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문제 정의
- 본 연구에서는 UPLC를 이용하여 neoxanthin, capsorubin, violaxanthin, capsanthin, zeaxanthin, lutein, α-cryptoxanthin, β-cryptoxanthin, lycopene, α-carotene, β-carotene 등의 카로티노이드를 동시 분석할 수 있는 조건을 확립하고, 다양한 색상의 파프리카에 함유되어 있는 카로티노이드를 정량적으로 분석하고자 하였다.
- 본 연구에서는 파프리카에서 유래하는 10종의 카로티노이드와 lycopene을 단시간에 동시 분석하는 조건을 확립함으로써 다양한 색상의 파프리카에서 유래하는 색상을 한 번에 분석할 수 있는 방법을 제시하였다. 이러한 결과는 파프리카의 색상 품질 관리를 위해 활용될 수 있을 것이며 나아가 동일한 캡시컴종인 고추와 파프리카의 고색소품종 및 다양한 색상의 품종을 개발하고자 하는 분자유전학적 연구에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
제안 방법
- 11종 카로티노이드(neoxanthin, capsorubin, violaxanthin, capsanthin, zeaxanthin, lutein, α-cryptoxanthin, β-cryptoxanthin, lycopene, α-carotene, β-carotene)를 단시간에 동시 분석할 수 있는 조건을 확립하기 위해 컬럼, 용매 조성, 농도 구배 및 유속을 검토 하여 분석법을 확립하였다.
- 추출액의 검화는 acetone 추출액 3 mL에 methanol 3 mL와 30% KOH/MeOH 1 mL를 혼합한 뒤, 암실에서 2시간 30분을 방치한뒤, diethyl ether로 추출하였다. Diethyl ether 추출액 중의 수분을 제거하기 위해 증류수, 10% NaCl 용액을 첨가하여 층 분리를 시킨 뒤 상층액만을 분획하였다. 회수한 상층액에 2% Na2SO4 용액을 첨가하여 순수한 diethyl ether 층만을 얻었다.
- 68)을 정량적으로 분석하였다(16). 그러나 파프리카에는 다양한 잔토필류가 함유되어 있으므로 high strength silica를 충전재로 이용하여 선택성을 향상시킨 HSS T3 컬럼을 이용하였다. 그결과 본 실험에서는 lutein과 zeanxanthin이 10분 이후에 검출되어 분석시간이 늘어나면서 neoxanthin, capsorubin, violaxanthin, capsanthin과 같은 잔토필류의 분리가 간섭없이 깨끗하게 분리되어잔토필류의 분석에 좀 더 선택적으로 이용할 수 있는 것으로 나타났으며 분석시간 30분 내에 cryptoxanthin과 carotene의 α-, β-isomer도 깨끗하게 분리되는 것으로 나타났다(Fig.
- 추출용 cell (22 mL)에 cellulose filter (Dionex)를 끼운 뒤에, thimble (ASE-Non-Stick Thimbles for extraction, Whatman, Schleicher & Schuell, Bioscience, Dassel, Germany)을 넣고, 파프리카 분말 시료 1 g과 규조토(ASE Prep Diatomaceous Earth, Dionex)를 thimble 안에 넣고 잘 섞어서 압착한 뒤에 추출하였다. 기기 조건은 static time 3 min, static cycles 3회, nitrogen purge 60 s, pressure 1500 psi, temperature 80oC이며 acetone으로 추출하였다. 추출 후 collection vial에 수집된 용매를 TurboVap LV를 이용하여 50oC 수욕상에서 질소 가스로 3 mL로 농축하였다.
- 또한 일반적으로 카로티노이드의 추출은 acetone, diethyl ether, hexane, cyclohexane과 같은 유기용매로 완전히 탈색이 될 때까지 지용성 분획을 분리하는 방법을 이용하고 있다(19). 따라서 본 연구에서는 전처리 과정을 단축하기 위해 초고압추출장치를 이용하여 아세톤으로 단시간에 추출하였으며 검화과정을 통해 지방산을 제거하여 분석에 이용하였다.
- 모든 시료는 가속용매추출장치를 이용하여 추출하였다. 추출용 cell (22 mL)에 cellulose filter (Dionex)를 끼운 뒤에, thimble (ASE-Non-Stick Thimbles for extraction, Whatman, Schleicher & Schuell, Bioscience, Dassel, Germany)을 넣고, 파프리카 분말 시료 1 g과 규조토(ASE Prep Diatomaceous Earth, Dionex)를 thimble 안에 넣고 잘 섞어서 압착한 뒤에 추출하였다.
- 모든 표준품은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 stock solution (2 mg/mL)을 제조한 후 1-200 μg/mL 범위 안에서 12단계로 희석하여 단순선형회귀곡선을 구해 검량식을 작성한 후 직선성과 상관성(R2)를 확인하여 정량에 이용하였다.
- 05 M acetate ammomiun 용액을 이용하여 분석하였는데 분석시간이 50분으로 많은 시료를 분석하기에는 효율성이 다소 떨어지는 조건이었다. 본 연구에서는 Chauveau-Duriot(12)과 같은 종류의 유기 용매를 사용하였으나, 혼합 비율 및 조건을 다르게 하였으며 염을 첨가하지 않고 증류수를 이용하여 총 분석시간을 30분의 더 편리한 분석 조건을 확립하였다.
- 본 연구에서는 UPLC를 이용하여 11종 카로티노이드(neoxanthin, capsorubin, violaxanthin, capsanthin, zeaxanthin, lutein, α-cryptoxanthin, β-cryptoxanthin, lycopene, α-carotene, β-carotene)를 30분내에 분석할 수 있는 방법을 확립하였으며, 이를 이용하여 다양한 색과 품종의 파프리카 내의 카로티노이드를 정량 분석하였다.
- 정성적, 정량적 분석은 Acquity UPLC H-Class (Waters, Milford, MA, USA)를 이용하였다. 분석 기기의 구성은 Tunable UV (TUV) 검출기, 컬럼 오븐, sample manager (Flow Through Needle injector, FTN), Quaternary Solvent Manager (QSM) 및 Empower 3 chromatography software로 이루어졌다.
- 시료의 추출에 가속용매추출장치(ASE, accelerated solvent extraction, ASE 150, Dionex, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하였고, 추출용액의 농축은 TurboVap LV (Biotage, Uppsala, Sweden)을 이용하였다. 정성적, 정량적 분석은 Acquity UPLC H-Class (Waters, Milford, MA, USA)를 이용하였다.
- 모든 표준품은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 stock solution (2 mg/mL)을 제조한 후 1-200 μg/mL 범위 안에서 12단계로 희석하여 단순선형회귀곡선을 구해 검량식을 작성한 후 직선성과 상관성(R2)를 확인하여 정량에 이용하였다. 이 중에서 capsanthin의 검출한계(limit of detection, LOD)와 정량한계(limit of quantification, LOQ)는 검량선에서 y 절편의 표준편차와 기울기를 이용하여 다음과 같이 계산하였다.
- 11종 카로티노이드(neoxanthin, capsorubin, violaxanthin, capsanthin, zeaxanthin, lutein, α-cryptoxanthin, β-cryptoxanthin, lycopene, α-carotene, β-carotene)를 단시간에 동시 분석할 수 있는 조건을 확립하기 위해 컬럼, 용매 조성, 농도 구배 및 유속을 검토 하여 분석법을 확립하였다. 이전의 연구에서 UPLC에 BEH C18 컬럼을 이용하여 엽채류로부터 zeaxanthin (RT=4.38분)과 lutein (RT=4.68)을 정량적으로 분석하였다(16). 그러나 파프리카에는 다양한 잔토필류가 함유되어 있으므로 high strength silica를 충전재로 이용하여 선택성을 향상시킨 HSS T3 컬럼을 이용하였다.
- 정밀도(precision)는 직선성을 나타내는 범위 중 50, 75, 100 μg/ mL의 농도에서 하루에 5회 반복 실험하여 일내(intra-day) 정밀도를 구하였으며, 5일간 반복 실험하여 일간(inter-day) 정밀도를 구하였다.
- 시료의 추출에 가속용매추출장치(ASE, accelerated solvent extraction, ASE 150, Dionex, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하였고, 추출용액의 농축은 TurboVap LV (Biotage, Uppsala, Sweden)을 이용하였다. 정성적, 정량적 분석은 Acquity UPLC H-Class (Waters, Milford, MA, USA)를 이용하였다. 분석 기기의 구성은 Tunable UV (TUV) 검출기, 컬럼 오븐, sample manager (Flow Through Needle injector, FTN), Quaternary Solvent Manager (QSM) 및 Empower 3 chromatography software로 이루어졌다.
- 추출용 cell (22 mL)에 cellulose filter (Dionex)를 끼운 뒤에, thimble (ASE-Non-Stick Thimbles for extraction, Whatman, Schleicher & Schuell, Bioscience, Dassel, Germany)을 넣고, 파프리카 분말 시료 1 g과 규조토(ASE Prep Diatomaceous Earth, Dionex)를 thimble 안에 넣고 잘 섞어서 압착한 뒤에 추출하였다.
- 정밀도(precision)는 직선성을 나타내는 범위 중 50, 75, 100 μg/ mL의 농도에서 하루에 5회 반복 실험하여 일내(intra-day) 정밀도를 구하였으며, 5일간 반복 실험하여 일간(inter-day) 정밀도를 구하였다. 측정값의 RSD (relative standard deviation, %)를 통하여 정밀도를 계산하였다. 정확도(accuracy)는 표준물질의 값에 대한 측정 평균값의 회수율(recovery)을 통하여 계산하였으며, 정밀도와 마찬가지로 일내, 일간 정확도를 계산하였다.
대상 데이터
- UPLC용 용매인 acetonitrile, methanol, methylene chloride는 Avantor (Center Valley, PA, USA)의 LC grade를 구입하여 사용하였다. H2O는 AquaMAXTM Ultra (YoungLin Instrument Co. Ltd., Seoul, Korea)를 사용하여 18.2 mΩ 수준으로 정제된 증류수를 사용하였다.
- Louis, MO, USA) 에서 구입하였다. UPLC용 용매인 acetonitrile, methanol, methylene chloride는 Avantor (Center Valley, PA, USA)의 LC grade를 구입하여 사용하였다. H2O는 AquaMAXTM Ultra (YoungLin Instrument Co.
- 본 실험에 사용한 시료인 파프리카(Capsicum annuum L.)는 적색과 3종(레드마운틴, 바이런, 시로코), 주황색과 1종(오렌지프로), 노란색과 2종(피에스타, 볼란테), 녹색과 2종(레드마운틴, 바이런) 을 농업회사법인 (주)농산무역(Gimje, Korea)로부터 구입하여 수세한 후 꼭지와 씨를 제거하고 동결 건조한 다음 분말로 만들어 실험에 사용하였다. 추출 및 전처리에 사용한 유기용매는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하였다.
- 여과에 사용한 MILLEXHV 0.22 μm PTEF syringe filter는 Millipore Corp. (Bedford, MA, USA)에서 구입하였다.
- )는 적색과 3종(레드마운틴, 바이런, 시로코), 주황색과 1종(오렌지프로), 노란색과 2종(피에스타, 볼란테), 녹색과 2종(레드마운틴, 바이런) 을 농업회사법인 (주)농산무역(Gimje, Korea)로부터 구입하여 수세한 후 꼭지와 씨를 제거하고 동결 건조한 다음 분말로 만들어 실험에 사용하였다. 추출 및 전처리에 사용한 유기용매는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 여과에 사용한 MILLEXHV 0.
- 표준품으로 사용한 neoxanthin, capsorubin, violaxanthin, capsanthin, zeaxanthin, lutein, α-cryptoxanthin, β-cryptoxanthin, lycopene, α-carotene, β-carotene은 Carotenature (Lupsingen, Switzerland)에서 구입하였으며, 내부 표준품으로 사용한 β-apo-8-carotenal은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 에서 구입하였다.
데이터처리
- 2)Different superscripts in the same column are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- 각 실험 결과는 IBM SPSS 프로그램(PASW Statistics v.18, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 일원배치 분산분석(oneway ANOVA)과 p<0.05 수준에서 Duncan의 다중범위 검정법 (Duncan’s multiple range test)을 실시하여 비교하였다.
- 모든 분석은 3회 이상 반복 수행하여 평균±표준편차로 나타내었다.
- 측정값의 RSD (relative standard deviation, %)를 통하여 정밀도를 계산하였다. 정확도(accuracy)는 표준물질의 값에 대한 측정 평균값의 회수율(recovery)을 통하여 계산하였으며, 정밀도와 마찬가지로 일내, 일간 정확도를 계산하였다.
성능/효과
- Neoxanthin은 적색 파프리카(레드마운틴)에서 0.73±0.04 mg/ 100 g dw로 가장 많이 함유되어 있었으며, capsorubin은 적색 파프리카(시로코)에서 2.37±0.15 mg/100 g dw, violaxanthin은 녹색 파프리카(레드마운틴)에서 0.68±0.04 mg/100 g dw, capsanthin은 적색 파프리카(시로코)에서 18.46±0.01 mg/100 g dw로 가장 많이 함유되어 있었다.
- Zeaxanthin은 주황색 파프리카(오렌지프로)에서 31.37± 2.81 mg/100 g dw로 다른 색의 파프리카보다 최소 5.77배 이상 많이 함유되어 있었으며, lutein은 주황색 파프리카에만 5.38±1.38 mg/100 g dw로 함유되어 있었다.
- 그결과 본 실험에서는 lutein과 zeanxanthin이 10분 이후에 검출되어 분석시간이 늘어나면서 neoxanthin, capsorubin, violaxanthin, capsanthin과 같은 잔토필류의 분리가 간섭없이 깨끗하게 분리되어잔토필류의 분석에 좀 더 선택적으로 이용할 수 있는 것으로 나타났으며 분석시간 30분 내에 cryptoxanthin과 carotene의 α-, β-isomer도 깨끗하게 분리되는 것으로 나타났다(Fig. 1).
- 본 연구에서는 적색과 3종에서 capsanthin 함량이 건조중량으로 각각 14.70±0.13 mg/100 g dw, 17.23±0.57 mg/ 100 g dw, 18.46±0.01 mg/100 g dw으로 나타나 품종에 따라 함량의 차이가 있는 것으로 나타났다.
- 본 연구에서는 UPLC를 이용하여 11종 카로티노이드(neoxanthin, capsorubin, violaxanthin, capsanthin, zeaxanthin, lutein, α-cryptoxanthin, β-cryptoxanthin, lycopene, α-carotene, β-carotene)를 30분내에 분석할 수 있는 방법을 확립하였으며, 이를 이용하여 다양한 색과 품종의 파프리카 내의 카로티노이드를 정량 분석하였다. 분석에는 HSS T3 컬럼과 acetonitrile:methanol:methylene chloride 혼합 용매와 증류수의 이동상을 이용하였으며, 개발한 조건 하에서 10종 카로티노이드를 잘 분리할 수 있었다. Capsanthin에 대한 검량선은 1-200 μg/mL 농도범위에서 상관계수(R2) 0.
- 87%의 값을 나타내어 분석에 적합함을 알 수 있었다. 이후 붉은색 파프리카 3종(레드마운틴, 바이런, 시로코), 주황색 파프리카 1종(오렌지프로), 노란색 파프리카 2종(피에스타, 볼란테), 녹색 파프리카 2종(레드마운틴, 바이런)의 카로티노이드 정량 분석을 실시하여 본 연구에서 제시한 카로티노이드의 분석 조건이 다양한 색상의 파프리카를 동시에 분석할 수 있는 방법임을 확인하였다. 본 연구에서의 분석 조건을 이용하여 파프리카 이외에도 다양한 카로티노이드 함유 식품의 정량 분석을 보다 정확하고 신속하게 수행할 수 있을 것으로 판단된다.
- 2 μg/mL의 검출한계와 정량 한계를 나타내었다. 일내 RSD값은 1.57-3.09%, 일간 RSD값은 1.98-3.83%를 나타냈으며, 회수율은 일내와 일간에서 각각 91.86-94.98, 98.10-99.87%의 값을 나타내어 분석에 적합함을 알 수 있었다. 이후 붉은색 파프리카 3종(레드마운틴, 바이런, 시로코), 주황색 파프리카 1종(오렌지프로), 노란색 파프리카 2종(피에스타, 볼란테), 녹색 파프리카 2종(레드마운틴, 바이런)의 카로티노이드 정량 분석을 실시하여 본 연구에서 제시한 카로티노이드의 분석 조건이 다양한 색상의 파프리카를 동시에 분석할 수 있는 방법임을 확인하였다.
- 정밀도(precision)는 균일한 검체로부터 여러 번 채취하여 얻은 시료를 정해진 조건에 따라 측정하였을 때 각각의 측정값들 사이의 근접성(분산정도)을 의미한다(18). 하루에 5회 반복 실험 및 5일간의 반복 실험의 결과(Table 3), capsanthin의 일내 RSD 값은 1.57-3.09%, 일간 RSD 값은 1.98-3.83%를 나타냈으며, 회수율은 일내와 일간에서 각각 91.86-94.98, 98.10-99.87%의 값을 나타내어 분석법의 정밀성과 정확성이 높은 것으로 검증되었다.
후속연구
- 이후 붉은색 파프리카 3종(레드마운틴, 바이런, 시로코), 주황색 파프리카 1종(오렌지프로), 노란색 파프리카 2종(피에스타, 볼란테), 녹색 파프리카 2종(레드마운틴, 바이런)의 카로티노이드 정량 분석을 실시하여 본 연구에서 제시한 카로티노이드의 분석 조건이 다양한 색상의 파프리카를 동시에 분석할 수 있는 방법임을 확인하였다. 본 연구에서의 분석 조건을 이용하여 파프리카 이외에도 다양한 카로티노이드 함유 식품의 정량 분석을 보다 정확하고 신속하게 수행할 수 있을 것으로 판단된다.
- 본 연구에서는 파프리카에서 유래하는 10종의 카로티노이드와 lycopene을 단시간에 동시 분석하는 조건을 확립함으로써 다양한 색상의 파프리카에서 유래하는 색상을 한 번에 분석할 수 있는 방법을 제시하였다. 이러한 결과는 파프리카의 색상 품질 관리를 위해 활용될 수 있을 것이며 나아가 동일한 캡시컴종인 고추와 파프리카의 고색소품종 및 다양한 색상의 품종을 개발하고자 하는 분자유전학적 연구에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
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