본 연구에서는 마테(Ilex paraguariensis)로부터 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획물 및 아글리콘 분획물을 제조하였고 이들 추출물/분획물에 대하여 항산화능을 평가하였다. 추출물 및 분획물의 수율은 건조분말 당 각각 32.0, 4.48 및 0.82%를 나타냈다. 1,1-Phenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 시험법을 이용한 자유 라디칼 소거 활성과 루미놀 발광법을 이용한 총 항산화능을 평가하였다. 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획물 및 아글리콘 분획물의 라디칼 소거활성($FSC_{50}$)은 각각 8.83, 5.84 및 $6.05{\mu}g/mL$이었다. 추출물 및 분획물의 총항산화능($OSC_{50}$)은 모든 추출물이 비교 대조군으로 사용한 L-ascorbic acid ($1.72{\mu}g/mL$)과 유사한 항산화능을 나타냈으며. 50% 에탄올 추출물의 경우 $OSC_{50}$은 $1.03{\mu}g/mL$로 활성이 가장 큰 것으로 평가되었다. $^1O_2$로 유도된 세포 손상에 대한 보호 효과 실험에서 모든 추출물은 $10{\mu}g/mL$ 농도에서 비교 대조군인 (+)-${\alpha}$-tocopherol과 유의적으로 큰 세포 보호 활성(${\tau}_{50}$)을 나타내었다. 특히 아글리콘 분획물은 10 및 $50{\mu}g/mL$ 농도에서의 세포 보호 효과가 (+)-${\alpha}$-tocopherol 보다 약 5배나 크게 나타났다. 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획의 tyrosinase에 대한 저해 효과는 미백제로 알려진 알부틴과 유사하였다. 이상의 결과들은 마테 추출물이 항산화 및 항노화 화장품 원료로서 응용 가능성이 있음을 시사한다.
본 연구에서는 마테(Ilex paraguariensis)로부터 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획물 및 아글리콘 분획물을 제조하였고 이들 추출물/분획물에 대하여 항산화능을 평가하였다. 추출물 및 분획물의 수율은 건조분말 당 각각 32.0, 4.48 및 0.82%를 나타냈다. 1,1-Phenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 시험법을 이용한 자유 라디칼 소거 활성과 루미놀 발광법을 이용한 총 항산화능을 평가하였다. 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획물 및 아글리콘 분획물의 라디칼 소거활성($FSC_{50}$)은 각각 8.83, 5.84 및 $6.05{\mu}g/mL$이었다. 추출물 및 분획물의 총항산화능($OSC_{50}$)은 모든 추출물이 비교 대조군으로 사용한 L-ascorbic acid ($1.72{\mu}g/mL$)과 유사한 항산화능을 나타냈으며. 50% 에탄올 추출물의 경우 $OSC_{50}$은 $1.03{\mu}g/mL$로 활성이 가장 큰 것으로 평가되었다. $^1O_2$로 유도된 세포 손상에 대한 보호 효과 실험에서 모든 추출물은 $10{\mu}g/mL$ 농도에서 비교 대조군인 (+)-${\alpha}$-tocopherol과 유의적으로 큰 세포 보호 활성(${\tau}_{50}$)을 나타내었다. 특히 아글리콘 분획물은 10 및 $50{\mu}g/mL$ 농도에서의 세포 보호 효과가 (+)-${\alpha}$-tocopherol 보다 약 5배나 크게 나타났다. 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획의 tyrosinase에 대한 저해 효과는 미백제로 알려진 알부틴과 유사하였다. 이상의 결과들은 마테 추출물이 항산화 및 항노화 화장품 원료로서 응용 가능성이 있음을 시사한다.
In the present study, 50% ethanol extract, the ethyl acetate and aglycone fraction were prepared from mate (Ilex paraguariensis) and their antioxidative ability was evaluated. The yields of extract and fractions were 32.0, 4.48 and 0.82% per dried powder, respectively. Free radical scavenging activi...
In the present study, 50% ethanol extract, the ethyl acetate and aglycone fraction were prepared from mate (Ilex paraguariensis) and their antioxidative ability was evaluated. The yields of extract and fractions were 32.0, 4.48 and 0.82% per dried powder, respectively. Free radical scavenging activities were performed by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) assay and total antioxidant capacity was estimated using luminol-dependent chemiluminescence assay. Free radical scavenging activities ($FSC_{50}$) of 50 % ethanol extract, ethyl acetate fraction and aglycone fraction were 8.83, 5.84 and $6.05{\mu}g/mL$, respectively. Their total antioxidant capacities ($OSC_{50}$) were similar to that of L-ascorbic acid ($1.72{\mu}g/mL$), known as a prominent water soluble antioxidant, in all extracts and 50% ethanol extract ($1.03{\mu}g/mL$) was the most effective. The cellular protective effects on the $^1O_2$-induced cellular damage of erythrocytes were evaluated and the results showed that all extracts were significantly higher than (+)-${\alpha}$-tocopherol at $10{\mu}g/mL$. Especially, the ${\tau}_{50}$ value of aglycone fraction was 5 times higher than (+)-${\alpha}$-tocopherol at $10{\mu}g/mL$ and $50{\mu}g/mL$. The inhibitory effects of the ethyl acetate and aglycone fractions on tyrosinase were similar to arbutin, known as the whitening agent in cosmetics. These results suggest that the extracts of mate have the applicability as antioxidant and anti-aging cosmeceutical ingredients.
In the present study, 50% ethanol extract, the ethyl acetate and aglycone fraction were prepared from mate (Ilex paraguariensis) and their antioxidative ability was evaluated. The yields of extract and fractions were 32.0, 4.48 and 0.82% per dried powder, respectively. Free radical scavenging activities were performed by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) assay and total antioxidant capacity was estimated using luminol-dependent chemiluminescence assay. Free radical scavenging activities ($FSC_{50}$) of 50 % ethanol extract, ethyl acetate fraction and aglycone fraction were 8.83, 5.84 and $6.05{\mu}g/mL$, respectively. Their total antioxidant capacities ($OSC_{50}$) were similar to that of L-ascorbic acid ($1.72{\mu}g/mL$), known as a prominent water soluble antioxidant, in all extracts and 50% ethanol extract ($1.03{\mu}g/mL$) was the most effective. The cellular protective effects on the $^1O_2$-induced cellular damage of erythrocytes were evaluated and the results showed that all extracts were significantly higher than (+)-${\alpha}$-tocopherol at $10{\mu}g/mL$. Especially, the ${\tau}_{50}$ value of aglycone fraction was 5 times higher than (+)-${\alpha}$-tocopherol at $10{\mu}g/mL$ and $50{\mu}g/mL$. The inhibitory effects of the ethyl acetate and aglycone fractions on tyrosinase were similar to arbutin, known as the whitening agent in cosmetics. These results suggest that the extracts of mate have the applicability as antioxidant and anti-aging cosmeceutical ingredients.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 마테 추출물 및 분획물들에 대하여 free radical 소거활성, Fe3+-EDTA/H2O2 계에서 생성된 활성산소종에 대한 총항산화능, 1O2으로 유도된 세포 손상에 대한 세포 보호효과를 측정하였으며, tyrosinase 및 elastase 저해 활성도 측정하여 마테 추출물이 항산화 또는 미백 및 주름 등의 항노화 화장품 소재로서의 응용 가능성이 있는지를 알아보고자 하였다.
또한 에틸아세테이트 분획 파우더 일부를 산 가수분해 반응을 이용하여 당을 제거시키고자 하였다. 에틸아세테이트 분획 파우더 일정량에 H2SO4 및 아세톤 용액을 넣고, 4h동안 중탕 가열하면서 환류 ⋅ 냉각시켰다.
루미놀은 활성산소에 의해 산화되어 높은 에너지의 들뜬 상태로 되고 이어 바닥 상태로 떨어지게 되면서 발광 (420 ∼ 450 nm)하는 특성을 가지는 물질로써, 본 연구에서는 Fe3+-EDTA/H2O2 계를 이용하여 활성산소를 발생시키고 이것에 의한 루미놀의 화학적 발광 정도를 통해 시료의 활성산소 소거 능력을 확인하고자 하였다.
따라서 이들 활성산소를 소거시키고, 이들 ROS에 의한 피부 손상을 감소시킬 수 있는 항산화제의 개발에 대한 요구가 지속적으로 증가하고 있다. 본 연구실에서도 광노화를 억제할 목적으로 피부 항산화 방어망 구축에 적합한 항산화 소재들을 천연 식물 추출물로부터 개발하고자 하는 연구들을 계속해오고 있다. 또한 활성소재의 안정화 및 효능 증대를 위한 피부흡수증진 시스템 개발 연구도 지속해오고 있다[12,13].
본 연구에서는 몇 가지 항산화 활성 평가를 통해 마테 추출물 또는 분획물이 활성산소종에 대한 우수한 항산화 활성을 확인하였다. 특히 아글리콘 분획물은 세포 수준에서의 항산화능 평가에서 매우 큰 세포 보호 효과를 갖는 것으로 평가되었다.
본 연구에서는 주로 건강음료로 이용되는 마테로부터 화장품에의 활용 가능성 확인하기 위해 몇 가지 추출물을 제조하고 이에 대한 항산화 및 미백 활성을 측정하였다.
1O2은 광증감 반응 (photosesitization)의 주생성물로 알려지며 가장 반응성이 큰 활성산소로 세포막에 침투하여 인지질 및 세포 구성성분들의 자동산화반응을 개시하여 세포막 파괴 및 세포 손상을 야기하게 된다. 본 연구에서는 토끼 적혈구를 이용하여 1O2으로부터의 세포보호 효과를 확인하고자 하였다. 광증감제로써 rose-bengal을 사용하여 1O2을 발생시키고, 적혈구 세포의 용혈 정도를 통해 이를 판단하였다.
제안 방법
1 mL 혼합한 후 37℃에서 10 min 동안 항온 배양한 다음, 반응 혼합물을 얼음수조에 넣어 반응을 종결시키고, 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. L-Tyrosine을 첨가하지 않은 것을 공시험(blank)으로 하여 효소활성 저해를 계산하였다. 활성의 크기는 0.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 조사하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 조사하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 시간 간격으로 700 nm에서의 투광도(transmittance, %)를 통해 평가하였다. 적혈구 현탁액 투광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다.
광증감제로써 rose-bengal을 사용하여 1O2을 발생시키고, 적혈구 세포의 용혈 정도를 통해 이를 판단하였다.
그 후 Fenton 반응을 통한 활성산소종 생성을 위해 150 mM H2O2 40 µL를 첨가하였으며, 25 min 동안 화학발광 정도를 측정하였다.
0%)를 얻었다. 남은 50% 에탄올 추출물은 감압 증류하여 수층만 남긴 후, 이를 에틸아세 테이트(ethylacetate, EtOAc)와 1:1 비율로 3번 추출하였다. 망초산(Na2SO4)를 이용하여 물을 제거하고 감압 증류하여 에틸아세테이트 분획 파우더(수율 4.
농도에 따라 각각 세 번씩 측정하였으며, 자유 라디칼 소거 활성은 DPPH의 농도가 50% 감소 되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging concentration, FSC50, µg/mL)를 구하여 비교하였다.
대조군(control)은 시료 대신 시료 용액으로 사용된 용매를 67 µL 첨가하였다.
대조군(control)은 추출물 대신 증류수를 첨가하였고, 공시험(blank)은 FeCl3 ⦁ 6H2O와 H2O2 대신 증류수를 첨가하였다.
이러한 항산화제의 환원력은 라디칼 소거 활성을 통해 확인할 수 있다. 마테 추출물 및 분획물의 라디칼 소거 활성을 DPPH 라디칼을 이용하여 측정하였다. Figure 1은 마테의 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물, 아글리콘 분획물 그리고 수용성 항산화제로 알려진 (+)-α-tocopherol의 라디칼 소거 활성을 측정을 측정한 결과이다.
2 mM의 DPPH 시약 1 mL와 에탄올 1 mL 그리고 특정 농도의 추출물 또는 분획물 1 mL를 혼합하여 10 min 방치 후, UV/Vis 분광광도계를 이용하여 517 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 마테 추출물 및 분획물의 자유 라디칼 저해율은 DPPH 시약을 넣지 않은 것을 blank, 추출물 또는 분획물을 넣지 않은 것을 대조군(control)으로 하여 계산하였다.
마테 추출물 및 분획물이 광용혈에 미치는 효과는 암반응 시간과 용혈 정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50%가 용혈되는 시간인 τ50을 구하여 비교하였다.
암소에서 30 min 간 pre-incubation시킨 후, 광증감제인 rose bengal (13 µM) 0.5 mL를 가하고 파라필름으로 입구를 봉한 후 14 min 30sec 동안 광 조사하였다.
를 생성시키며 철과 같은 전이금속은 특히 반응성이 큰 ⋅OH를 생성시키는데 중요한 역할을 한다. 이 실험에서는 이러한 활성산소에 의해 루미놀이 발광하는 현상을 이용하여 활성산소 저해 활성을 측정하였다. 화학발광 측정용 튜브에 증류수 1.
대상 데이터
(Japan)에서 구입하였으며, 에탄올, 에틸아세테이트 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. UV-VIS spectrophotometer는 Varian (Australia), 화학발광 실험에 사용된 6-channel LB9505 LT는 Berthold (Germany)사의 제품을 사용하였다.
또한 화학발광 실험에 사용한 FeCl3 ⦁ 6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan)에서 구입하였으며, 에탄올, 에틸아세테이트 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다.
마테(아르헨티나산, 자연토종약초)는 2015년 9월경 경동시장에서 구입하였다. 마테 100 g을 50% 에탄올 1 L에 침적시키고 24 h 동안 교반하여 추출하였다.
남은 50% 에탄올 추출물은 감압 증류하여 수층만 남긴 후, 이를 에틸아세 테이트(ethylacetate, EtOAc)와 1:1 비율로 3번 추출하였다. 망초산(Na2SO4)를 이용하여 물을 제거하고 감압 증류하여 에틸아세테이트 분획 파우더(수율 4.48%)를 얻었다.
실험에 사용된 토끼 적혈구는 삼육축산농원(경기도 화성군)에서 구입한 생후 6개월 된 건강한 토끼로부터 얻어 채혈 후 heparin이 첨가된 시험관에 넣어 4 ℃의 냉장고에 보관하고 12h 이내에 실험에 이용하였다. 이를 3,000 rpm으로 5 min 동안 원심분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 0.
자유 라디칼 소거활성에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical과 화학발광 실험에 사용한 luminol과 ethylenediaminetetraacetic aicd (EDTA), H2O2그리고 비교물질로 사용된 (+)-α-tocopherol과 L-ascorbic acid는 Sigma-Aldrich (Korea)에서 구입하였다.
데이터처리
광 증감제로 사용된 rose bengal을 첨가하고 광조사를 하지 않은 경우와 rose bengal을 첨가하지 않고 광조사만 했을 경우, 모두 암반응 120 min 까지 거의 용혈이 일어나지 않았다. 모든 실험은 3회 반복하여 평균하였다.
모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5 % 유의 수준에서 Student’s t-test를 행하였다.
이론/모형
라디칼은 생체 구성성분과 쉽게 반응할 수 있고, 연쇄반응을 일으켜서 세포 및 조직을 손상시킬 수 있다. 마테 추출물의 자유 라디칼 소거 활성은 DPPH 시험법을 이용하여 측정하였다. 0.
성능/효과
1) DPPH 시험법을 이용한 자유 라디칼 소거활성 (FSC50)은 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트, 아글리콘 분획물이 각각 8.83, 5.84 및 6.05 µg/mL 로 측정되었다.
2) Fe3+-EDTA/H2O2 계에 있어서의 활성산소 소거 활성(총 항산화능, OSC50)은 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획물이 각각 1.03, 1.47 및 1.41 µg/mL로 측정되었다.
3)1O2로 유도된 적혈구 세포 파괴에 대한 세포 보호 효과(적혈구 세포가 50% 파괴되는데 걸리는 시간, τ50)를 확인한 결과, 10 µg/mL에서 모든 추출물이 (+)-α-tocopherol (39.3 min)보다 유의적으로큰 세포 보호 효과를 나타냈고, 특히 아글리콘 분획물은 (+)-α-tocopherol 보다도 약 5배 큰 세포 보호 효과(196.2 min)를 보였다.
4) 마테 추출물 및 분획물의 tyrosinase 저해활성 (IC50)은 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획이 각각 103.6, 130.7 및 100.5µg/mL로 측정되었으며, 에틸아세테이트 및 아글 리콘 분획은 미백 소재로 알려진 arbutin (132.4µg/mL)과 유사한 활성을 나타내었다.
5) Elastase 저해 활성(IC50)은 50 % 에탄올 추출물 및 아글리콘 분획이 각각 1100.7 및 122.3 µg/mL로 측정되었으며, 모두 비교 물질인 oleanolic acid보다 낮은 활성을 나타내었다.
50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획의 라디칼 소거활성은 각각 8.83, 5.84 및 6.05 µg/mL로 나타났다.
41 µg/mL로 측정되었다. 50% 에탄올 추출물은 에틸아세테이트 분획물 보다 큰 항산화능을 나타내었으며, 모두 강력한 수용성 항산화제로 알려진 L-ascorbic acid와 유사한 항산화능을 갖는 것으로 평가되었다.
대조군은 τ50이 29.88 min 으로 오차 범위 ± 0.7 min 이내로 모든 경우의 실험에서 재현성이 양호하게 나타났다.
라디칼 소거 활성과 활성산소 소거 활성 결과에 비해 50% 에탄올 추출물(25 µg/mL, 43.3 min)과 에틸아세테이트 분획물(25 µg/mL, 57.0 min)과큰 차이를 보였다.
모든 추출물은 낮은 농도(10 µg/mL)에서 비교 물질인 (+)-α-tocopherol과 유의적 차이를 보이며 우수한 효과를 나타내었으며, 아글리콘 분획물은 (+)-α-tocopherol보다도 약 5배나 더 큰 세포 보호능을 나타내었다(Figure 3).
세포보호효과의 결과는 시료를 5, 10, 25, 50 µg/mL 의 농도로 처리하였을 때, 적혈구가 50% 용혈 되는데 걸리는 시간(τ50)으로 나타내었으며(Table 1), 먼저 시료를 넣지 않은 대조군으로 약 29.9 min에서 50%의 적혈구가 파괴되는 것으로 측정되었다.
에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획의 라디칼 소거활성이 50% 에탄올 추출물의 활성보다 크게 나타났으며, 이는 비교 대조군으로 사용한 (+)-α-tocopherol (8.98 µg/mL)보다도 유의적으로 큰 활성으로 측정되었다(Figure 1).
에틸아세테이트, 아글리콘 분획물은 비교 물질로 사용된 지용성 항산화제인 (+)-α-tocopherol (8.98 µg/mL)보다 유의적으로 높은 라디칼 소거활성을 나타내었다.
마테 추출물 또는 분획물들은 모두 강력한 수용성 항산화제인 L-ascorbic acid보다 큰 항산화능을 보였지만, 유의적인 차이는 나타내지 않았다. 특히 50% 에탄올 추출물은 에틸아세테이트 분획물과 유의적인 차이를 보이며 가장 큰 항산화능을 나타내었고, 따라서 50% 에탄올 추출물에 수용성 항산화제가 상대적으로 많이 함유되어 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 몇 가지 항산화 활성 평가를 통해 마테 추출물 또는 분획물이 활성산소종에 대한 우수한 항산화 활성을 확인하였다. 특히 아글리콘 분획물은 세포 수준에서의 항산화능 평가에서 매우 큰 세포 보호 효과를 갖는 것으로 평가되었다. 이상의 결과들을 볼 때, 마테는 항노화 화장품 원료로써 충분한 활용가능성이 있을 것으로 사료되며, 추후 이러한 활성을 나타내는 마테의 주요 성분들에 대한 분석과 추가적인 주름 개선이나 미백 소재로서의 활성 평가가 요구될 것으로 판단된다.
후속연구
특히 아글리콘 분획물은 세포 수준에서의 항산화능 평가에서 매우 큰 세포 보호 효과를 갖는 것으로 평가되었다. 이상의 결과들을 볼 때, 마테는 항노화 화장품 원료로써 충분한 활용가능성이 있을 것으로 사료되며, 추후 이러한 활성을 나타내는 마테의 주요 성분들에 대한 분석과 추가적인 주름 개선이나 미백 소재로서의 활성 평가가 요구될 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
마테는 무엇인가?
마테(Ilex paraguayensis)는 감탕나무과의 상록 소교목으로 남아메리카의 파라과이나 브라질에 주로 분포 한다. 마테는 주로 건조시킨 잎과 줄기를 우려내어 차나 음료로 이용된다.
과잉 ROS에 의한 산화적 스트레스는 피부에 어떤 영향을 주는가?
과잉의 ROS로 유도된 피부의 산화적 스트레스는 세포 성분들에 대한 손상을 야기시킨다. 지질 과산화, 단백질 산화, 탄력 섬유인 콜라겐과 엘라스틴의 사슬 절단 및 비정상적인 교차결합, 히아루론산 사슬의 절단, 멜라닌 생성반응 촉진, DNA 산화와 같은 생체 구성 성분들의 손상이 일어난다. 결국에는 탄력감소, 주름살 및 기미⋅주근깨 등으로 특징지워지는 피부노화가 가속화된다[8-11].
피부의 항산화 방어망은 무엇으로 구성되어 있는가?
피부에는 항산화제들로 구성된 항산화 방어망이 발달되어 ROS에 대항하여 피부 세포 및 조직을 보호한다. Superoxide dismutase, catalase 및 glutathione peroxidase와 같은 항산화효소와 α-토코페롤, 아스코르브산, 카로티노이드 등의 비효소적 항산화 물질들이 피부 항산화 방어망을 구축하고 있다[7]. 그러나 계속된 자외선에의 노출로 생성된 과잉의 ROS는 실질적으로 피부의 효소 및 비효소적 항산화 방어를 위태롭게 한다.
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