선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 은행 종실은 주로 동양에서 예로부터 약용 또는 식용으로 많이 연구되어오고 있다[14]. 본 연구는 은행 종실의 hexane으로 추출하여 오일 추출물의 항산화효과 및 미백효과에 관한 것이다.
- 본 연구에서 은행 열매의 오일을 추출하여 화장품의 기능성 소재로 사용하고자 그 효능 및 효과를 조사하였다. 멜라닌 생성 첫 단계인 tyrosinase 억제 활성과 멜라닌 생성 억제 효과를 측정한 결과, tyrosinase의 활성을 억제하였고, melanin을 형성하는 B16/F10 melanoma 세포의 멜라닌 생성 억제하였다.
제안 방법
- 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) 0.5 mL에 10 mM L-DOPA를 녹인 기질액 0.5 mL 및 은행 추출물을 농도별(4%, 6%)로 0.5 mL를 첨가하였다. 여기에 mushroom tyrosinase (110 U/mL) 0.
- 24 h 동안 배양한 후 α-MSH을 10 nM 되도록 처리하였고, 4 h 뒤에 은행나무 오일을 처리하였다. 24 h 뒤에 세포 내 melanin 생성에 미치는 영향을 측정하기 위해 DPBS로 2회 세척하고 cell scraper로 cell을 모았다. Lysis buffer (0.
- FRAP assay는 Benzie와 Strain의 방법을 변형하여 측정하였다. FRAP reagent는 25 mL acetate buffer (300 mM, pH 3.
- 은행 추출물을 첨가하지 않은 동일한 혼합물을 대조구로 사용하였다. Tyrosinase 효소 활성 저해율은 다음 계산식에 의하여 산출하였으며 양성대조군으로 arbutin을 사용하였다.
- Tyrosinase의 초기 반응속에 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)의 산화가 관여되므로 전자공여능(electron donating ability, EDA)이 있을 경우 melanin의 생성 억제에 효과가 있을 것으로 예상하여 DPPH의 환원력을 이용하여 측정하였다[6]. 시료 10 µL에 메탄올 100 µL와 0.
- 대조군 및 시험군에서 각각 분리한 총 RNA 1 µg에 oligo dT 2 µL를 넣은 후 DEPC water 8 µL 넣고 조심스럽게 혼합한 다음, 65℃에서 5 min 간 반응 후 다시 얼음에 넣어 4℃를 유지한 후 5 X reaction buffer 4 µL, RiboLockTM RNase inhibition (20 U/µL) 1 µL, 10 mM dNTP mix 2 µL 그리고 RevertAidTM M-MuLV reverse transcriptase (200 u/µL) 1µL를 가하여 총 양을 20 µL로 만들었다.
- Quantitative real time PCR 조건은 denaturation은 95℃에서 15 s, annealing은 68 ℃에서 60 s를 40 cycle 진행하고 final extension은 72 ℃에서 30 s 반응하였다. 상대적인 melanogenic protein mRNA발현 비교는 GAPDH mRNA와 비교하였다.
- 세포 내의 melanin 생성량을 측정하기 위하여 B16/F10 melanoma cell을 100 mm cell culture dish에1 × 105 cells/mL 농도로 분주하였다.
- 분광광도계를 사용하여 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 ascorbic acid를 사용하였으며 전자공여효과는 추출물의 첨가 전과 후의 차이를 백분율로 나타내었다.
- 은행 추출물을 세포에 노출하는 실험에서 추출물이 세포에 미치는 독성을 확인하기 위해 MTT를 이용하였다. 농도별 처리구와 DMSO로 인한 독성을 확인하기 위하여 DMSO를 처리하였고 추출물이 증가함에도 세포의 생존율이 줄지 않음을 확인하였다(Figure 4).
- 은행 추출물이 미백에 효과가 있는지 검증하기 위해 mouse melanoma 세포를 이용하여 멜라닌 합성 억제효과를 측정하였다. 추출물을 처리하고 멜라닌 양을 측정한 결과 추출물의 농도 의존적으로 감소하였으며, 대조군으로 arbutin 500 µM 처리한 세포 보다 더 melanin 합성 억제효과가 높게 측정되었다(Figure 5).
- 5 mL를 가하여 제조하였다. 제조된 0.9 mL FRAP reagent에 각 조건의 샘플을 0.03 mL와 증류수 0.09 mL를 넣은 다음 37 ℃에서 10 min 동안 반응시킨 후 593 nm에서 분광 광도계(Benchmark PLUS Bio-Rad)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
- 추출물의 미백 효능 검증하기 위해 가장 먼저 항산화를 측정하였다. 그 결과 농도 의존적으로 DPPH 라디컬 소거능이 증가하였으며, 추출물 6%일 때 9.
대상 데이터
- B16/F10 melanoma cell에 배양에 사용된 배지는 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin, streptomycin 이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)를 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 은행나무 열매는 중국에서 자생한 것을 구입하여 사용하였으며, 실험재료는 60 ℃에서 3일간 건조한 뒤 건조된 열매를 분쇄하여 분말로 만든다음 추출시료로 사용하였다. 열매 분말 450 g에 hexane 900 mL 첨가하여 상온에서 24 h 교반추출 하였고, 이 과정을 2회 반복하였다.
- DMSO와 에탄올을 1 : 1 비율로 섞어 150µL씩 분주하여 완전히 녹인다. 분광광도계(Benchmark PLUS Bio-Rad)를 이용하여 550 nm에서 측정하였다.
- 시약은 Fermentas에서 제조한 RevertAidTM first stand cDNA systhesis kit를 사용하였다. 대조군 및 시험군에서 각각 분리한 총 RNA 1 µg에 oligo dT 2 µL를 넣은 후 DEPC water 8 µL 넣고 조심스럽게 혼합한 다음, 65℃에서 5 min 간 반응 후 다시 얼음에 넣어 4℃를 유지한 후 5 X reaction buffer 4 µL, RiboLockTM RNase inhibition (20 U/µL) 1 µL, 10 mM dNTP mix 2 µL 그리고 RevertAidTM M-MuLV reverse transcriptase (200 u/µL) 1µL를 가하여 총 양을 20 µL로 만들었다.
- 1 mg/mL streptomycin (Thermo, USA), TRIzol (Invitrogen, USA). 실험에 사용된 기기는 UV/Vis-spectrophotometer (BIO-RAD, USA), PCR (T1 Thermocycler, Biometra, Germany), real-time PCR (CFX connect, Bio-Rad, USA)을 사용하였다.
- 2 mL를 첨가하여 37 ℃ incubator에서 5 min 동안 반응시킨 후 475 nm 파장에서흡광도를 측정하였다. 은행 추출물을 첨가하지 않은 동일한 혼합물을 대조구로 사용하였다. Tyrosinase 효소 활성 저해율은 다음 계산식에 의하여 산출하였으며 양성대조군으로 arbutin을 사용하였다.
이론/모형
- cDNA 증폭을 위해 reaction mixture를 포함한 Taqman universal master mix Ⅱ (Life technologies)를 사용하였고, Taqman gene expression assay를 사용하여 진행하였다. Quantitative real time PCR 조건은 denaturation은 95℃에서 15 s, annealing은 68 ℃에서 60 s를 40 cycle 진행하고 final extension은 72 ℃에서 30 s 반응하였다.
- 반응한 용액을 13,000 rpm 10 min 간 원심분리 하였다. 상등액은 BCA단백질 정량법으로 정량을 하였다. 침전물은 1 N NaOH용액 1 mL 첨가한 다음, 90 ℃에서 1 h 반응한 뒤 단백질 양에 맞춰 희석하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 먼저 96 well plate에는 5 × 104 cells/well 되도록 분주 후 24 h 뒤에 각 농도에 맞도록 DMSO에 녹인 sample을 첨가하였다.
성능/효과
- FRAP 방법은 총항산화능을 측정하는 방법으로 환원제에 의해 ferric tripyridyltriazine (Fe³⁺-TPTZ)복합체가 ferrous tripyridyltriazine (Fe²⁺-TPTZ)으로 환원되는 원리로 대부분의 항산화제가 환원력을 가지고 있다는 점에 개발된 방법이다. FRAP법을 이용하여 항산화화성을 측정한 결과 농도 의존적으로 효과가 증가하였으며, 6%에서 1.33 mM의 소거량을 나타냈다(Figure 2).
- 멜라닌 생성 첫 단계인 tyrosinase 억제 활성과 멜라닌 생성 억제 효과를 측정한 결과, tyrosinase의 활성을 억제하였고, melanin을 형성하는 B16/F10 melanoma 세포의 멜라닌 생성 억제하였다. Melanogenesis에 관여하는 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 유전자 발현을 억제하는 것으로 은행 열매의 오일이 천연 기능성 재료로서 가능성이 매우 높은 것으로 판단된다.
- Qpcr data는 housekeeping gene인 GAPDH와 비교한 상대적인 수치(dCt = geneGADPDH)를 이용하여 normalization한 GAPDH 대비 상대적인 유전자 발현의 비율(2n-dCt)을 의미한다. Melanoma을 유도한 곳보다 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 mRNA양이 발현 억제가 일어남을 확인할 수 있었다(Figure 6)
- 추출물의 미백 효능 검증하기 위해 가장 먼저 항산화를 측정하였다. 그 결과 농도 의존적으로 DPPH 라디컬 소거능이 증가하였으며, 추출물 6%일 때 9.95%의 소거활성을 보였다(Figure 1).
- 은행 추출물을 세포에 노출하는 실험에서 추출물이 세포에 미치는 독성을 확인하기 위해 MTT를 이용하였다. 농도별 처리구와 DMSO로 인한 독성을 확인하기 위하여 DMSO를 처리하였고 추출물이 증가함에도 세포의 생존율이 줄지 않음을 확인하였다(Figure 4).
- 본 연구에서 은행 열매의 오일을 추출하여 화장품의 기능성 소재로 사용하고자 그 효능 및 효과를 조사하였다. 멜라닌 생성 첫 단계인 tyrosinase 억제 활성과 멜라닌 생성 억제 효과를 측정한 결과, tyrosinase의 활성을 억제하였고, melanin을 형성하는 B16/F10 melanoma 세포의 멜라닌 생성 억제하였다. Melanogenesis에 관여하는 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 유전자 발현을 억제하는 것으로 은행 열매의 오일이 천연 기능성 재료로서 가능성이 매우 높은 것으로 판단된다.
- 추출물을 처리하고 멜라닌 양을 측정한 결과 추출물의 농도 의존적으로 감소하였으며, 대조군으로 arbutin 500 µM 처리한 세포 보다 더 melanin 합성 억제효과가 높게 측정되었다(Figure 5).
- 멜라닌 생성은 tyrosinase가 tyrosine을 산화하여 생성되는 멜라닌을 측정하여 추출물의 tyrosinase 억제하여 미백효능 검증하는 방법이다. 측정결과 은행 추출물이 농도 의존적으로 tyrosinase 억제 효과가 있었으며 0.04% 저해율은 양성대조군인 arbutin과 유사한 효과가 나타났다(Figure 3).
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.