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문제 정의
- intermedia 임상균주의 일부를 검출하지 못함을 알게되었다. 그러므로 본 연구는 rpoB 핵산염기서열을 바탕으로 P. intermedia 임상균주들까지 검출이 가능한 개선된 P. intermedia 특이적 qPCR 프라이머를 개발하기 위하여 시행하였다.
- 현재까지 개발된 여러 세균 검출법들 중에서 가장 신속 정확하고, 민감도가 높으며 정성 및 정량적 방법이 가능한 방법은 실시간 중합효소연쇄반응법(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR) 이라 할 수 있다. 최근 본 연구자 팀은 DNA-dependent RNA polymerase beta-subunit 유전자 (rpoB) 핵산염기서열을 바탕으로 42종 구강 세균 종에 대한 종-특이 qPCR 프라이머 쌍들을 개발하여 소개하였다[8]. 그 논문에서 소개된 P.
제안 방법
- P. intermedia의 rpoB 핵산염기서열(GenBank accession no. JX480867)을 바탕으로 PrimerSelect 프로그램 (DNASTAR Inc., USA)을 이용하여 qPCR 프라이머를 설계하였으며 다음과 같다; RTPi-F2, 5′-ACC CAT TGG CAG AAG TTA CG-3′; RTPi-R2, 5′-TCA ATA GGA CAC AAG CGA CCA TAG-3′.
- PCR PreMix에 RTPi-F2와 RTPi-R2 프라이머 각각 60 pmoles와 세균 유전체 40 ng에서 4 fg까지 10배씩 희석된 양을 각각 PCR tube에넣고, DEPC water를 첨가하여 최종 반응물이 50 μl가 되도록한 후 voltexing하고, 2,500 rpm에서 10초간 원심분리 하였다.
- 이때 PCR 반응 용액의 RTPi-F2와 RTPi-R2 프라이머들은 각각 최종 1 pmole/μl 씩 넣었으며, 세균 지놈 DNA들은 각각 2ng을 넣어서 반응을 시켰다. PCR 반응 조건은 95℃에서 10분간 전변성 처리하였고, 95℃에서 10초간 변성, 60℃에서 20초간 결합, 72℃에서 20초간 중합 과정을 30회 시행하고, 72℃에서 5분간 최종 중합과정을 시행하였다. PCR이 끝난 후 PCR 반응물 중 5 μl를 1.
- PCR PreMix에 RTPi-F2와 RTPi-R2 프라이머 각각 60 pmoles와 세균 유전체 40 ng에서 4 fg까지 10배씩 희석된 양을 각각 PCR tube에넣고, DEPC water를 첨가하여 최종 반응물이 50 μl가 되도록한 후 voltexing하고, 2,500 rpm에서 10초간 원심분리 하였다. qPCR 조건은 95℃에서 10분간 전변성 과정을 거친 후 95℃에서 10초간 변성, 60℃에서 20초간 결합, 72℃에서 20초간 중합 과정을 40회 반복하였으며, 60~94℃에서 1℃씩 1초간 스캔하여 melting curve를 분석하였다.
- qPCR 프라이머(RTPi-F2/RTPi-R2)의 P. intermedia에 대한 종-특이성 검증은 일반적인 PCR법을 이용하였으며, Bioneer 사(Korea)의 AccuPower® PCR PreMix (Bioneer) 및 MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block을 사용하여 제조회사에서 제시한 방법으로 실시하였다.
- qPCR은 AccuPower® GreenStarTM qPCR PreMix(Bionner, Korea) 및 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(Bionner)을 이용하여 실시하였다.
- 균주들은 brain heart infusion (BHI, Difco Laboratories, Spark, MD, USA) 배지를 이용하여 37℃ 호기성 세균배양기(Thermo Forma, Waltham, MA, USA)에서 배양하였으며, A. actinomycetemcomitans 균주들은 tryptic soy broth (TSB, Difco Laboratories)에 0.6% yeast extract, 5% horse serum, 75 μg/ml bacitracin 및 5 μg/ml vancomycin (Sigma, St. Louis, MO, USA)이 첨가된 배지에, 그외 균주들은 TSB에 0.5% yeast extract, 0.05% cysteine HCl-H2O, 0.5 mg/ml hemin 및 2 μg/ml vitamin K1 가 첨가된 배지에 85% N2 , 10% CO2 , 5% H2가 공급되는 37℃ 혐기성 세균배양기(Bactron I, Sheldon Manufacturing Inc., Cornelius, OR, USA)에서 배양하였다.
- intermedia를 종-특이적으로 검출할 수 있는 qPCR 프라이머 쌍이 소개되었다[12]. 그 연구에서 소개된 qPCR 프라이머는 TaqMan 프로브법에 사용하기 위한 것이었으며, P. intermedia를 102-107 마리에 해당하는 지놈 DNA를 10배씩 연속 희석하여 민감도를 측정하였다. 일반적으로 TaqMan 프로브 법은 qPCR 프라이머와 더불어 종-특이적 프로브를 더 이용하기 때문에 본 연구에서 이용한 SYBR Green 법에 비해 특이성이 더 좋은 것으로 알려져 있다.
- 본 연구에서 설계된 qPCR 프라이머 쌍(RTPi-F2/ RTPi-R2)의 최소검출한도를 측정하기 위해 P. intermedia ATCC 25611T 의 유전체 DNA를 40 ng부터 4 fg까지 10배씩 희석하여 qPCR을 수행하였다. 그 결과 RTPi-F2/ RTPi-R2 프라이머 쌍은 P.
- 5℃였지만, 실제 최적결합온도는 60℃였다(data not shown). 즉, P. intermedia와 유전자 수준에서 가장 가까운 P. nigrescens ATCC 33563 T 균주와 P. intermedia ATCC 25611T 의 지놈 DNA를 이용하여 gradient PCR (결합온도를 51-62℃ 사이에서 1℃ 간격으로)을 실시하여, P. intermedia ATCC 25611T의 지놈 DNA만 검출되는 온도 중 PCR 증폭물 밴드 진하기가 동일하게 유지되는 온도를 최종 결합온도로 정하였다. 이러한 결과들을 고려하면, 세균 종-특이 PCR (qPCR 포함) 최적결합온도를 정할 때에는 컴퓨터 프로그램에서 제시해주는 온도보다는 표적 세균 종 및 그와 가장 유전자 수준에서 가까운 종의 지놈 DNA를 이용한 gradient PCR을 수행하여 얻는 것이 더욱 효율적이다는 것을 알 수 있었다.
- 0])를 전해질로 사용하여 100V에서 15분간 전기영동하였다. 증폭물을 GoodViewTM Nucleic Acid Stain (SBS Greetech, Beijing, China)으로 염색하여 UV transilluminator로 PCR 증폭 여부를 확인하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용된 표준 균주들은 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, Biological Resource Center, Korea), CCUG (Culture Collection, University of Göteborg, Sweden) 및 ATCC (Type Culture Collection, USA)에서 구입하여 사용하였다(Table 1). 또한 한국인유래 P. intermedia 임상균주들은 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology, Gwangju, Korea)에서 분양받아 사용하였다.
- 본 연구에서 사용된 표준 균주들은 KCTC (Korean Collection for Type Cultures, Biological Resource Center, Korea), CCUG (Culture Collection, University of Göteborg, Sweden) 및 ATCC (Type Culture Collection, USA)에서 구입하여 사용하였다(Table 1).
이론/모형
- 세균의 지놈 DNA들은 CTAB 방법에 따라 추출하였다[9].
성능/효과
- 2). P. intermedia ATCC 25611의 세균 지놈 크기가 약 2.57 Mb (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_JAEZ00000000.1) 인 점을 감안하면, RTPi-F2/RTPi-R2 프라이머 쌍은 P. intermedia를 qPCR법에 의해 15 균주에 해당하는 세균 지놈 DNA까지도 검출할 수 있음을 의미한다.
- qPCR 프라이머(RTPi-F2/RTPi-R2)에 의한 비특이적 PCR 산물 유무를 검증하기 위해 melting curve 분석을 실시한 결과, melting curve가 단일한 패턴을 보여 비특이적 PCR 산물이 증폭되지 않음을 확인할 수 있었다(Fig. 1B).
- intermedia ATCC 25611T 의 유전체 DNA를 40 ng부터 4 fg까지 10배씩 희석하여 qPCR을 수행하였다. 그 결과 RTPi-F2/ RTPi-R2 프라이머 쌍은 P. intermedia ATCC 25611T 지놈 DNA 40 fg까지 검출할 수 있는 것을 확인하였다(Table 2 및 Fig. 2A).
- 최근 본 연구자 팀은 DNA-dependent RNA polymerase beta-subunit 유전자 (rpoB) 핵산염기서열을 바탕으로 42종 구강 세균 종에 대한 종-특이 qPCR 프라이머 쌍들을 개발하여 소개하였다[8]. 그 논문에서 소개된 P. intermedia 종-특이 qPCR 프라이머 쌍인 Pi-F4와 Pi-R4는 75종(P. intermedia 포함) 구강 세균 표준균주와 P. intermedia를 포함하여 종-특이성 검사를 시행하여 P. intermedia 균주들(ATCC 25611T 와 ATCC 49046)의 지놈 DNA에서 PCR 산물이 증폭되었다. 하지만, 본 연구자팀의 후속 연구 과정 중 Pi-F4와 Pi-R4 프라이머 쌍은 한국인에서 분리동정된 P.
- 본 연구 결과 P. intermedia를 종-특이적으로 검출하기 위해 설계된 RTPi-F2/RTPi-R2 프라이머는 qPCR에 의해 P. intermedia 지놈 DNA를 40 fg까지 종-특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다(Table 2 & Fig. 2).
- intermedia ATCC 25611T의 지놈 DNA만 검출되는 온도 중 PCR 증폭물 밴드 진하기가 동일하게 유지되는 온도를 최종 결합온도로 정하였다. 이러한 결과들을 고려하면, 세균 종-특이 PCR (qPCR 포함) 최적결합온도를 정할 때에는 컴퓨터 프로그램에서 제시해주는 온도보다는 표적 세균 종 및 그와 가장 유전자 수준에서 가까운 종의 지놈 DNA를 이용한 gradient PCR을 수행하여 얻는 것이 더욱 효율적이다는 것을 알 수 있었다.
- 일반적인 PCR법으로 P. intermedia의 검출을 위해 설계된 qPCR 프라이머(RTPi-F2/RTPi-R2)의 종-특이성을 조사한 결과, P. intermedia 균주(표준균주를 포함한 서양인 유래 2주 및 임상균주 10주)에서만 130 bp의 PCR 증폭물이 확인되었으며, 본 연구에서 사용된 P. intermedia 종이외의 구강에 존재하는 52종(52 균주) 지놈 DNA에서는 PCR 증폭물이 확인되지 않았다 (Fig. 1).
후속연구
- 하지만, 모든 세균 종 표준균주 들에 대한 rpoB 핵산염기서열이 결정되지 않은 단점은 있다. 그러므로 향 후 모든 세균 종 표준균주들에 대한 rpoB 핵산염기서열이 결정되어 데이터베이스화된다면 16S rDNA를 대신해서 rpoB가 세균 종-특이 qPCR 설계를 위한 표적 유전자가 될 것으로 생각된다.
- 이상의 연구결과를 요약하면, 본 연구에서 개발된 P. intermedia 종-특이 qPCR 프라이머 (RTPi-F2/RTPi-R2)는종 특이성 및 균주 15마리까지 검출할 수 있는 높은 민감도를 갖는 것이 확인되었으며, 향후 치주질환을 포함한 구강 내 세균감염정질환의 분자역학 연구에 있어서 P. intermedia을 종-특이적으로 검출하는 데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 치주질환의 병인론 연구를 위한 선행 연구로써 치주질환과 밀접한 원인균종을 찾는 역학연구가 선행되어야 한다. 치주질환과 밀접한 관련이 있는 세균 종을 찾는 분자역학 연구를 수행하기 위해서는 많은 수의 샘플에서 세균 종을 신속 정확하게 검출할 수 있는 방법이 있어야 한다.
- intermedia 균주들(ATCC 25611T 와 ATCC 49046)의 지놈 DNA에서 PCR 산물이 증폭되었다. 하지만, 본 연구자팀의 후속 연구 과정 중 Pi-F4와 Pi-R4 프라이머 쌍은 한국인에서 분리동정된 P. intermedia 임상균주의 일부를 검출하지 못함을 알게되었다. 그러므로 본 연구는 rpoB 핵산염기서열을 바탕으로 P.
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