[논문]베리류 에탄올 추출물의 항산화 활성

이화; 정종문

doi:10.7783/kjmcs.2015.23.1.49

베리류 에탄올 추출물의 항산화 활성
Antioxidant Activities of Various Berries Ethanolic Extract 원문보기

韓國藥用作物學會誌 = Korean journal of medicinal crop science, v.23 no.1, 2015년, pp.49 - 56

Abstract ▼ AI-Helper

Edible berries are rich in anthocyanins and phenolic acids, compounds that possess antioxidant, anti-inflammatory, and other biological activities. Antioxidant and anti-inflammatory activities of five berries including acaiberry (Euterpe oleracea Mart.), Aronia/black chokeberry (Aronia melanocarpa), blueberry (Vaccinium angustifolium), black currant (Ribes nigrum L.), and cranberry (Vaccinium macrocarpon) were assessed. The Aronia G (prepared by GreenField s.c.) exhibited the highest antioxidant activities as shown in total phenolic (138.81 mg CAE/g), flavonoid (3.68 mg QE/g), and anthocyanin (20.31 mg/g) contents compared to the other berries. It also showed the strongest scavenging activities such as DPPH (69.69 mg vitamin C/g) and ABTS radical scavenging activity ($757.79{\mu}mol$ trolox/g). Aronia G exhibited strong ferric reducing antioxidant power ($553.98{\mu}mol$ vitamin C/g), and oxygen radical absorbance capacity ($820.92{\mu}mol$ trolox/g). In addition, black currant and Aronia showed stronger inhibition of nitric oxide production in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cell than the other berries. According to the above results, the Aronia and other edible berries have notably high level of antioxidant activities and they could be used as a potential source of natural antioxidants.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

7)에 베리의 에탄올 추출물을 처리하여 nitric oxide 생성에 대한 저해 활성을 측정하였다. 이들 베리류의 항산화 및 항염증활성의 비교분석을 통하여 생리활성이 강한 베리의 우수성을 제시하고자 하였다.

가설 설정

2) Quercetin equivalent ㎎/g dry weight.
3) Cyanidin-3-glucoside equivalent ㎎/g dry weight.

제안 방법

AAPH (2,2-Azobis (2-amidinopropane)dihydrochloride, 80 mM) 50 μL를 가하고 1분 간격으로 60분 동안 Fluorescence Microplate Reader (Spectramax Gemini EM, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 형광도를 측정하였다 (excitation 485 ㎚, emission 538 ㎚, cut off 530 ㎚).
ABTS 라디칼 소거능은 Re 등 (1999)의 방법을 변형하여 측정하였다. ABTS (2,2-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt) 양이온의 생성 및 안정화를 위해 7mM ABTS 및 2.45 mM 페록소이황산칼륨 (K₂S₂O₈)의 혼합물을 빛을 차단한 상온에서 16시간 동안 방치하였다. 메탄올로 이 용액의 흡광도가 1.
ABTS 라디칼 소거능은 Re 등 (1999)의 방법을 변형하여 측정하였다. ABTS (2,2-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt) 양이온의 생성 및 안정화를 위해 7mM ABTS 및 2.
시료 처리 24시간 후, MTT (5 ㎎/mL) 20 L를 가하였다. DMSO로 생존 세포에 존재하는 색소를 용해시켜 570 ㎚에서 흡광도 (Epoch, BIOTEK instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 측정하였고 다음 식에 의해 세포생존율을 계산하였다. Cell viability (%) = (시료처리구의 흡광도/대조군 흡광도) × 100.
Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) 측정은 Huang 등 (2010)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 75 mM 인산완충액 (pH 7.
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid)로 표준검량곡선 (0.25, 0.5, 1, 2 mM)을 작성한 후 시료의 ABTS 라디칼 소거능은 μmol trolox/g dry weight으로 나타내었다.
Trolox를 양성대조군으로 하여 베리류의 ABTS 라디칼 소거능을 계산하였다 (Table 2). 아로니아G가 757.
, 2012). 베리 추출물 (최종농도 200 g/mL)이 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에 대한 nitric oxide 생성 억제활성을 측정하였다 (Fig. 2). LPS 비처리군의 nitric oxide 생성량은 2.
베리류 총 페놀화합물 함량을 Gutfinger (1981)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 100 μL에 50% Folin-Ciocalteu’s 시약 100 μL를 가하고 200 μL의 10% 탄산나트륨 (Na₂CO₃) 용액을 첨가하여 혼합하였다.
베리류의 플라보노이드 함량은 Moreno 등 (2000)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 100 μL에 100 μL의 10% 질산알루미늄 (Al(NO₃)₃) 및 100 μL의 1 μM 초산칼륨 (CH₃COOK)을 가하였다.
세포를 1 × 106 cell/mL의 농도로 희석하여 96 well plate에 100 L씩 분주하였고 세포가 부착된 후 시료 (최종농도 50, 100, 200 g/mL)를 처리하였다.
시료 100 μL에 50% Folin-Ciocalteu’s 시약 100 μL를 가하고 200 μL의 10% 탄산나트륨 (Na2CO3) 용액을 첨가하여 혼합하였다.
시료 20 μL에 ABTS 시약 1.48 mL를 혼합하여 30℃에서 6분 동안 반응시키고 734 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
0)을 1 : 19의 비율로 혼합하여 520 ㎚ 와 700 ㎚에서 흡광도를 각각 측정하였다. 시료를 동일한 비율로 0.4 M 초산나트륨 (CH₃COONa)완충액 (pH 4.5)과 혼합하여 520 ㎚와 700 ㎚에서 흡광도를 각각 측정하고 다음 계산식을 이용하여 안토시아닌의 색소함량을 계산하였다. 안토시아닌 색소량 (cyanidin-3-glucoside, ㎎/L) = (A × MW × DF × 10³ )/ε × 1; A = (A520 ㎚-A700 ㎚) pH 1.
베리류 안토시아닌의 함량은 Lee (2005)의 방법으로 측정되었다. 시료와 25 mM 염화칼륨 (KCl)완충액 (pH 1.0)을 1 : 19의 비율로 혼합하여 520 ㎚ 와 700 ㎚에서 흡광도를 각각 측정하였다. 시료를 동일한 비율로 0.
시료 추출물 100 μL에 메탄올에 녹인 DPPH 시약 (200 μM)을 900 μL 가하고 vortexing 하였다. 시료와 DPPH의 혼합물을 빛이 차단된 상온에서 30분 동안 반응시켰으며 517 ㎚에서 흡광도 (JENWAY 7315 Spectrophotometer, Bibby Scientific Ltd., Stone, England)를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 다음의 식에 따라 계산되었다.
시료의 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능은 Chung 등 (2005)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 추출물 100 μL에 메탄올에 녹인 DPPH 시약 (200 μM)을 900 μL 가하고 vortexing 하였다.
1에 나타내었다. 시료의 최종 처리농도를 50, 100, 200 g/mL로 하였을 때 모든 처리농도에서 세포 생존률이 85% 이상으로 나타나 처리농도 200 g/mL를 적용하여 베리류의 RAW 264.7 cell에 대한 nitric oxide 생성 억제활성을 측정하였다.
아질산나트륨 (NaNO2 , 25-100 M)을 사용하여 표준곡선을 작성하여 NO2−의 생성량을 계산하였다.
DPPH 소거능(%) = (1-(A-C)/B) × 100 (A: 시료 + DPPH 흡광도; C: 시료 + 메탄올 흡광도; B: 50% 에탄올 + DPPH 흡광도). 양성대조구로 비타민C (5, 10, 25, 50, 100, 150 ㎍/mL)를 사용하였다.
4 여과지로 여과하였다. 원심분리 후 잔사에 20 mL의 50% 에탄올을 가하여 상기 과정을 반복하여 추출하였다 (총 2회). 1, 2차 추출에서 얻어진 여액에 50% 에탄올을 가하여 부피를 50 mL로 조정하였고 이때 얻어진 추출물 (20 ㎎/mL)을 희석하여 실험에 사용하였다.
이후 Griess 시약 (1% sulfanilamide, 0.1% naphylethylenediamine, 2.5% phosphoric acid)을 이용하여 세포배양액에 존재하는 NO2−의 양을 측정하였다.
5% phosphoric acid)을 이용하여 세포배양액에 존재하는 NO₂⁻의 양을 측정하였다. 즉 배양액 100 L에 Griess 시약 100 L를 혼합하여 96 well plate에서 5분 동안 반응시키고 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 아질산나트륨 (NaNO₂ , 25-100 M)을 사용하여 표준곡선을 작성하여 NO₂⁻의 생성량을 계산하였다.
항산화활성의 비교를 위하여 베리류의 총 페놀화합물, 플라보노이드 및 안토시아닌의 함량을 측정하여 비교하였고, DPPH, ABTS 라디칼 소거능, ferric reducing antioxidant power, oxygen radical absorbance capacity를 측정하였다. 추가로 항염증활성의 비교를 위하여 LPS로 염증이 유도된 마우스 대식세포 (RAW 264.7)에 베리의 에탄올 추출물을 처리하여 nitric oxide 생성에 대한 저해 활성을 측정하였다. 이들 베리류의 항산화 및 항염증활성의 비교분석을 통하여 생리활성이 강한 베리의 우수성을 제시하고자 하였다.
이 혼합액에 700 μL의 50% 에탄올을 가하여 상온에서 40분 동안 반응시킨 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준검량곡선은 퀘르세틴 (10, 50, 100, 250 ㎍/mL)을 사용하여 작성하였으며 플라보노이드 함량을 ㎎ quercetin equivalent (QE)/g dry weight으로 나타내었다.
표준물질로서 비타민C (0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 mM)를 사용하였고, 철에 대한 환원력을 μmol vitamin C/g dry weight으로 나타내었다.
), 크랜베리 (Vaccinium macrocarpon) 등 5종 베리를 선정하였다. 항산화활성의 비교를 위하여 베리류의 총 페놀화합물, 플라보노이드 및 안토시아닌의 함량을 측정하여 비교하였고, DPPH, ABTS 라디칼 소거능, ferric reducing antioxidant power, oxygen radical absorbance capacity를 측정하였다. 추가로 항염증활성의 비교를 위하여 LPS로 염증이 유도된 마우스 대식세포 (RAW 264.

대상 데이터

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Fetal Bovine Serum (FBS)은 GIBCO-BRL (Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였고, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazodiumbromide (MTT), LPS, sodium nitrite, phenicillin-streptomycin (PS) 및 naphylethylenediamine sulfanilamide 등 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 제품으로 사용하였다.
메탄올로 이 용액의 흡광도가 1.0 ± 0.05 되게 희석한 후 실험에 사용하였다.
이 혼합액에 800 μL의 증류수를 가하여 상온에서 25분 동안 반응시킨 후 725 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 베리류에 풍부하게 함유되어 있는 페놀산으로 알려져(Taruscio et al., 2004) 있는 클로로겐산 (25, 50, 75, 100, 250, 500 ㎍/mL)을 표준품으로 사용하였으며 총 페놀화 합물의 함량은 ㎎ chlorogenic acid equivalent (CAE)/ g dry weight 으로 나타내었다.
본 연구에 사용된 아사이베리 (acaiberry, Euterpe oleracea Mart.), 아로니아E/블랙초크베리 (Aronia E, Aronia melanocarpa, WPPH ELENA), 아로니아G/블랙초크베리 (Aronia G, Aronia melanocarpa, GreenField s.c.), 블루베리 (blueberry, Vaccinium angustifolium), 블랙커런트 (black currant, Ribes nigrum L.), 크랜베리 (cranberry, Vaccinium macrocarpon) 6종 시료의 동결건조분말은 팬아시아마케팅(주) (서울, 대한민국)에서 제공 받았고 함께 제공 받은 제품성적서의 내용을 참고하여 각 제품의 정보를 Table 1에 나타내었다. 각 동결건조 분말시료는 −20℃에 저장하면서 실험에 사용하였다.
상기에 서술한 바와 같이 베리류의 많은 기능성이 보고되어 있으나 각종 베리의 항산화활성에 대한 비교연구는 미미한 수준이다. 본 연구에서는 기능성이 풍부한 베리류의 항산화 및 항염증활성을 비교 분석하고자 국내에서 소비되고 있는 아사이베리 (Euterpe oleracea Mart.), 아로니아/블랙초크베리 (Aronia melanocarpa), 블루베리 (Vaccinium angustifolium), 블랙커런트 (Ribes nigrum L.), 크랜베리 (Vaccinium macrocarpon) 등 5종 베리를 선정하였다. 항산화활성의 비교를 위하여 베리류의 총 페놀화합물, 플라보노이드 및 안토시아닌의 함량을 측정하여 비교하였고, DPPH, ABTS 라디칼 소거능, ferric reducing antioxidant power, oxygen radical absorbance capacity를 측정하였다.
Louis, MO, USA) 제품으로 사용하였다. 세포는 5% CO₂ incubator에서 10% FBS를 포함한 DMEM배지 (1% PS 함유)를 사용하여 배양하면서 실험에 사용하였다.
시료 100 μL에 100 μL의 10% 질산알루미늄 (Al(NO3)3) 및 100 μL의 1 μM 초산칼륨 (CH3COOK)을 가하였다.
FRAP 반응액은 다음과 같이 제조되었다. 초산나트륨 완충액 (300 mM, pH 3.6), 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (10 mM), 염화제이철 (FeCl₃, 20 mM) 용액을 10 : 1 : 1의 부피비율로 혼합하여 37℃에서 예열한 후 사용하였다. 시료 50 μL에 1.
항염증활성 측정을 위해 사용한 RAW 264.7 cell은 한국세포주은행에서 분양 받았다. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Fetal Bovine Serum (FBS)은 GIBCO-BRL (Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였고, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazodiumbromide (MTT), LPS, sodium nitrite, phenicillin-streptomycin (PS) 및 naphylethylenediamine sulfanilamide 등 시약은 Sigma-Aldrich (St.

데이터처리

모든 실험결과는 3 반복으로 측정하여 평균 및 표준편차로 나타냈으며 SPSS (PASW statistics 18)를 사용하여 ANOVA (Scheffe test)로 유의성을 검증하였다 (p < 0.05).

이론/모형

베리류 안토시아닌의 함량은 Lee (2005)의 방법으로 측정되었다. 시료와 25 mM 염화칼륨 (KCl)완충액 (pH 1.

성능/효과

Chlorogenic acid로 표준곡선을 작성하여 총페놀화합물 함량을 측정한 결과 (Table 2), 아로니아G가 138.81 mg/g으로 가장 높았으며 아로니아E는 136.23 ㎎/g이었다. 아사이베리는 71.
678)와 비슷하였다. ORAC 수치와 FRAP, ABTS 소거능, DPPH 소거능과의 상관관계 계수는 각각 0.893, 0.934, 0.911이었다. 이상의 결과로부터 베리류의 항산화활성에 기여하는 물질들 중에는 안토시아닌 외에 페놀화합물 등 다양한 물질이 많을 것으로 판단된다.
베리류의 DPPH 라디칼 소거능을 측정하여 Table 2에 나타내었다. 베리 추출물 (0.2 ㎎/mL)의 DPPH 소거능을 측정한 결과 아로니아E가 91.19%, 아로니아 G가 90.74%로 타 베리에 비해 월등히 높았고 아사이베리가 50.13%, 블루베리가 40.45%이었다. 크랜베리는 24.
76 ㎎/g으로 측정되었다. 블루베리는 10.03 ㎎/g, 블랙커런트는 7.13 ㎎/g의 함량을 나타내었고, 아사이베리와 크랜베리는 각각 2.87 ㎎/g과 2.53 ㎎/g의 안토시아닌 함량을 나타내었다. Moyer 등 (2002)은 미국 오리건 주에서 수확한 블랙커런트 생과를 액체질소로 수분을 제거한 후 70% 아세톤으로 추출하는 방법을 사용하여 안토시아닌 함량을 측정하였으며 그 함량을 128-411 ㎎/100 g FW로 보고하였다.
이는 본 연구중 블랙커런트 과육 동결건조분말의 항산화활성과 비슷한 수치이다. 비타민C를 양성대조군으로 시료의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 결과 아로니아E는 70.03 ㎎ vitamin C/g, 아로 니아G는 69.69 ㎎ vitamin C/g, 아사이베리는 38.61 ㎎ vitamin C/g, 블루베리는 31.45 ㎎ vitamin C/g, 블랙커런트는 31.20 ㎎ vitamin C/g, 크랜베리는 19.22 ㎎ vitamin C/g에 해당하는 항산화능을 지니고 있었다.
베리류 안토시아닌의 함량을 측정하여 Table 2에 나타내었다. 아로니아G의 안토시아닌 함량은 20.31 ㎎/g으로 가장 높게 측정되었고 아로니아E는 18.76 ㎎/g으로 측정되었다. 블루베리는 10.
아사이베리 처리군의 nitric oxide의 생성량은 11.09 M, 아로니아E는 10.75 M, 아로니아G는 10.91 M, 블루베리는 16.44 M, 블랙 커런트는 10.38 M로서 nitric oxide 생성을 유의적으로 감소시켰고 (p < 0.05) 크랜베리 처리군은 nitric oxide 생성량이 17.76 M으로 측정되어 nitric oxide 생성의 유의적인 감소를 나타내지 않았다.
아사이베리, 아로니아, 블루베리, 블랙커런트, 크랜베리 등 베리류에 대해 항산화 및 항염증활성을 비교 측정한 결과 아로니아의 항산화활성이 모든 항목 (총 페놀화합물, 플라보노이드, 안토시아닌 함량, DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능, Ferric reducing antioxidant power, Oxygen radical absorbance capacity)에서 가장 높은 것으로 나타났다. 항염증 활성 측정에서는 블랙커런트가 LPS로 염증이 유도된 마우스 대식세포 (RAW 264.
63 mol trolox/g의 소거능을 나타내었다. 아사이베리는 404.42 mol trolox/g으로 아로니아의 ABTS 라디칼 소거능의 50% 수준이었고, 크랜베리는 187.55 mol trolox/g으로 6종시료에서 가장 낮은 ABTS 라디칼 소거능을 나타내었다.
911이었다. 이상의 결과로부터 베리류의 항산화활성에 기여하는 물질들 중에는 안토시아닌 외에 페놀화합물 등 다양한 물질이 많을 것으로 판단된다.
, 1998). 한편 본 연구에서는 총 페놀화합물 함량과 ORAC 수치의 상관계수 계수는 0.938이었고, 플라보노이드 함량과 ORAC 수치의 상관관계 계수는 0.685로 안토시아닌과 ORAC 수치의 상관계수 (0.678)와 비슷하였다. ORAC 수치와 FRAP, ABTS 소거능, DPPH 소거능과의 상관관계 계수는 각각 0.
항염증 활성 측정에서는 블랙커런트가 LPS로 염증이 유도된 마우스 대식세포 (RAW 264.7)에서 nitric oxide의 생성을 가장 많이 저해하는 것으로 나타났으나 아사이베리 및 아로니아와 유의적인 차이는 없었다 (p < 0.05).

후속연구

05). 이상의 결과로 미루어 볼 때 항산화활성이 비교적 높은 아로니아, 아사이베리, 블루베리, 블랙커런트 등 베리류는 항산화 및 항염증 관련 질병 예방에 중요한 천연 항산화제로 작용할 수 있을 것이며 기능성식품으로 개발하기 위해서는 추가적으로 동물실험 및 인체시험 등 연구가 필요할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	자유라디칼에 의해 유발된 산화적 스트레스는 무엇에 관여하는가?	산화적 스트레스는 방사선 조사, 화학반응, 산화환원반응에 의해 생성된 자유라디칼에 의해 유발되며 세포나 조직에서암, 동맥경화, 당뇨병, 간경변, 단백질 산화, DNA 손상 및 지질의 과산화를 일으키는 주범이다 (Halliwell and Gutteridge, 2003). 자유라디칼에 의해 유발된 산화적 스트레스는 lipopolysaccharide (LPS)로 유도된 염증 반응계에서 reactive oxygen species (ROS)의 조절에 관여 (Park et al., 2010)하는데 식품에 함유되어 있는 비타민C, 토코페롤, 카로티노이드, 페놀화합물, 플라보노이드와 같은 항산화물질들은 자유라디칼에 의한 산화적 손상을 예방할 뿐만 아니라 (Niki et al., 1994), 면역 반응계에서 pro-inflammatory 활성제의 활성을 저해 (Park et al., 2010)하여 인체를 다양한 질병으로부터 보호한다.
	총 페놀화합물 함량은 어떻게 측정하였는가?	베리류 총 페놀화합물 함량을 Gutfinger (1981)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 100 μL에 50% Folin-Ciocalteu’s 시약 100 μL를 가하고 200 μL의 10% 탄산나트륨 (Na 2 CO 3 ) 용액을 첨가하여 혼합하였다. 이 혼합액에 800 μL의 증류수를 가하여 상온에서 25분 동안 반응시킨 후 725 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. 베리류에 풍부하게 함유되어 있는 페놀산으로 알려져(Taruscio et al., 2004) 있는 클로로겐산 (25, 50, 75, 100, 250, 500 ㎍/mL)을 표준품으로 사용하였으며 총 페놀화 합물의 함량은 ㎎ chlorogenic acid equivalent (CAE)/ g dry weight 으로 나타내었다.
	산화적 스트레스는 무엇에 의해 유발되는가?	산화적 스트레스는 방사선 조사, 화학반응, 산화환원반응에 의해 생성된 자유라디칼에 의해 유발되며 세포나 조직에서암, 동맥경화, 당뇨병, 간경변, 단백질 산화, DNA 손상 및 지질의 과산화를 일으키는 주범이다 (Halliwell and Gutteridge, 2003). 자유라디칼에 의해 유발된 산화적 스트레스는 lipopolysaccharide (LPS)로 유도된 염증 반응계에서 reactive oxygen species (ROS)의 조절에 관여 (Park et al.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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