Cellulase와 xylanase 분비능이 우수한 부숙촉진 세균을 분리하기 위하여 진주시 집현면 소재의 느타리버섯 재배농장으로부터 느타리버섯 수확후배지를 수집하였다. 느타리버섯 수확후배지로부터 19종의 균주를 분리하였으며 이 중 cellulase와 xylanase을 동시에 분비하는 균주를 최종 선발하여 CA105로 명명하였다. Bacillus ID kit와 VITEK 2 system를 이용하여 분리균 CA105의 생화학적 특성을 조사한 결과에서도 분리균 CA105은 B. subtilis와 유사한 특징을 나타내었으며 16S rRNA 염기서열 분석 결과에서는 B. subtilis와 98.9%의 상동성을 나타내었다. 이와 같은 결과를 종합하여 분리균 CA105은 Bacillus subtilis CA105로 동정되었다. 분리균이 분비하는 cellulase와 xylanase 활성은 분리균이 증식함에 따라 대수증식기 중반부터 급격히 증가하였고 정지기에 진입하면 효소활성이 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났다.
Cellulase와 xylanase 분비능이 우수한 부숙촉진 세균을 분리하기 위하여 진주시 집현면 소재의 느타리버섯 재배농장으로부터 느타리버섯 수확후배지를 수집하였다. 느타리버섯 수확후배지로부터 19종의 균주를 분리하였으며 이 중 cellulase와 xylanase을 동시에 분비하는 균주를 최종 선발하여 CA105로 명명하였다. Bacillus ID kit와 VITEK 2 system를 이용하여 분리균 CA105의 생화학적 특성을 조사한 결과에서도 분리균 CA105은 B. subtilis와 유사한 특징을 나타내었으며 16S rRNA 염기서열 분석 결과에서는 B. subtilis와 98.9%의 상동성을 나타내었다. 이와 같은 결과를 종합하여 분리균 CA105은 Bacillus subtilis CA105로 동정되었다. 분리균이 분비하는 cellulase와 xylanase 활성은 분리균이 증식함에 따라 대수증식기 중반부터 급격히 증가하였고 정지기에 진입하면 효소활성이 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났다.
In order to isolate compost-promoting bacteria with high activity of cellulase and xylanase, spent mushroom substrates with sawdust were collected from mushroom cultivation farm, Jinju, Gyeongnam in Korea. Among of the isolates, one strain, designated CA105 was selected by agar diffusion method. The...
In order to isolate compost-promoting bacteria with high activity of cellulase and xylanase, spent mushroom substrates with sawdust were collected from mushroom cultivation farm, Jinju, Gyeongnam in Korea. Among of the isolates, one strain, designated CA105 was selected by agar diffusion method. The strain CA105 was identified as members of the Bacillus subtilis by biochemical characteristics using VITEK 2 system. Comparative 16S rRNA gene sequence analysis showed that isolate CA105 formed a distinct phylogenetic tree within the genus Bacillus and was most closely related to Bacillus subtilis with 16S rRNA gene sequence similarity of 98.9%. On the basis of its physiological properties, biochemical characteristics and phylogenetic distinctiveness, isolate CA105 was classified within the genus Bacillus subtilis, for which the name Bacillus subtilis CA105 is proposed. The cellulase and xylanase activity of B. subtilis CA105 was slightly increased according to bacterial population from exponential phase to stationary phase in growth curve for Bacillus sp. CA105.
In order to isolate compost-promoting bacteria with high activity of cellulase and xylanase, spent mushroom substrates with sawdust were collected from mushroom cultivation farm, Jinju, Gyeongnam in Korea. Among of the isolates, one strain, designated CA105 was selected by agar diffusion method. The strain CA105 was identified as members of the Bacillus subtilis by biochemical characteristics using VITEK 2 system. Comparative 16S rRNA gene sequence analysis showed that isolate CA105 formed a distinct phylogenetic tree within the genus Bacillus and was most closely related to Bacillus subtilis with 16S rRNA gene sequence similarity of 98.9%. On the basis of its physiological properties, biochemical characteristics and phylogenetic distinctiveness, isolate CA105 was classified within the genus Bacillus subtilis, for which the name Bacillus subtilis CA105 is proposed. The cellulase and xylanase activity of B. subtilis CA105 was slightly increased according to bacterial population from exponential phase to stationary phase in growth curve for Bacillus sp. CA105.
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문제 정의
본 연구에서는 유기물 함량이 높은 농산부산물인 느타리버섯 수확후배지의 퇴비화에 필요한 부숙촉진 미생물을 개발할 목적으로 느타리버섯 재배농가에서 수집한 수확후 배지로부터 cellulase와 xylanase 분비능이 우수한 미생물을 분리동정하고 분리균이 생성하는 cellulase와 xylanase 의 특성을 조사하였다.
제안 방법
5% carboxy methyl cellulose(CMC, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)와 1% trypan blue가 첨가된 Luria-Bertani(LB) 고체배지에 분리균을 접종한 다음 40℃에서 2일 동안 배양한 후 코로니 주변에 형성된 cellulose 분해환 크기를 측정하여 확인하였다. Xylanase 활성은 0.5% xylan(xylan from oat spelts, Sigma, USA)이 기질로 첨가된 고체배지에 분리균을 접종한 다음 40℃에서 2일동안 배양한 후 iodine으로 염색하여 코로니 주변에 형성된 xylan 분해환 크기를 측정하여 확인하였다.
0) 250 ul를 혼합하여 100℃에서 10분 동안 반응시킨 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. Xylanase 활성은 CMC 대신에 xylan을 기질로 사용하여 cellulase 와 동일한 방법으로 측정하였다. Cellulase와 xylanase 활성 측정에 사용된 표준시료는 각각 glucose와 D-xylose이고 효소 활성을 나타내는 단위인 1 unit은 CMC 또는 xylan으로부터 1분 동안 1 umol의 glucose 또는 D-xylose에 상응하는 환원당을 생성하는 효소의 양으로 나타내었다.
분리균 CA105의 생육이 효소 생성에 미치는 영향은 0.5% CMC 또는 xylan이 각각 기질로 첨가된 LB 액체배지에 분리균을 접종한 다음 36시간 동안 배양하면서 2시간 간격으로 채취한 배양액의 생육곡선과 DNS 환원당 정량법에 준하여 측정한 cellulase와 xylanase 활성의 상관 관계를 조사하여 확인하였다(Fig. 2). Cellulase 활성은 분리균이 증식함에 따라 대수증식기 중반부터 급격히 증가하였고 정지기에 진입하면 효소활성이 더 이상 증가하지않는 것으로 나타났으며 xylanase도 cellulase와 유사한 활성을 나타내었다.
으로 희석하였으며 희석액은 TSA 고체배지에 도말한 다음 40℃에서 배양하여 19개의 균주를 분리하였다. 분리균 중 난분해성 물질인 섬유소 분해효소 분비능이 우수한 균주를 선발하기 위하여 agar diffusion 법에 따라 분리균의 xylanase와 cellulase 활성을 조사하여 xylanase와 cellulase를 분비하는 6개 균주를 1차 선발하였다. 1차 선발 균주 중 xylanase와 cellulase를 동시에 분비하는 균주 CA105를 최종선발하여 본 실험에 사용하였다(Table 1).
분리균의 cellulase 활성은 0.5% carboxy methyl cellulose(CMC, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)와 1% trypan blue가 첨가된 Luria-Bertani(LB) 고체배지에 분리균을 접종한 다음 40℃에서 2일 동안 배양한 후 코로니 주변에 형성된 cellulose 분해환 크기를 측정하여 확인하였다. Xylanase 활성은 0.
분리균의 계통학적 유연관계를 조사하기 위하여 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과 분리균 CA105는 B.subtilis와 98.9%의 상동성을 나타내었으며 분리균의 16S rRNA 염기서열에 근거한 계통도는 GeneBank에 등록된 균주들의 16S rRNA 염기서열을 비교하여 그 결과를 Fig.1에 나타내었다. Bacillus 속은 다양한 환경에서 포자를 생성하여 생존할 수 있기 때문에 환경에 따라 종 다양성이 큰 세균으로 16S rRNA 염기서열에서 100%의 상동성을 나타내더라도 서로 다른 종으로 분류될 수 있으며 (Seki et al, 1978) 분리균 CA105도 16S rRNA 염기서열 분석에서는 이미 보고된 B.
최종 선발된 균주는 40℃에서 36시간 동안 배양한 다음 1% phosphotungstic acid로 negative stain한 후 투과전자 현미경(JEM 1010, Germany)으로 형태적 특징을 확인하 였으며 Gram 양성/음성은 Gram stain kit(BD, USA)를 사용하여 염색한 후 현미경으로 관찰하여 판정하였다. 온도가 분리균의 생육에 미치는 영향은 TSA 배지에 분리균을 도말한 후 10, 20, 30, 40, 50, 60℃에서 2일 동안 배양하면서 조사하였으며 분리균의 신진대사능인 생화학적 특성은 Bacillus ID kit(MicrogenTM, UK)와 VITEK 2 system(bioMrieux, USA)을 사용하여 조사하였다.
중합효소연쇄 반응에 사용한 universal primer는 27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)와 1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)이고 중합효소연쇄반응은 genomic DNA를 94℃에서 5분간 변성시킨 뒤 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 조건으로 30 cycle을 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 10분 동안 수행하였다.
중합효소연쇄 반응에 사용한 universal primer는 27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)와 1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)이고 중합효소연쇄반응은 genomic DNA를 94℃에서 5분간 변성시킨 뒤 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 조건으로 30 cycle을 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 10분 동안 수행하였다. 최종 선발 균주의 16S rRNA 염기서열은 GeneBank database에 등록된 균주들의 16S rRNA 염기서열과 상동성을 조사하여 계통학적 유연관계를 분석하였으며 그 결과는 DNAMan analysis system(Lynnon Biosoft, Canada)을 이용하여 계통도로 작성하였다.
최종 선발 균주의 16S rRNA 염기서열은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하여 얻은 산물 중 1.5 kb에 해당하는 단편을 PCR purification kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제한 다음 Macrogen (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 중합효소연쇄 반응에 사용한 universal primer는 27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)와 1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)이고 중합효소연쇄반응은 genomic DNA를 94℃에서 5분간 변성시킨 뒤 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 조건으로 30 cycle을 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 10분 동안 수행하였다.
최종 선발된 균주는 40℃에서 36시간 동안 배양한 다음 1% phosphotungstic acid로 negative stain한 후 투과전자 현미경(JEM 1010, Germany)으로 형태적 특징을 확인하 였으며 Gram 양성/음성은 Gram stain kit(BD, USA)를 사용하여 염색한 후 현미경으로 관찰하여 판정하였다. 온도가 분리균의 생육에 미치는 영향은 TSA 배지에 분리균을 도말한 후 10, 20, 30, 40, 50, 60℃에서 2일 동안 배양하면서 조사하였으며 분리균의 신진대사능인 생화학적 특성은 Bacillus ID kit(MicrogenTM, UK)와 VITEK 2 system(bioMrieux, USA)을 사용하여 조사하였다.
대상 데이터
분리균의 생육이 효소 생성에 미치는 영향은 Shin and Cho(2011)의 방법에 따라 조사하였다. 0.5% CMC 또는 xylan이 기질로 첨가된 LB 액체배지에 분리균을 각각 접종한 다음 36시간 동안 진탕배양하면서 2시간 간격으로 배양액을 채취하여 시료로 사용하였다. 분리균의 생육곡선은 채취한 배양액을 600 nm에서 흡광도를 측정하여 작성하였으며 cellulase와 xylanase 활성은 DNS 환원당 정량법(Miller et al.
분리균 중 난분해성 물질인 섬유소 분해효소 분비능이 우수한 균주를 선발하기 위하여 agar diffusion 법에 따라 분리균의 xylanase와 cellulase 활성을 조사하여 xylanase와 cellulase를 분비하는 6개 균주를 1차 선발하였다. 1차 선발 균주 중 xylanase와 cellulase를 동시에 분비하는 균주 CA105를 최종선발하여 본 실험에 사용하였다(Table 1).
Cellulase와 xylanase 분비능이 우수한 부숙촉진 세균을 분리하기 위하여 진주시 집현면 소재의 느타리버섯 재배농장으로부터 느타리버섯 수확후배지를 수집하였다. 느타 리버섯 수확후배지로부터 19종의 균주를 분리하였으며이 중 cellulase와 xylanase을 동시에 분비하는 균주를 최종 선발하여 CA105로 명명하였다.
느타리버섯 수확후배지에 우점하는 균주를 분리하기 위하여 진주시 집현면 소재 느타리버섯 봉지재배 농가로부터 2주기 버섯 수확후배지를 수집하였다. 방문 농가에서는 톱밥, 면실피, 비트펄프, 미강, 면실박 등의 배지재료를 혼합하여 느타리버섯 봉지재배용 배지로 사용하고 있었다.
느타리버섯 수확후배지에 우점하는 균주를 분리하기 위하여 진주시 집현면 소재 느타리버섯 봉지재배 농가로부터 2주기 버섯 수확후배지를 수집한 다음 멸균수에 현탁하여 10 3 으로 희석하였으며 희석액은 TSA 고체배지에 도말한 다음 40℃에서 배양하여 19개의 균주를 분리하였다. 분리균 중 난분해성 물질인 섬유소 분해효소 분비능이 우수한 균주를 선발하기 위하여 agar diffusion 법에 따라 분리균의 xylanase와 cellulase 활성을 조사하여 xylanase와 cellulase를 분비하는 6개 균주를 1차 선발하였다.
이론/모형
Phylogenetic relationships of the isolate CA105 and other closely related bacteria based on the partial 16S rRNA gene sequence. The branching pattern was generated by the neighbor-joining method. Bootstrap values(expressed as percentages of 10,000 replications) are shown at major branching points.
5% CMC 또는 xylan이 기질로 첨가된 LB 액체배지에 분리균을 각각 접종한 다음 36시간 동안 진탕배양하면서 2시간 간격으로 배양액을 채취하여 시료로 사용하였다. 분리균의 생육곡선은 채취한 배양액을 600 nm에서 흡광도를 측정하여 작성하였으며 cellulase와 xylanase 활성은 DNS 환원당 정량법(Miller et al. 1960)으로 측정하였다. Cellulase 활성은 2시간 간격으로 채취한 분리균 배양액을 13,000 rpm 에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액만 회수한 다음 상등액 250 ul와 0.
분리균의 생육이 효소 생성에 미치는 영향은 Shin and Cho(2011)의 방법에 따라 조사하였다. 0.
성능/효과
느타 리버섯 수확후배지로부터 19종의 균주를 분리하였으며이 중 cellulase와 xylanase을 동시에 분비하는 균주를 최종 선발하여 CA105로 명명하였다. Bacillus ID kit와 VITEK 2 system를 이용하여 분리균 CA105의 생화학적 특성을 조사한 결과에서도 분리균 CA105은 B. subtilis와유사한 특징을 나타내었으며 16S rRNA 염기서열 분석 결과에서는 B. subtilis와 98.9%의 상동성을 나타내었다. 이와 같은 결과를 종합하여 분리균 CA105은 Bacillus subtilis CA105로 동정되었다.
lincheniformis와 유사한 생화학적 특성을 나타내었다. Bacillus ID kit와 VITEK 2 system에 의한 분리균 CA105의 생화학적인 특성을 종합하면 Table 2와같이 arabinose, cellobiose, mannitol, mannose, raffinose, rhamnose, salicin, sucrose, trehalose, xylose, adonitol, galactose, methyl-D-glucoside, ONPG, arginine, citrate, nitrate 등에 대해 양성반응을 보였으며 methyl-Dmannoside, inulin, melizitose, indole, inositol, sorbitol, VP 등에 대해서는 음성반응을 나타내었다.
2). Cellulase 활성은 분리균이 증식함에 따라 대수증식기 중반부터 급격히 증가하였고 정지기에 진입하면 효소활성이 더 이상 증가하지않는 것으로 나타났으며 xylanase도 cellulase와 유사한 활성을 나타내었다.이 결과는 Bacillus 속이 분비하는 탄수화물 분해효소의 활성이 세포의 생장과 더불어 지속적으로 증가하고 정지기에 도달하면 최대활성을 나타낸다는 Kim et al의 보고(Kim et al, 1995; Kim et al, 2004)와 일치하는 것이었다.
Cellulase와 xylanase 분비능이 우수한 부숙촉진 세균을 분리하기 위하여 진주시 집현면 소재의 느타리버섯 재배농장으로부터 느타리버섯 수확후배지를 수집하였다. 느타 리버섯 수확후배지로부터 19종의 균주를 분리하였으며이 중 cellulase와 xylanase을 동시에 분비하는 균주를 최종 선발하여 CA105로 명명하였다. Bacillus ID kit와 VITEK 2 system를 이용하여 분리균 CA105의 생화학적 특성을 조사한 결과에서도 분리균 CA105은 B.
분리균 CA105의 생리적생화학적 특성과 16S rRNA 염기서열 분석을 통한 계통학적 유연관계를 종합하여 분리균 CA105는 Bacillus subtilis CA105로 동정되었다. 일반 적으로 Bacillus 속은 다양한 효소와 항생물질을 다량 분비하며 포자를 형성하여 다양한 환경에서도 생존할 수 있기 때문에 분리균 CA105는 퇴비화에 관여하는 부숙촉진 세균으로써 유용한 자원이 될 수 있을 것이다.
분리균 CA105의 형태적 특징은 분리균을 TSA 고체배지에서 36시간 동안 배양한 후 현미경으로 관찰하였으며 그 결과 분리균 CA105는 Gram양성 간균이었다. 분리균CA105의 생화학적 특성은 Bacillus ID kit와 VITEK 2 system를 이용하여 분석하였으며 Bacillus ID kit로 분석한 결과 분리균은 B.
분리균CA105의 생화학적 특성은 Bacillus ID kit와 VITEK 2 system를 이용하여 분석하였으며 Bacillus ID kit로 분석한 결과 분리균은 B. subtilis와 94.72%의 probability을 나타내었으며 VITEK 2 system에 의한 분석결과에서는 B. subtilis, B. lincheniformis와 유사한 생화학적 특성을 나타내었다.
이와 같은 결과를 종합하여 분리균 CA105은 Bacillus subtilis CA105로 동정되었다. 분리균이 분비하는 cellulase와 xylanase 활성은 분리균이 증식함에 따라 대수 증식기 중반부터 급격히 증가하였고 정지기에 진입하면 효소활성이 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났다.
9%의 상동성을 나타내었다. 이와 같은 결과를 종합하여 분리균 CA105은 Bacillus subtilis CA105로 동정되었다. 분리균이 분비하는 cellulase와 xylanase 활성은 분리균이 증식함에 따라 대수 증식기 중반부터 급격히 증가하였고 정지기에 진입하면 효소활성이 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
자원순환형 친환경농업이란 무엇인가?
버섯수확후배지는 유기물 함량이 높기 때문에 자원순환형 친환경농업(resource cycling agriculture)의 자원이 될 수 있다. 자원순환형 친환경농업은 농산부산물 중 유기물 함량이 높은 자원을 토양에 환원하고 화학비료와 농약 사용을 감축하여 토양을 건전하게 유지, 보전하면서 농업생산성을 확보하여 농산물의 안정성과 품질을 높일 수 있는 농업이다. 자원순환형 친환경농업에 이용 가능한 농산부산물은 다양하지만 농산부산물을 전처리없이 토양에 환원할 경우 악취 발생, 중금속 및 병원균 감염 등의 문제가 발생될 수 있기 때문에 퇴비화와 같이 유기물이 토양과 유사한 물질로 안정화되는 과정이 필요하다.
부식토로 변환된 퇴비의 장점은 무엇인가?
퇴비화 과정에서는 C/N율, 수분, 온도, 미생물 등이 중요한 요인이며 퇴비화를 통해 유기물인 농산부산물이 부식토로 변환되는 일련의 부숙과정이다(Jeong et al, 1999; Tchobanoglous et al, 1993). 부숙된 퇴비는 미생물이 분비한 점액물질에 의해 토양 입단화가 형성되어 토양의 통기성, 투수성, 보수성 등을 개선할 수 있을 뿐만 아니라 미생물이 생성한 이차대사산물에 의해 식물병원성 미생물의 증식이 억제될 수도 있다(Shin and Cho, 2011). 퇴비화는 미생물에 의해 고온(40-60 o C)에서 이루어지는 유기물의 호기성 분해과정이며 효모, 고온성 세균, 유산균 등 부속촉진미 생물을 첨가하여 농산부산물, 음식물쓰레기 등의 퇴비화가 촉진된 연구들이 보고되었다(Hong and Park, 2009; Han et al, 2010).
퇴비화에 관여하는 미생물은 무엇이 있는가?
퇴비화는 미생물에 의해 고온(40-60 o C)에서 이루어지는 유기물의 호기성 분해과정이며 효모, 고온성 세균, 유산균 등 부속촉진미 생물을 첨가하여 농산부산물, 음식물쓰레기 등의 퇴비화가 촉진된 연구들이 보고되었다(Hong and Park, 2009; Han et al, 2010). 퇴비화에 관여하는 미생물은 Bacillus 속, Clostridium 속, Pseudomonas 속, Cellulomonas 속, Xanthomonas 속, Pectobacterium carotovorum, Streptomyces 속, Thermomonospora 속, Tricoderma 속 등이 알려져 있으며 이 중 Bacillus 속은 체외분비효소인 cellulase, xylanase, lactase 등을 분비하여 난분해성 물질을 분해하고 이를 탄소원으로 이용할 수 있을 뿐만 아니라 iturin, surfactin, fengycin, bacillomycin과 같은 항진균성 항생 물질을 생산하기 때문에 식물병 방제효과를 기대할 수있으며 액체배양 시 다른 균주에 비해 생육속도가 빠르고 포자를 형성하여 고온에서도 생육할 수 있으므로 퇴비화를 위한 부숙촉진 미생물로 사용될 수 있는 유용한 미생물 자원이다(Regine et al, 1985; Vanittanakam and Loeffler, 1986; Kim et al, 1995; Nakano et al, 1998; Roongsawang et al, 2002; Kim et al, 2004; Schallmey et al, 2004; Lee and Choi, 2006).
참고문헌 (17)
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