Technologies, Beijing, China)를 이용하였으며 지방산 37종의 머무름 순서를 확인하기 위해 GC/MSD (Agilent 5975C, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하였다. 분석조건은 Table 1과 같다.
- 지방세포에서 분비되어 배지에 함유된 leptin의 양은 Feng 등(22)의 실험조건을 응용하여 진행하였다. 방법은 commercial kit (Quantikine & Immunoassay kit, R&D System, Minneapolis, MN, USA)에서 제공하는 ELISA protocol에 따라 분석하였다.
- 추출한 RNA (2 µg)와 RNase free water로 9 µL을 맞추고 70℃에서 5분간 반응시킨 후 2× cDNA synthesis 완충용액 10 µL, cDNA synthesis enzyme mix 1 µL, 를 섞어 11 µL씩 각 PCR tube에 더한 후 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
- 8%의 함량이 확인되었다(23,24). 함량계산은 내부표준 물질 undecanoic acid의 함량을 기준으로 계산하였다.
데이터처리
- 실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 SPSS (statistical package for social sciences, Version 10.0, Chicago, IL, USA) program을 이용하여 mean±SD로 표시하였고, one-way ANOVA test에 의해 p<0.05 수준에서 각 실험군 간의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- GC 분석을 위한 PNO 샘플의 fatty acid methyl ester화는 Watkins 등(15)의 방법을 이용하였다. PNO 25 mg을 cap tube에 칭량하고 0.
- 방법은 commercial kit (Quantikine & Immunoassay kit, R&D System, Minneapolis, MN, USA)에서 제공하는 ELISA protocol에 따라 분석하였다.
- 시료 중 지방산의 분석은 식품공전의 일반분석법 중 “1.1.5.4지방산”(16)에 기초하여 gas chromatography를 이용하여 지방산을 분석하였다.
성능/효과
- 2와 같다. Pre-adipocyte에서 adipocyte로 분화가 완료된 MDI control 그룹과 adipocyte에 PNO 0.05, 0.1 mg/mL을 처리한 그룹을 비교한 결과 MDI control (100%) 대비 약 56, 57%까지 지방적의 형성을 억제하는 것이 관찰되었다. 그러나 농도의존적인 지방적 억제효과는 관찰되지 않았다.
- 그 결과 Fig. 3과 같이 PPARγ와 aP2의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 연구에서는 성분분석을 통해 품질이 확인된 PNO의 항비만 효과를 세포수준에서 확인하고 기능성소재로서의 연구 가능성을 제시하고자 수행하였다. 그 결과 PNO는 기존에 알려진 바와 같이 linoleic acid, oleic acid, pinolenic acid, 및 palmitic acid가 분석되었으며 정량을 위한 표준물질인 undecanoic acid의 함량을 기준으로 확인한 결과 linoleic acid 43.4%, oleic acid 25.7%, pinolenic acid로 예측되는 11번 unknown peak 12.8%, palmitic acid 5.2% 및 다수의 미량 성분을 함유하고 있었다. 세포독성 실험을 통해 0.
- PNO를 이용하여 항비만 효과에 대한 잠재적 기능 및 기전을 연구하기 위해 Oil Red O staining, PPARγ 및 aP2 mRNA 발현 확인 그리고 leptin의 분비량 측정을 진행하였다. 그결과 PNO는 MDI solution 처리를 통해 분화가 유도된 mature adipocyte에서 지방적(lipid droplet) 형성을 유의하게 억제하는 것을 확인할 수 있었으며 이는 PNO가 항비만 활성에 잠재적으로 기능을 할 수 있음을 의미한다. 또한 PPARγ와 aP2 mRNA 발현을 확인한 결과, 두 유전자가 유의한 수준으로 MDI control 대비 감소하는 반면 SREBP-1c, C/EBPα, glucokinase, phosphoenolpyruvate carboxykinase 및 perilipin에는 영향이 없는 것을 확인할 수 있었다(data not shown).
- 또한 PPARγ와 aP2 mRNA 발현을 확인한 결과, 두 유전자가 유의한 수준으로 MDI control 대비 감소하는 반면 SREBP-1c, C/EBPα, glucokinase, phosphoenolpyruvate carboxykinase 및 perilipin에는 영향이 없는 것을 확인할 수 있었다(data not shown).
- RT-PCR 결과는 PNO의 처리가 지방대사 및 축적을 단백질 및 유전자 발현조절 기전에 의해 억제할 수 있음을 제시하여 주며, 추가적인 연구가 필요함을 시사한다. 마지막으로 확인한 PNO의 leptin 방출유도 실험을 통해 leptin 이 PNO의 처리에 의해 농도 의존적으로 방출량이 증가됨을 확인할 수 있었다. Leptin은 식욕억제 효과가 있는 호르몬으로 잘알려져 있다.
- 4와 같다. 발출되는 leptin의 함량은 MDI control (100%)대비 농도 의존적으로 PNO 0.05 mg/mL에서 119.5%, PNO 0.1 mg/mL에서 134.3% 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 통해 PNO의 식욕억제에 관련된 또 다른 호르몬 leptin을 확인할 수 있었다.
- 2%의 분석결과를 보고한 바 있다. 본 분석실험 결과 oleic acid 25.7%, linoleic acid 43.4%, palmitic acid 5.2%가 분석되었으며, 분석결과와 보고된 논문자료를 바탕으로 pinolenic acid로 예측되는 11번 unknown peak는 12.8%의 함량이 확인되었다(23,24). 함량계산은 내부표준 물질 undecanoic acid의 함량을 기준으로 계산하였다.
- 본 실험에서는 PNO 0.1 mg/mL을 처리한 후 이들의 mRNA 발현을 RT-PCR을 통해 확인하였으며 (data not shown), 그 중 PPARγ가 분화 전(control)과 비교하여 분화 후 (MDI control) 3배가량 발현이 증가하였다가 PNO 처리 후 MDI control 대비 약 55% 수준까지 감소시키는 것을 Fig. 3A에서 확인 할 수 있었다.
- 2% 및 다수의 미량 성분을 함유하고 있었다. 세포독성 실험을 통해 0.2 mg/mL 농도 까지 독성이 관찰되지 않음을 확인하였으며 그 이상의 농도에서도 PNO보다는 용매 DMSO에 의한 독성이 관찰되었다. PNO를 이용하여 항비만 효과에 대한 잠재적 기능 및 기전을 연구하기 위해 Oil Red O staining, PPARγ 및 aP2 mRNA 발현 확인 그리고 leptin의 분비량 측정을 진행하였다.
- 이는 PNO가 기존에 알려진 cholecystokinin과 glucagon like peptide-1 (GLP-1)의 분비증가를 통해 식욕을 억제할뿐만 아니라 leptin의 방출을 유도하여 추가적인 식욕억제작용을 유도할 수 있음을 의미한다. 위의 연구결과를 종합하면 PNO는 불포화지방산이 다량 함유된 우수한 식물성유지이며 기능적으로 항비만 효능을 잠재적으로 가지는 우수한 소재임을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구결과를 기초자료로 하여 효과적인 기능성 식품 및 소재의 개발을 위해 체계적이고 과학적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 3% 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 통해 PNO의 식욕억제에 관련된 또 다른 호르몬 leptin을 확인할 수 있었다. leptin은 지방세포에서 분비되는 주요 호르몬중 하나로 순환계로 들어간 후 뇌로 전달되면 leptin 수용체와 결합하여 신경을 통해 신호를 전달하게 되며 그로인해 음식섭취를 줄이고 에너지소비를 증가시키는 것으로 알려져 있다(11).
- 이 실험결과를 통해 PNO의 처리에 의해 감소된 PPARγ에 의해 aP2의 발현이 감소하여 지방운반이 억제되어 3T3- L1세포내 지방축적이 저해되었음을 예측할 수 있었으며, 항비만 소재로서의 가능성을 다시 한 번 확인할 수 있었다.
후속연구
- 또한 PPARγ와 aP2 mRNA 발현을 확인한 결과, 두 유전자가 유의한 수준으로 MDI control 대비 감소하는 반면 SREBP-1c, C/EBPα, glucokinase, phosphoenolpyruvate carboxykinase 및 perilipin에는 영향이 없는 것을 확인할 수 있었다(data not shown). RT-PCR 결과는 PNO의 처리가 지방대사 및 축적을 단백질 및 유전자 발현조절 기전에 의해 억제할 수 있음을 제시하여 주며, 추가적인 연구가 필요함을 시사한다. 마지막으로 확인한 PNO의 leptin 방출유도 실험을 통해 leptin 이 PNO의 처리에 의해 농도 의존적으로 방출량이 증가됨을 확인할 수 있었다.
- 그러나 추가 적인 PPARγ의 단백질 발현과 세포핵으로의 localization 및 aP2의 단백질 발현과 함께 aP2 promoter와 PPARγ의 반응성이 PNO의 처리에 의해 어떻게 변화되는지에 대한 연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 위의 연구결과를 종합하면 PNO는 불포화지방산이 다량 함유된 우수한 식물성유지이며 기능적으로 항비만 효능을 잠재적으로 가지는 우수한 소재임을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구결과를 기초자료로 하여 효과적인 기능성 식품 및 소재의 개발을 위해 체계적이고 과학적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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