Newcastle disease virus(NDV) 감염된 baby hamster kidney(BHK) 세포에서 syncytium(합포체) 형성은 세포막 표면으로의 수송된 바이러스 당단백질 hemagglutinin-neuramidase(HN)에 의해 일어난다. HAU 값은 추출물의 농도가 25과 3.2 ug/mL 사이에서는 현저하게 감소하였으나, NDV 감염된 HAD(%)는 25 ug/mL 농도에서 광범위한 흡착능의 감소를 나타내 바이러스 당단백질의 세포내 생합성은 저해되지 않았다. 그러므로, 약용식물인 마황메탄올 추출물이 바이러스 당단백질의 세포막으로의 수송과 함께 합포체 형성을 저해하여 항바이러스 작용을 하였다. 또한 마황 추출물의 저해활성을 조사한 결과 ${\alpha}$-glucosidase에 대한 추출물의 $IC_{50}$은 $18{\mu}g/mL$이었으며, ${\beta}$-glucosidase, ${\alpha}$-mannosidase, ${\beta}$-mannosidase에 대한 마황 추출물의 $IC_{50}$은 각각 60, 40, $150{\mu}g/mL$로 나타나 ${\beta}$-type glycosidases 보다 ${\alpha}$-type glycosidase에 대한 효소활성 저해능이 우수하였다. 따라서 $IC_{50}$농도에서는 세포내에서 당단백질 생합성은 저해되지 않으며 당단백질의 수송을 저해하는 것으로 판단되었으며 향후 항바이러스 관련 작용기작의 연구가 필요하다고 판단된다.
Newcastle disease virus(NDV) 감염된 baby hamster kidney(BHK) 세포에서 syncytium(합포체) 형성은 세포막 표면으로의 수송된 바이러스 당단백질 hemagglutinin-neuramidase(HN)에 의해 일어난다. HAU 값은 추출물의 농도가 25과 3.2 ug/mL 사이에서는 현저하게 감소하였으나, NDV 감염된 HAD(%)는 25 ug/mL 농도에서 광범위한 흡착능의 감소를 나타내 바이러스 당단백질의 세포내 생합성은 저해되지 않았다. 그러므로, 약용식물인 마황 메탄올 추출물이 바이러스 당단백질의 세포막으로의 수송과 함께 합포체 형성을 저해하여 항바이러스 작용을 하였다. 또한 마황 추출물의 저해활성을 조사한 결과 ${\alpha}$-glucosidase에 대한 추출물의 $IC_{50}$은 $18{\mu}g/mL$이었으며, ${\beta}$-glucosidase, ${\alpha}$-mannosidase, ${\beta}$-mannosidase에 대한 마황 추출물의 $IC_{50}$은 각각 60, 40, $150{\mu}g/mL$로 나타나 ${\beta}$-type glycosidases 보다 ${\alpha}$-type glycosidase에 대한 효소활성 저해능이 우수하였다. 따라서 $IC_{50}$농도에서는 세포내에서 당단백질 생합성은 저해되지 않으며 당단백질의 수송을 저해하는 것으로 판단되었으며 향후 항바이러스 관련 작용기작의 연구가 필요하다고 판단된다.
Ephedra sinica Stapf, known as a medicinal plant, inhibited not only syncytium formation, but also trafficking of viral glycoprotein, hemagglutinin-neuramidase (HN) to the cell-surface. Trafficking of viral glycoprotein to the surface of infected-cells results in syncytium formation in Newcastle dis...
Ephedra sinica Stapf, known as a medicinal plant, inhibited not only syncytium formation, but also trafficking of viral glycoprotein, hemagglutinin-neuramidase (HN) to the cell-surface. Trafficking of viral glycoprotein to the surface of infected-cells results in syncytium formation in Newcastle disease virus (NDV)-infected baby hamster kidney (BHK) cells. Viral glycoprotein in the infected-cell is processed within the endoplasmic reticulum during routing into surface. The processing of viral glycoprotein like a N-linked oligosaccharide trimming by ${\alpha}$-glucosidase in cell is necessary for virus infection. Methanol extracts showed inhibitory activities ($IC_{50}$$15{\mu}g/mL$) against ${\alpha}$-glucosidase. This suggested that E. sinica extracts inhibited the cell-surface expression of NDV-HN glycoprotein without significantly affecting HN glycoprotein synthesis in NDV-infected BHK cells.
Ephedra sinica Stapf, known as a medicinal plant, inhibited not only syncytium formation, but also trafficking of viral glycoprotein, hemagglutinin-neuramidase (HN) to the cell-surface. Trafficking of viral glycoprotein to the surface of infected-cells results in syncytium formation in Newcastle disease virus (NDV)-infected baby hamster kidney (BHK) cells. Viral glycoprotein in the infected-cell is processed within the endoplasmic reticulum during routing into surface. The processing of viral glycoprotein like a N-linked oligosaccharide trimming by ${\alpha}$-glucosidase in cell is necessary for virus infection. Methanol extracts showed inhibitory activities ($IC_{50}$$15{\mu}g/mL$) against ${\alpha}$-glucosidase. This suggested that E. sinica extracts inhibited the cell-surface expression of NDV-HN glycoprotein without significantly affecting HN glycoprotein synthesis in NDV-infected BHK cells.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
마황 추추물에 의한 바이러스 당단백질의 세포표면으로의 발현 억제는 세포 내에서 바이러스 당단백질의 세포내 생합성 저해에 의해 일어날 가능성이 있으므로, 추출물에 의한 당단백질 생합성 저해능을 검토하였다. NDV-감염 BHK 세포에서 바이러스 당단백질 NDV-NH의 총 생합성 양은 세포 용해물(cell lysate)에서 전체 HAU 측정으로 정량화한다는 연구가 보고되었다(25,26).
본 실험은 세포 수준에서 마황 추출물의 항바이러스 억제 활성을 조사하기 위하여, NDV 감염된 BHK 세포 내에서 발현되는 바이러스 당단백질(NDV-HN)의 생합성 및 세포 표면으로의 분비 효능을 검토하였다.
본 연구에서는, 우리는 마황 추출물의 α-glucosidase 저해활성과 항바이러스 활성과의 상광관계를 규명하고자 연구를 수행하였다.
제안 방법
BHK cell의 표적 세포 단일층(monolayer)은 96 well microtiter plate에 5 multiplicity of infection(MOI) 농도의 NDV를 감염시킨 후 표시된 농도의 시료를 첨가하여 배양하였다. 그런 후 NDV 감염 세포주에서 syncytium 형성 여부와 cytopathic 효능(CPE), cytopathic units(CPU) 정량을 광학현미경으로 관찰하였다(26,27).
Glucosidase 저해제 스크리닝 시스템을 이용하여 α-glucosidase에 대하여 활성저해능을 갖는 마황 추출물을 선별하여 조사하였다.
NDV-감염 BHK 세포에서 바이러스 당단백질 NDV-NH의 총 생합성 양은 세포 용해물(cell lysate)에서 전체 HAU 측정으로 정량화한다는 연구가 보고되었다(25,26). NDV 감염된 세포배양액을 초음파 파쇄하여 닭 적혈구(chicken red blood cells) 을 첨가한 후, 용해물에서 hemagglutination 활성을 측정하였다. HAU는 마황 추출물의 농도가 25 과 3.
BHK cell의 표적 세포 단일층(monolayer)은 96 well microtiter plate에 5 multiplicity of infection(MOI) 농도의 NDV를 감염시킨 후 표시된 농도의 시료를 첨가하여 배양하였다. 그런 후 NDV 감염 세포주에서 syncytium 형성 여부와 cytopathic 효능(CPE), cytopathic units(CPU) 정량을 광학현미경으로 관찰하였다(26,27).
6-well plates(Falcon; BD, Detroits, MI, USA)에 1 HAU/mL 농도의 NDV를 2 mL 처리 하여 감염시킨 후 14시간, 37℃, humidified 5% CO2-95% air incubator에서 BHK 세포의 confluent 배양을 수행하였다. 배양한 배지를 제거한 후 냉각된 식염수(chilled saline)에 있는 1%(v/v) 닭 적혈구 (chicken red blood) 세포 2 mL를 각각의 well에 분주 한후 4℃, 30 분간 정치하였으며, 가끔씩 가겹게 흔들어 주었다. 흡착되지 않은 혈구세포를 제거 한 후, cell layer를 냉각한 식염수 2 mL로 3회 씻어주었다.
7)을 조제하여 사용하였다. 시료를 완충용액에 첨가하고 37℃, 5분 효소 반응 개시 후 기질을 첨가하여 37℃, 10분 간 효소 반응을 수행하였다. 효소반응 종료는 3배 vol.
효소반응 종료는 3배 vol.의 1 M Na2CO3를 첨가하여 반응을 종한 후 OD405를 측정하여 흡광도 변화로부터 효소 저해활성을 계산하였다. 활성단위인 1 unit는 활성측정 조건에서, 1분 동안 PNP 1.
Newcastle disease virus(NDV; Miyadera strain)는 국립보건연구원(National Institute of Health, Seoul, Korea)에서 분양받은 BHK 세포에서 증식하였다. 증식된 바이러스 stock 들은 monolayer BHK 세포주상 plaque forming units(PFU)의 assay를 통하여 적정하였다. 모든 시험에 사용된 시약들은 Sigma-Aldrich(St.
Glucosidase 저해제 스크리닝 시스템을 이용하여 α-glucosidase에 대하여 활성저해능을 갖는 마황 추출물을 선별하여 조사하였다. 추출물에 의한 저해활성을 조사하기 위하여 50% inhibition(IC50) values을 결정하였으며, 효소활성 저해능 결정은 샘플 추출액 농도의 로그 값에 대한 효소 활성 저해 %을 정하여 나타내었다. Fig.
대상 데이터
Baby hamster kidney(BHK) 세포주는 37℃, humidified CO2 incubator(5% CO2-95% air) 내에서 10% calf serum (BD)이 포함된 Eagle’s minimum essential medium(BD, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다. Newcastle disease virus(NDV; Miyadera strain)는 국립보건연구원(National Institute of Health, Seoul, Korea)에서 분양받은 BHK 세포에서 증식하였다. 증식된 바이러스 stock 들은 monolayer BHK 세포주상 plaque forming units(PFU)의 assay를 통하여 적정하였다.
마황 시료는 대구 시내에 위치한 한약방으로부터 구입하여 사용하였다. 마황 시료 10 g을 각각 메탄올(100 mL)로 상온에서 24시간 동안 추출하여 Whatman filter paper No.
증식된 바이러스 stock 들은 monolayer BHK 세포주상 plaque forming units(PFU)의 assay를 통하여 적정하였다. 모든 시험에 사용된 시약들은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA) 사로부터 구입하여 사용하였다.
데이터처리
Statistical analysis was performed using a one-way ANOVA (p<0.05).
모든 실험은 3회 이상 반복하여 실시하였으며, 실험 결과는 SAS(Statistical Analysis System, SAS Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 one-way ANOVA 분석을 실시하였으며, Duncan의 다범위 검정(Ducan’s multiple range test)을 통하여 5% 수준에서 시료간의 유의적인 차이를 검증하였다 (29).
이론/모형
incubator에서 배양하였다. BHK 세포 성장은 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt(SigmaAldrich)를 이용한 colorimetric 방법에 준하여 결정하였다.
마황 추추물은 시판하는 다양한 glucosidase에 대하여 효소 활성 억제를 보였다. glycosidase의 assay 는 Lee 등(25) 과 Lee 등(26)의 방법에 따라 수행하였다. α-glucosidase와 다른 glucosidase의 활성 분석을 위하여 기질로 p-nitrophenol (PNP) glycosides(1 mM)를 포함하는 50 mM phosphate 완충 용액(pH 6.
성능/효과
Newcastle disease virus(NDV) 감염된 baby hamster kidney(BHK) 세포에서 syncytium(합포체) 형성은 세포막 표면으로의 수송된 바이러스 당단백질 hemagglutininneuramidase(HN)에 의해 일어난다. HAU 값은 추출물의 농도가 25 과 3.2 ug/mL 사이에서는 현저하게 감소하였으나, NDV 감염된 HAD(%)는 25 ug/mL 농도에서 광범위한 흡착능의 감소를 나타내 바이러스 당단백질의 세포 내 생합성은 저해되지 않았다. 그러므로, 약용식물인 마황 메탄올 추출물이 바이러스 당단백질의 세포막으로의 수송과 함께 합포체 형성을 저해하여 항바이러스 작용을 하였다.
또한 마황 추출물의 저해활성을 조사한 결과 α-glucosidase에 대한 추출물의 IC50은 18 μg/mL이었으며, β-glucosidase, α-mannosidase, β-mannosidase에 대한 마황 추출물의 IC50은 각각 60, 40, 150 μg/mL로 나타나 β-type glycosidases 보다 α-type glycosidase에 대한 효소활성 저해능이 우수하였다.
이상의 결과들을 종합해 볼 경우, 마황 추출물은 NDV 감염된 BHK 세포에서 바이러스의 당단백질 분비과정을 저해함으로써 세포표면으로 당단백질 발현을 방해되므로 성숙한 감염성 바이러스 입자의 완성이 어려우므로 결국 항바이러스 작용을 하는 것으로 추론된다. 향후 마황 추출물로부터 항바이러스 물질의 분리 및 작용기작에 대한 연구가 필요하다.
즉, 마황 추출물은 β-type glycosidases 보다 α-type glycosidase에 대한 효소활성 저해 능이 우수하였다.
후속연구
그러므로 HIV 활성 물질 스크리닝을 위한 훌륭한 전략으로 합포체 형성을 저해하는 저해제 탐색방법과 α-glucosidase 활성 저해제 탐색방법의 사용이 기대된다.
그러므로, Fig. 1과 같이 α-glucosidase 억제 활성을 나타내는 마황 추출물이 세포 내에서 바이러스 당단백질의 합성 과정 및 세포표면으로의 분비과정 등을 이해하는데 유용한 재료로 이용될 수 있을 것이라 기대된다.
또한 마황 추출물의 저해활성을 조사한 결과 α-glucosidase에 대한 추출물의 IC50은 18 μg/mL이었으며, β-glucosidase, α-mannosidase, β-mannosidase에 대한 마황 추출물의 IC50은 각각 60, 40, 150 μg/mL로 나타나 β-type glycosidases 보다 α-type glycosidase에 대한 효소활성 저해능이 우수하였다. 따라서 IC50 농도에서는 세포 내에서 당단백질 생합성은 저해되지 않으며 당단백질의 수송을 저해하는 것으로 판단되었으며 향후 항바이러스 관련 작용기작의 연구가 필요하다고 판단된다.
이상의 결과들을 종합해 볼 경우, 마황 추출물은 NDV 감염된 BHK 세포에서 바이러스의 당단백질 분비과정을 저해함으로써 세포표면으로 당단백질 발현을 방해되므로 성숙한 감염성 바이러스 입자의 완성이 어려우므로 결국 항바이러스 작용을 하는 것으로 추론된다. 향후 마황 추출물로부터 항바이러스 물질의 분리 및 작용기작에 대한 연구가 필요하다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
마황이란?
마황(Ephedra sinica Stapf)은 마황과(Ephedraceae)에 속하는 다년생 초본 혹은 초본섬목으로서 중국의 동북부 및 몽고가 원산으로 30∼70cm 가량 자라며, 뿌리줄기는 황적색으로 두꺼운 목질이다. 줄기는 가늘고 길며 마디가 많은데 마디에는 퇴화한 비늘 같은 잎이 한 쌍씩 마주 달린 특성을 나타내며, 원줄기를 마황이라 하며, 한방에서는 중풍, 상한, 두통, 발한, 해열, 진해 및 항염증 등에 응용되고 있다(1).
마황을 한방에서는 어떻게 활용하고 있는가?
마황(Ephedra sinica Stapf)은 마황과(Ephedraceae)에 속하는 다년생 초본 혹은 초본섬목으로서 중국의 동북부 및 몽고가 원산으로 30∼70cm 가량 자라며, 뿌리줄기는 황적색으로 두꺼운 목질이다. 줄기는 가늘고 길며 마디가 많은데 마디에는 퇴화한 비늘 같은 잎이 한 쌍씩 마주 달린 특성을 나타내며, 원줄기를 마황이라 하며, 한방에서는 중풍, 상한, 두통, 발한, 해열, 진해 및 항염증 등에 응용되고 있다(1). 마황의 주요성분으로는 ephedrine, pseudoephedrine, N-methylephedrine, N-methylpseudoephedrine, norephedrine, norpseudoephedrine 등이 알려져있으며(2), 이들 성분들에 대한 약리적인 면에서는 중추흥분작용, 항균, 항바이러스, 항암, 항염, 항알레르기에 대한 효과를 나타낸다고 보고되고 있으나 정확한 작용기작에 대한 연구는 전무하다(3-7).
α-glucosidase 저해제가 많은 질병의 치료제 개발 타켓으로 여겨지는 이유는?
한편, 당뇨, 암, 바이러스 감염 등과 같은 많은 질병에 관여하는 것으로 알려진 glucosidases는 세포 내 glucose trimming을 통하여 당단백질 혹은 당지질의 수식에 관여한다. 그리고 α-glucosidase 저해제는 당단백질 혹은 당지질의 수식을 통하여 항당뇨, 항암, 및 항바이러스 활성을 나타낸다(8-12). 특히, 댕기바이러스, HIV, 간염바이러스 등을 포함한 해로운 바이러스들은 glucosidase 저해에 매우 민감한 것으로 알려졌다(12). 이러한 이유로 인하여, α-glucosidase 저해제는 관련된 많은 질병의 치료제 개발 타켓으로써 뿐만 아니라 작용기작 연구에 이용된다(13).
참고문헌 (29)
Abourashed E, El-Alfy A, Khan I, Walker L (2003) Ephedra in perspective - a current review. Phytother Res, 17, 703-712
De Bruyne T, Pieters L, Witvrouw M, de Clercq E, Vanden Berghe D, Vlietinck J (1999) Biological evaluation of proanthocyanidin dimers and related polyphenols. J Nat Prod, 62, 954？958
Lee DS, Lee JM, Kim SU, Chang KT, Lee SH (2007) Ceftezole, a cephem antibiotic, is and $\alpha$ -glucosidase inhibitor with in vivo anti-diabetic activity. Int J Mol Med, 20, 379-383
Mehta A, Zitzmann N, Rudd PM, Block TM, Dwek RA (1998) $\alpha$ -Glucosidase inhibitors as potential broad based anti-viral agents. FEBS Lett, 430, 17-22
van de Laar FA, Lucassen PL, Akkermans RP, van de Lisdonk EH, Rutten GE, van Weel C (2005) Alpha-glucosidase inhibitors for patients with type 2 diabetes: Results from a Cochrane systematic review and meta-analysis. Diabetes Care, 28, 154-163
Courageot MP, Frenkiel MP, Duarte Dos Santos C, Deubel V, Despres P (2000) $\alpha$ -Glucosidase inhibitors reduce dengue virus production by affecting the initial steps of virion morphogenesis in the endoplasmic reticulum. J Virol, 74, 564-572
Dettenhofer M, Yu XF (2001) Characterization of the biosynthesis of human immunodeficiency virus Type 1 Env from infected T-cells and the effects of glucose trimming of Env on virion infectivity. J Biol Chem, 276, 5985-5991
Johnson VA, Walker BD, Barlow MA, Paradis TJ, Chou TC, Hirsch MS (1989) Synergistic inhibition of human immunodeficiency virus type 1 and type 2 replication in vitro by castanospermine and 3'-azido-3'-deoxythymidine. Antimicrob Agents Ch, 3, 53-57
Tsujii E, Muroi M, Shiragami N, Takatsuki A (1996) Nectrisine is a potent inhibitor of $\alpha$ -glucosidases, demonstrating activities similarly at enzyme and cellular levels. Biochem Bioph Res Co, 220, 459-466
Fischer PB, Collin M, Karlsson GB, James W, Butters TD, Davis SJ, Gordon S, Dwek RA, Platt FM (1995) The $\alpha$ -glucosidase inhibitor Nbuthyldeoxynojirimycin inhibits human immunodeficiency virus entry at the level of post-CD4 binding. J Virol, 69, 5791-5797
Gruters RA, Neefjes JJ, Tersmette M, de Goede RE, Tulp A, Huisman HG, Miedema F, Ploegh HL (1987) Interference with HIV induced syncytium formation and viral infectivity by inhibitors of trimming glucosidase. Nature, 330, 74-77
Quinn TC (2008). HIV epidemiology and the effects of antiviral therapy on long-term consequences. AIDS, 22 (Suppl 3), 7-12
Einfeld D (1996) Maturation and assembly of retroviral glycoproteins. Curr Top Microbiol, 214, 133-176
Lee DS, Kim SC, Kim DH, Kim JH, Park SP, Riu YC, Kim MY, Cho SK, Riu KZ, Lee DS (2011) Screening of Phellinus linteus, a medicinal mushroom, for anti-viral activity. J Korean Soc Appl Biol Chem, 54, 475-478
Kwon DH, Kim MB, Yoon DY, Lee YH, Kim JW, Lee HG, Choi IS, Lim JS, Choe YK (2003) Screening of plant resources of anti-viral activity. Korean J Medicinal Crop Sci, 1, 24-30
Kang SY, Kim TG, Park MS, Han HM, Jung KK, Kang JH, Moon AR, Kim SH, (1999) Inhibitory effect of Eugenia caryophyllate, Ephedra sinica and cinnamomum cassia on the replication of HBV in HepG2.2.15 cells. J Appl Pharmacol, 7, 133-137
Lee DS, Lee SH (2001) Genistein, a soy isoflavone, is a potent $\alpha$ -glucosidase inhibitor. FEBS Lett, 501, 84-86
Muroi M, Takasu A, Yamasaki M, Takatsuki A (1993) Folimycin (concanamycin A), an inhibitor of V-type H(+)-ATPase, blocks cell surface expression of virus-envelope glycoproteins. Biochem Bioph Res Co, 193, 999-1005
Lee JM, Kim JG, Kim TH, Lee DS, Kim JH, Cho SK, Riu KZ, Lee DS, Lee SH (2010) Nonactin hinders intracellular glycosylation in virus infected baby hamster kidney cells. Mol Med Rep, 3, 115-119
Boo KH, Lee DS, Woo JK, Ko SH, Jeong EH, Hong Q, Riu KZ, Lee DS (2011) Anti-bacterial and anti-viral activity of extracts from Paeonia lactiflora roots. J Korean Soc Appl Biol Chem, 54, 132-135
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.