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문제 정의
- 그 중 cucumber mosaic virus(CMV)는 세계적으로 9과 100여종의 식물에 모자이크 병징을 나타내는 주된 바이러스로 알려져 있다(7,9,11-13). 이에 본 연구는 Agrobacterium을 이용한 형질전환법을 통해 전 세계적으로 고추에 병을 일으키는 대표적인 원인 바이러스인 CMVP0로 알려진 FNY-CMV strain 유래의 coating protein(CP) 유전자가 형질전환 됨으로써 CMV에 저항성을 나타내도록 개발된 고추 계통 H15(14)와 그 모식물(P2377)을 재배하여 GM작물의 알레르기 유발 가능성을 비교 검증하고자 하였다.
가설 설정
- 1)All values are the mean±SD of triplicate determinations.
제안 방법
- 또한 아미노산 서열이 잠재적인 알레르겐의 에피토프와 8개 이상 직선으로 연속된 아미노산에 대해 정확한 서열 상동성을 가질 경우 알레르기 가능성이 있을 수 있다고 보고되었다(2,18). Codex 지침에 따라 삽입 유전자 CMV-CP로부터 유추된 아미노산의 염기서열과 기존에 알려진 알레르겐과의 염기서열 상동성 검색은 The Food Allergy Research and Resource Program(FARRP) AllergenOnline(http://www. allergenonline.org, last updated: January12, 2015)과Structural Database of Allergenic Proteins(SAAP, last updated: February 25, 2013) 프로그램을 이용하여 기존에 알려진 알레르기 유발 물질과 각각 80개씩의 아미노산에 대한 상동성 비교를 통하여 35% 보다 큰 상동성을 갖는 알레르겐의 존재 유무와 8개 이상의 연속된 아미노산이 일치하는 알레르겐의 존재유무를 검색하였다.
- 3% Tween 20이 포함된 PBS(NFDM/PBST)용액으로 30분간 blocking 한 후 1:20으로 희석된 환자혈청과 16시간(4°C) 반응시켰다. 결합하지 않은 IgE는 PBST를 이용하여 3번 세척한 후, 결합된 IgE의 확인을 위해 1:4000으로 희석된 biotin-goat polyclonal IgG-anti-human IgE(KPL, Gaithersburg, MD, USA)와 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 PBST를 이용하여 3번 세척한 후 1:3000으로 희석된 StreptAvidinAPO(Bio-Rad #170-3554, Hercules, CA, USA)과 실온에서 1시간 반응시키고 다시 PBST를 이용하여 3번 세척 후 색반응을 일으켜 반응한 단백질을 시각화하였다.
- 고추 단백질 항원을 비교하기 위해 유전자변형 고추 및 그 모본 고추에서 단백질 항원을 추출하여 그 농도를 확인하였다. 그 결과, 2008년도에 재배 수확된 고추의 경우 덕소포장에서 재배 수확된 고추가 안성포장에서 재배된 고추보다 높은 단백질 항원이 확인되었다(Table 2).
- 결합하지 않은 IgE는 PBST를 이용하여 3번 세척한 후, 결합된 IgE의 확인을 위해 1:4000으로 희석된 biotin-goat polyclonal IgG-anti-human IgE(KPL, Gaithersburg, MD, USA)와 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 PBST를 이용하여 3번 세척한 후 1:3000으로 희석된 StreptAvidinAPO(Bio-Rad #170-3554, Hercules, CA, USA)과 실온에서 1시간 반응시키고 다시 PBST를 이용하여 3번 세척 후 색반응을 일으켜 반응한 단백질을 시각화하였다.
- 설문을 통해 알레르기가 있다고 응답한 7명의 농우바이오(주) 연구소 종사자의 혈청을 이용하여 immunoblotting 및 ELISA 실험을 진행하였으며, 확보된 혈청은 –20℃에 보관 사용하였다.
- 세척 후 기질용액(0.01% 3,3‘,5,5’-tetramethyl-benzidine) 100 μL/well을 첨가하여 색반응을 일으키고, 일정 시간 후 6 N의 황산용액 50 μL씩 첨가하여 색 반응을 정지시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 유전자변형 및 그 모본 고추에서 추출된 고추 항원과 혈청 IgE와의 반응성을 비교하기 위해 설문을 통해 알레르기가 있다고 응답한 농우바이오(주) 연구소 종사자들의 개별 혈청을 이용하여 immunoblotting 및 ELISA 실험을 진행하였다. Immunoblotting법을 이용한 항원-항체 반응성 비교에 사용된 5명의 농우바이오(주) 종사자들과 1명의 대조군 혈청 결과를 비교한 결과 사용된 개별 혈청에 따라 반응성을 나타낸 밴드의 양상은 다르게 확인되었다(Fig.
- 전사 완료된 PVDF membrane은 항혈청과의 반응성 조사에 앞서 비특이적 반응부위를 차단하기 위해 2% non fat dried milk(NFDM)와 0.3% Tween 20이 포함된 PBS(NFDM/PBST)용액으로 30분간 blocking 한 후 1:20으로 희석된 환자혈청과 16시간(4°C) 반응시켰다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 고추는 농우바이오(주)에서 CMV-CP 유전자를 형질 전환하여 개발된 CMV 내병성 고추 계통인 H15와 그 모식물(대조구) P2377이며, 중부지역(경기도 안성시 소재의 중앙대학교 산업과학대학 농장 내에 위치한 GMO 격리포장)과 북부지역(경기도 남양주시 소재의 고려대학교 부속 덕소 농장의 GMO 격리포장)에서 재배되었다.
- 5%의 stacking gel을 중합시켰다. 준비된 젤은 전기영동 완충용액(25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS)가 들어있는 전기영동조에 설치하고, 샘플 완충용액(60 mMTris/HCl(pH 6.8), 25% glycerol, 2% SDS, 14.4 mM 2mercaptoethanol, 0.1% bromphenol blue)와 시료를 1:5로 혼합 후 100℃에서 5분간 중탕 가열하여 시료로 사용하였다. 전기영동은 우선 100 볼트에서 10분간 시행하여 시료가 stacking gel에 진입한 후 200 볼트에서 35분 추가로 전기영동 하였다.
- 지역 및 조건에 따른 단백질 항원을 비교하기 위해 유전자 변형 고추와 그 모본은 우리나라 중부와 북부에 위치한두 곳의 포장에서 재배 수확되었다. 유전자 변형 고추에서의 CMV-CP 단백질의 발현은 PCR법과 Southern blot을 통해 고추내에 CMV-CP 유전자의 존재를 확인함으로 검증되었으며(19), 농업적 재배특성 조사(20)가 확인되었고, 고추로부터 발현 정제된 CMV-CP 단백질은 SDS-PAGE분석과 Western blot을 통해 25 kDa 크기 위치에서 확인되었다 (21).
- 설문을 통해 알레르기가 있다고 응답한 7명의 농우바이오(주) 연구소 종사자의 혈청을 이용하여 immunoblotting 및 ELISA 실험을 진행하였으며, 확보된 혈청은 –20℃에 보관 사용하였다. 혈청을 제공한 7명은 34~48세의 연령대로 남성 6명 여성 1명이었으며, 모두 꽃가루에 알레르기가 있는 것으로 응답하였고, 그 중 2명은 꽃가루 외에 곰팡이와 집먼지 진드기에 대해서도 알레르기가 있다고 응답하였다. 확보된 혈청에 대한 CAP 측정은 이루어지지 않았다.
- 환자 혈청의 양 부족으로 인해 immunoblotting법을 이용한 항원-항체 반응성 비교에는 총 3명의 농우바이오(주)연구소 종사자들의 혈청이 사용되었다. Immunoblotting법에서 확인된 결과와 마찬가지로 ELISA 실험 결과에서도 조사된 개별 혈청은 재배 지역(안성 또는 덕소)에 따른 반응성의 차이가 없었으며, 유전자변형 고추와 그 모본에서의 항원-항체 반응성의 차이가 없는 것이 확인되었다(Fig.
이론/모형
- 각 샘플에서 추출된 단백질 농도는 Bradford법(15)에 의해 정량되었고, 시약은 상업적으로 판매되는 Bio-Rad(Hercules, CA, USA)사에서 구입한 protein assay kit를 이용하여 495 nm에서 흡광도를 측정하여 표준 용액과 농도를 비교하여 측정하였다.
- 단백질 전기영동은 Laemmli 방법(16)에 준하여 단백질을 변성시킨 조건에서 실시하였다. 13%의 separation gel을 미리 설치된 전기영동용 glass plate에서 중합시킨 후 그 위에 4.
성능/효과
- 0101)가 확인되었다. 이상의 결과를 통해 CMV 바이러스 저항성 H15 고추 도입유전자의 발현산물인 CMV-CP 단백질의 80개씩의 아미노산 비교에서 35% 보다 큰 상동성을 갖거나 8개 이상의 일련된 아미노산 염기서열이 일치하는 알레르겐은 존재하지 않는 것이 확인되었으며, 따라서 CMV-CP 단백질 서열은 기지의 알레르겐과 구조적 및 면역학적으로 연관된 유사성이 없음을 확인하였다.
- 환자 혈청의 양 부족으로 인해 immunoblotting법을 이용한 항원-항체 반응성 비교에는 총 3명의 농우바이오(주)연구소 종사자들의 혈청이 사용되었다. Immunoblotting법에서 확인된 결과와 마찬가지로 ELISA 실험 결과에서도 조사된 개별 혈청은 재배 지역(안성 또는 덕소)에 따른 반응성의 차이가 없었으며, 유전자변형 고추와 그 모본에서의 항원-항체 반응성의 차이가 없는 것이 확인되었다(Fig. 4).
- 유전자변형 및 그 모본 고추에서 추출된 고추 항원과 혈청 IgE와의 반응성을 비교하기 위해 설문을 통해 알레르기가 있다고 응답한 농우바이오(주) 연구소 종사자들의 개별 혈청을 이용하여 immunoblotting 및 ELISA 실험을 진행하였다. Immunoblotting법을 이용한 항원-항체 반응성 비교에 사용된 5명의 농우바이오(주) 종사자들과 1명의 대조군 혈청 결과를 비교한 결과 사용된 개별 혈청에 따라 반응성을 나타낸 밴드의 양상은 다르게 확인되었다(Fig. 3). 혈청 NB-1의 경우 대략 55 kDa과 35 kDa 위치에서 비교적 뚜렷한 항원-항체 반응성이 확인되었고, NB-14 혈청의 경우 대략 55 kDa 위치에서만 비교적 뚜렷한 항원-항체 반응성이 확인되었다.
- 고추 단백질 항원을 비교하기 위해 유전자변형 고추 및 그 모본 고추에서 단백질 항원을 추출하여 그 농도를 확인하였다. 그 결과, 2008년도에 재배 수확된 고추의 경우 덕소포장에서 재배 수확된 고추가 안성포장에서 재배된 고추보다 높은 단백질 항원이 확인되었다(Table 2). 반면 2009년도의 경우는 재배 지역에 상관없이 유전자변형 고추 H15보다 그 모본 P2377에서 높은 단백질 항원이 확인되었고, 2010년도의 경우는 2009년도와는 정반대의 결과가 확인되었다.
- 25%의 염기서열 상동성이 확인되었다(Table 3). 기존 알려진 알레르겐과 8개 또는 7개의 연속된 아미노산 염기서열이 일치하는 알레르겐은 존재하지 않았으며, 6개의 연속된 아미노산 염기서열이 일치하는 알레르겐은 총 5 종류(곰팡이 Malassezia sympodialis 유래 Mala s 9, 콩 Glycine max Glym 6.0501와 Gly m 6.0401, 곰팡이 Cladosporium herbarum 유래 Cla h 9.0101, 쑥 Artemisia vulgaris 유래 Art v 6.0101)가 확인되었다. 이상의 결과를 통해 CMV 바이러스 저항성 H15 고추 도입유전자의 발현산물인 CMV-CP 단백질의 80개씩의 아미노산 비교에서 35% 보다 큰 상동성을 갖거나 8개 이상의 일련된 아미노산 염기서열이 일치하는 알레르겐은 존재하지 않는 것이 확인되었으며, 따라서 CMV-CP 단백질 서열은 기지의 알레르겐과 구조적 및 면역학적으로 연관된 유사성이 없음을 확인하였다.
- 1). 두 번째로 높은 상동성이 확인된 알레르겐은 땅콩(Arachis hypogaea)에서 유래하는 알레르겐 Ara h 8(80개 중 23개의 아미노산 염기서열이 일치, 28.75% 상동성)이었으며, 알레르겐 Ani s 4와 Ara h 8에 이어 세 번째로 상동성이 높은 알레르겐은 80개의 아미노산 염기서열 중 17개의 아미노산 염기서열이 일치하는 유럽 집먼지진드기(Dermatophagoides pteronyssinus)에서 유래하는 Der p 8 알레르겐으로 21.25%의 염기서열 상동성이 확인되었다(Table 3). 기존 알려진 알레르겐과 8개 또는 7개의 연속된 아미노산 염기서열이 일치하는 알레르겐은 존재하지 않았으며, 6개의 연속된 아미노산 염기서열이 일치하는 알레르겐은 총 5 종류(곰팡이 Malassezia sympodialis 유래 Mala s 9, 콩 Glycine max Glym 6.
- 또한 유전자변형 고추 H15와 그 모본 P2377에서 추출된 단백질 항원은 SDS-PAGE를 통해 단백질 항원의 분포가 비교 분석되었으며, 그 결과 고추에서 발현된 단백질의 양상과 양은 재배 연도 및 환경적 영향에 따른 차이가 발견되었지만, 동일한 연도에 재배된 유전자변형 고추와 그 모본사이에서의 차이는 발견되지 않았다(Fig. 2).
- 환자 혈청을 이용해 immunoblotting법과 ELISA법으로 확인한 항원-항체 반응성 비교에서도 CMV 바이러스 저항성 H15 고추와 그 모본 P2377사이에 차이가 없는 것이 확인되었다. 이러한 결과를 종합할 때, 유전자변형 고추 H15는 그 모본과 비교하여 형질전환으로 인한 알레르기성의 변화는 없는 것으로 판단된다.
- 반면 2009년도의 경우는 재배 지역에 상관없이 유전자변형 고추 H15보다 그 모본 P2377에서 높은 단백질 항원이 확인되었고, 2010년도의 경우는 2009년도와는 정반대의 결과가 확인되었다. 이러한 지역별 연도별 일관성이 없는 결과를 통해 유전자변형 고추와 그 모본사이에 유전자 변형으로 인한 고추 단백질 항원의 농도에는 영향이 없음을 확인하였다.
- 이상의 결과를 종합할 때, 유전자변형 고추 H15는 그 모본과 비교하여 형질전환으로 인한 알레르기성의 변화는 없는 것으로 판단된다.
- 0101)가 확인되었다. 이상의 결과를 통해 CMV 바이러스 저항성 H15 고추 도입유전자의 발현산물인 CMV-CP 단백질의 80개씩의 아미노산 비교에서 35% 보다 큰 상동성을 갖거나 8개 이상의 일련된 아미노산 염기서열이 일치하는 알레르겐은 존재하지 않는 것이 확인되었으며, 따라서 CMV-CP 단백질 서열은 기지의 알레르겐과 구조적 및 면역학적으로 연관된 유사성이 없음을 확인하였다.
- 혈청 NB-21의 경우 대략 55 kDa 위치에서 비교적 강한 항원-항체 반응성이 확인되었으며 대략 80kDa 위치에서도 미약하나마 항원-항체 반응성이 확인되었으며 대조군으로 사용된 건강한 사람의 혈청에서는 희미한 비특이적 반응성이 확인되었다. 조사된 모든 환자혈청의 경우 조사된 고추의 재배 장소(안성 또는 덕소) 및 GM/non-GM에 따른 반응성의 차이가 없음이 확인되었다.
- 총 218개의 아미노산으로 구성된 CMV-CP 염기서열을 80개씩의 단위로 총 139번의 비교가 이루어졌으며, 그 결과 가장 높은 상동성을 보인 알레르겐은 80개씩의 아미노산 비교에서 26개의 아미노산이 일치해서 32.5%의 상동성을 나타낸 선충(Anisakis simplex) 유래 Ani s 4 이었다(Fig. 1). 두 번째로 높은 상동성이 확인된 알레르겐은 땅콩(Arachis hypogaea)에서 유래하는 알레르겐 Ara h 8(80개 중 23개의 아미노산 염기서열이 일치, 28.
- 3). 혈청 NB-1의 경우 대략 55 kDa과 35 kDa 위치에서 비교적 뚜렷한 항원-항체 반응성이 확인되었고, NB-14 혈청의 경우 대략 55 kDa 위치에서만 비교적 뚜렷한 항원-항체 반응성이 확인되었다. 혈청 NB-21의 경우 대략 55 kDa 위치에서 비교적 강한 항원-항체 반응성이 확인되었으며 대략 80kDa 위치에서도 미약하나마 항원-항체 반응성이 확인되었으며 대조군으로 사용된 건강한 사람의 혈청에서는 희미한 비특이적 반응성이 확인되었다.
- 혈청 NB-1의 경우 대략 55 kDa과 35 kDa 위치에서 비교적 뚜렷한 항원-항체 반응성이 확인되었고, NB-14 혈청의 경우 대략 55 kDa 위치에서만 비교적 뚜렷한 항원-항체 반응성이 확인되었다. 혈청 NB-21의 경우 대략 55 kDa 위치에서 비교적 강한 항원-항체 반응성이 확인되었으며 대략 80kDa 위치에서도 미약하나마 항원-항체 반응성이 확인되었으며 대조군으로 사용된 건강한 사람의 혈청에서는 희미한 비특이적 반응성이 확인되었다. 조사된 모든 환자혈청의 경우 조사된 고추의 재배 장소(안성 또는 덕소) 및 GM/non-GM에 따른 반응성의 차이가 없음이 확인되었다.
- CMV 바이러스 저항성 H15 고추 도입유전자의 발현산물인 CMV-CP 단백질의 80개씩의 아미노산 비교에서 35%보다 큰 상동성을 갖거나 8개 이상의 일련된 아미노산 염기서열이 일치하는 알레르겐은 존재하지 않는 것이 확인되었으며, 따라서 CMV-CP 단백질 서열은 기지의 알레르겐과 구조적 및 면역학적으로 연관된 유사성이 없음을 확인하였다. 형질전환에 따른 특성 변화를 비교하기 위해 서로 다른 지역에서 재배된 CMV 바이러스 저항성 H15 고추 및 그 모본의 발현 단백질 항원 농도와 그 분포를 비교한 결과 발현된 단백질의 양상과 양은 재배 연도 및 환경적 영향에 따른 차이가 발견되었지만, 동일한 연도에 같은 장소에서 재배된 유전자변형 고추와 그 모본 사이에서의 차이는 발견되지 않아 형질전환으로 인한 특성변화는 없는 것으로 확인되었다. 환자 혈청을 이용해 immunoblotting법과 ELISA법으로 확인한 항원-항체 반응성 비교에서도 CMV 바이러스 저항성 H15 고추와 그 모본 P2377사이에 차이가 없는 것이 확인되었다.
- 형질전환에 따른 특성 변화를 비교하기 위해 서로 다른 지역에서 재배된 CMV 바이러스 저항성 H15 고추 및 그 모본의 발현 단백질 항원 농도와 그 분포를 비교한 결과 발현된 단백질의 양상과 양은 재배 연도 및 환경적 영향에 따른 차이가 발견되었지만, 동일한 연도에 같은 장소에서 재배된 유전자변형 고추와 그 모본 사이에서의 차이는 발견되지 않아 형질전환으로 인한 특성변화는 없는 것으로 확인되었다. 환자 혈청을 이용해 immunoblotting법과 ELISA법으로 확인한 항원-항체 반응성 비교에서도 CMV 바이러스 저항성 H15 고추와 그 모본 P2377사이에 차이가 없는 것이 확인되었다. 이러한 결과를 종합할 때, 유전자변형 고추 H15는 그 모본과 비교하여 형질전환으로 인한 알레르기성의 변화는 없는 것으로 판단된다.
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