[논문]Lipopolysaccharide로 유도된 RAW 264.7 세포에 대한 참치심장 물 추출물의 항염증 효과

김민지; 배난영; 김꽃봉우리; 박지혜; 박선희; 조영제; 안동현

doi:10.7841/ksbbj.2015.30.6.326

Lipopolysaccharide로 유도된 RAW 264.7 세포에 대한 참치심장 물 추출물의 항염증 효과
Anti-inflammatory Effect of Water Extract from Tuna Heart on Lipopolysaccharide-induced Inflammatory Responses in RAW 264.7 Cells 원문보기

KSBB Journal, v.30 no.6, 2015년, pp.326 - 331

김민지 (부경대학교 식품공학과) , 배난영 (부경대학교 식품공학과) , 김꽃봉우리 (부경대학교 수산과학연구소) , 박지혜 (부경대학교 식품공학과) , 박선희 (부경대학교 식품공학과) , 조영제 (경북대학교 식품공학부) , 안동현 (부경대학교 식품공학과)

Abstract ▼ AI-Helper

The anti-inflammatory effect of tuna heart water extract (THWE) was investigated using lipopolysaccharide-induced inflammatory response in this study. Anti-inflammatory effect was detected by the cell proliferation and the production levels of nitric oxide, pro-inflammatory cytokines such as interleukin-6 (IL-6), IL-$1{\beta}$, and tumor necrosis factor-alpha. As a result, there were no cytotoxic effects on proliferation of macrophages treated with THWE compared to the control. The production of pro-inflammatory cytokines was remarkably suppressed compared with that of the LPS only group. These results suggest that THWE exerts the anti-inflammatory property by inhibiting production of inflammatory factors and may be a potential material for anti-inflammatory therapy.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

이러한 참치 부산물의 기능성에 관한 연구는 참치 정소 핵산 복합물질이 면역 활성에 미치는 영향 [19], 참치 지느러미 추출물의 암세포 독성 및 quinone reductase 활성 증가 효과[20], 참치 자숙액의 항산화 활성에 감마선 조사가 미치는 영향 [21] 및 항염증 활성 [22]등 일부만이 보고가 되고 있어 다른 부산물에 대한 면역생리활성을 알아본 연구는 미미한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 참치 부산물의 하나인 참치심장 물 추출물을 이용하여 LPS로 활성화 된 RAW 264.7 대식세포에서 염증 매개물질들의 생성 억제 효과를 측정하였으며, 아울러 항염증 활성을 갖는 기능성 식품으로의 가능성을 밝히고자 하였다.
이는 낮은 농도에서는 세포성장이나 항상성 유지에 필수적이지만 염증반응 및 면역적 자극에 의해 대량생산될 경우 T cell을 활성화 시키고 B cell을 성숙시켜 증상을 악화시킨다 [42]. 본 연구에서는 염증반응에서 전염증성 사이토카인들의 분비에 미치는 THWE의 효과를 확인하기 위하여 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포로부터 분비된 사이토카인의 분비량 억제 효과를 관찰하였다. THWE를 농도별 (0.
본 연구에서는 참치심장 물 추출물의 NO 생성 억제효과를 알아보기 위하여 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 농도 (0.1, 1, 10, 50, 100 μg/mL)에서 LPS로 염증반응을 유발한 RAW 264.7 세포에 추출물을 처리하여 배양한 후, 배양액에 griess 시약을 반응시켜 확인하였다.
본 연구에서는 참치심장 물 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위해 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포를 이용하여 염증 매개성 물질들의 분비량을 확인하였다. 그 결과, LPS만 처리한 대조군과 비교하였을 때, 참치심장 물 추출물이 농도의존적으로 NO의 생성량을 감소시키는 것을 확인하였으며, 추출물의 최고 농도인 100 μg/mL에서 32% 이상의 억제효과를 나타냈다.

가설 설정

따라서 본 연구에 사용된 THWE 의 최고 농도는 세포에 독성을 나타내지 않는 100 μg/mL으로 설정하였다.

제안 방법

RAW 264.7 세포를 1×106 cells/mL의 농도로 96-well plate 에 분주하고 20시간 동안 전 배양 후 참치심장 물 추출물 (THWE)을 농도별로 (0.1, 1, 10, 50, 100 μg/mL) 첨가하여 22시간 본 배양하였다.
RAW 264.7 세포의 세포배양액 내의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β cytokine의 분비량은 ELISA kit (Mouse ELISA set, BD Bioscience, San Diego, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
그 후 THWE 를 0.1, 1, 10, 50, 100 μg/mL 처리하고 1 μg/mL의 LPS로 자극하여 24시간 본 배양하였다.
반응 후 PBST로 세척하고 희석한 biotinylated anti-mouse TNF-α, IL6, IL-1β detection antibody와 streptavidin-horseradish peroxydase conjugate를 분주하여 실온에서 1시간 반응시켰다.
1% naphthylendiamine dihydrochloride, 1:1)과 1:1로 상온에서 10분간 반응시켜 microplate reader를 이용해 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도는 sodium nitrite의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다.
세포배양액을 얻기 위해 RAW 264.7 세포를 2.5×105 cells/mL로 조절 하여 24 well plate에 접종하고 18시간의 전 배양 후 0.1, 1, 10, 50, 100 μg/mL 농도별 THWE와 1 μg/mL의 LPS를 처리하였다.
참치심장 물 추출물이 RAW 264.7 세포에 미치는 세포독성을 알아보기 위하여 추출물을 농도에 따라 (0.1, 1, 10, 50, 100 μg/mL) RAW 264.7 세포에 처리하여 세포 생존의 변화여부를 MTT assay를 이용해 측정하였다.

대상 데이터

Murine의 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행 (KCLB 40071, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였으며, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (GIBCO, Grand Island, NY, USA)에 10% inactivated fetal bovine serum (HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah, USA)과 1% penicillinstreptomycin (HyClone Laboratories, Inc.)을 첨가한 배지를 배양액으로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
본 실험에 사용한 참치심장 분말은 (주)동원 F&B (Seongnam, Korea)에서 제공받았으며 분말상태의 참치심장은 교반기 (H-0820, Dongwon Science Co., Busan, Korea)를 이용해 10배 양의 물을 가한 후 24시간 추출하였다.
본 연구에서 이용된 LPS는 대식세포의 활성화에 관여하는 대표적인 유사분열물질 (mitogen)으로 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 처리하면 대식세포의 표면 수용체인 tolllike receptor4가 이를 인식하여 결합하게 된다 [36]. 대식세포에서 LPS에 의해 분비되는 pro-inflammatory cytokine에는 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 등이 있다.

데이터처리

모든 실험 결과에 대한 유의차 검정은 SAS software (ver. 9.3, SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA)에서 평균값을 분산분석한 후, Duncan's multiple range test 법에 따라 p<0.05 수준에서 검정하였다.

이론/모형

Griess 반응 [24]을 이용하여 배양액 내의 NO의 농도를 측정 하였다. RAW 264.
시료의 세포독성을 평가하기 위해 MTT assay를 실시하였다[23]. RAW 264.

성능/효과

THWE를 농도별 (0.1, 1, 10, 50, 100 μg/mL)로 처리하여 배양 상층액의 IL-6, TNF-α 및 IL-1β의 양을 ELISA kit를 이용하여 측정한 결과, THWE의 처리에 따라각 cytokine의 분비량이 농도의존적인 감소를 보였다.
TNF-α 분비량의 경우 또한 농도의존적인 분비량 감소를 보였으며 50 μg/mL의 THWE 농도 이상의 처리시 20% 이상의 억제율을 나타내었다 (Fig. 4).
그 결과, LPS만 처리한 대조군과 비교하였을 때, 참치심장 물 추출물이 농도의존적으로 NO의 생성량을 감소시키는 것을 확인하였으며, 추출물의 최고 농도인 100 μg/mL에서 32% 이상의 억제효과를 나타냈다.
7 세포에 처리하여 세포 생존의 변화여부를 MTT assay를 이용해 측정하였다. 그 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교 시 차이가 없음을 확인하였다 (data not shown). 이를 통해 참치심장 물 추출물은 0.
7 세포의 염증 반응에서 NO 생산을 억제하여 항염증 효과를 가진다고 보고한 바 있다. 따라서 LPS로 유도된 대식세포에서 증가된 NO에 대한 THWE의 분비 억제 효과는 참치 심장에 다량 함유된 단백질 유래 생리활성 peptide 성분에서 기인될 것으로 사료된다.
또한, IL-1β 분비량은 LPS 단독 처리 시 33.59±0.87 pg/ mL의 높은 분비량를 보였으나, THWE를 100 μg/mL의 농도로 처리 시 19.49±1.73 pg/mL로 약 42%의 억제율을 나타내 pro-inflammatory cytokine의 억제효과를 가짐을 확인하였다 (Fig. 3).
또한, pro-inflammatory cytokine의 분비량을 확인한 결과도 LPS만 처리한 대조군과 비교했을 때 참치심장물 추출물이 농도 의존적으로 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 분비량을 저해함을 보였으며, 특히 IL-1β 분비량은 100 μg/mL의 농도로 추출물 처리 시 42%의 비교적 높은 억제율을 나타내었다.
또한, pro-inflammatory cytokine의 분비량을 확인한 결과도 LPS만 처리한 대조군과 비교했을 때 참치심장물 추출물이 농도 의존적으로 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 분비량을 저해함을 보였으며, 특히 IL-1β 분비량은 100 μg/mL의 농도로 추출물 처리 시 42%의 비교적 높은 억제율을 나타내었다. 이러한 결과가 세포 사멸에 의한 감소인지 알아보기 위하여 MTT assay를 시행하였을 때, 세포 증식능은 참치심장 물 추출물 및 LPS를 처리하지 않은 무처리군과 유의적인 차이가 없음을 확인하였다. 이를 종합해 볼 때, 참치심장 물 추출물은 NO 및 pro-inflammatory cytokine과 같은 대식세포 유래 전염증성 매개물질의 분비를 효과적으로 저해함으로써 추후 천연물로서 염증치료제의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
하지만 THWE를 처리하였을 경우, positive control 군과 비교하여 추출물 농도 의존적으로 NO 생성량이 억제된 것을 확인하였으며, 특히, 최고 농도인 100 μg/mL에서 NO 생성량은 positive control 대비 32% 이상의 억제효과를 나타냈다 (Fig. 1).

후속연구

이러한 결과가 세포 사멸에 의한 감소인지 알아보기 위하여 MTT assay를 시행하였을 때, 세포 증식능은 참치심장 물 추출물 및 LPS를 처리하지 않은 무처리군과 유의적인 차이가 없음을 확인하였다. 이를 종합해 볼 때, 참치심장 물 추출물은 NO 및 pro-inflammatory cytokine과 같은 대식세포 유래 전염증성 매개물질의 분비를 효과적으로 저해함으로써 추후 천연물로서 염증치료제의 개발이 가능할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	염증은 무엇인가?	염증이란 오염물질, 내독소, 세균감염 등과 같은 외부 자극으로부터 비정상적인 세포분열 등의 발생을 방어하기 위한 내부 기작으로 조직의 손상을 재생하기 위하여 일어나는 필수적인 반응이다 [1]. 인체는 정상적으로 염증 반응이 발생할 경우에는 염증촉진성 매개체 (pro-inflammatory)의 생성이 시간이 지남에 따라 감소되고 항염증성 매개체는 증가되며 체내 염증반응이 스스로 제한되는 조절기능을 가지고 있다 [2].
	참치 부산물을 회수, 이용하는 방법의 개발이 중요한 이유는 무엇인가?	어획된 참치는 주로 통조림으로써 제조되어 이용되는데 참치가 통조림으로 가공될 때, 자숙액, 꼬리, 심장, 혈합육, 복육, 내장, 두부 등과 같은 여러 가지 부산물들이 발생되며 이는 전체 원료의 30~35% 정도를 차지한다 [18]. 최근, 통조림의 제조량이 증가함에 따라 발생되는 부산물의 양이 많아져 폐기물로 인한 환경문제뿐만 아니라 이를 효율적으로 회수, 이용하는 방법의 개발이 매우 절실한 실정이다. 이러한 참치 부산물의 기능성에 관한 연구는 참치 정소 핵산 복합물질이 면역 활성에 미치는 영향 [19], 참치 지느러미 추출물의 암세포 독성 및 quinone reductase 활성 증가 효과[20], 참치 자숙액의 항산화 활성에 감마선 조사가 미치는 영향 [21] 및 항염증 활성 [22]등 일부만이 보고가 되고 있어 다른 부산물에 대한 면역생리활성을 알아본 연구는 미미한 실정이다.
	과도하게 발생하는 부적절한 염증반응은 인체에 어떤 영향을 주는가?	7과 같은 대식세포 또는 단핵구는 그람 음성균의 세포외 막에 존재하는 내독소인 lipopolysaccharide (LPS)의 자극에 의해 tumor necrosis factor-α (TNFα), interleukin-1β (IL-1β) 및 IL-6와 같은 pro-inflammatory cytokine과 nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2)를 비롯한 여러 염증매개 인자의 분비를 촉진한다 [4]. 염증반응은 인체 내에서 필수적인 반응이나 과도하게 발생하는 부적절한 염증반응은 세포 성장과 발달에서 국소 만성 염증반응에 대한 조직 변성을 심화시키고 혈관내피의 손상과 복구 과정에서 병변을 심화시켜 암과 관절염, 천식, 다발성 경화증, 염증성 장질환과 같은 다양한 질환의 원인이 되기도 한다 [5,6]. 현재 염증반응의 억제제로서 사용되고 있는 다양한 스테로이드 및 비스테로이드성 항염증제는 장기간 복용할 시 여러 부작용을 야기할 수 있는 가능성을 가지고 있어 최근 천연물 유래의 대체제를 찾으려는 노력이 증가하고 있는 실정이다 [7].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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