[논문]고전압 펄스 전기장에 의한 Saccharomyces cerevisiae의 세포내·외적 사멸 기작 연구

이상재; 신정규

doi:10.9721/kjfst.2015.47.1.87

고전압 펄스 전기장에 의한 Saccharomyces cerevisiae의 세포내·외적 사멸 기작 연구
Intra- and Extra-cellular Mechanisms of Saccharomyces cerevisiae Inactivation by High Voltage Pulsed Electric Fields Treatment 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.47 no.1, 2015년, pp.87 - 94

이상재 (신라대학교 바이오식품소재학과) , 신정규 (전주대학교 한식조리학과)

초록
AI-Helper

비가열 살균 기술 중 본격적인 상업적 실용화를 눈앞에 두고 있는 고전압 펄스 전기장에 의한 미생물의 사멸 기작에 대해 살펴보았다. 세포 현탁액을 고전압 펄스 전기장 처리하였을 경우 처리 시간이나 전기장의 세기가 증가할수록 세포 외액으로 세포내 물질의 유출이 증가하였으며, 세포막 투과성의 변화로 인하여 $K^+$, $Na^+$등이 이온 성분의 유출도 나타났다. 염색시약에 의한 세포의 염색에서 처리시간이 증가함에 따라 염색되는 세포의 수가 증가하였으며, 전자현미경에 의한 세포의 관찰 결과 고전압 펄스 전기장 처리를 받은 세포의 경우 처리 받지 않은 것에 비해 표면이 거칠고 굴곡이 있었으며, 세포막이 터져 세포내 물질이 외부로 유출되고 형태가 일그러진 것이 관찰되었다. 항생물질 첨가에 따른 회복 실험에서 고전압 펄스 전기장 처리에 의해 세포의 단백질 합성 체계에 손상을 입었으며, chromosomal DNA의 분리를 통한 DNA의 손상여부 관찰 결과 약 27.3%의 DNA의 손상이 발생했음을 알 수 있었다. 따라서 고전압 펄스 전기장 처리가 세포벽이나 세포막의 손상뿐만 아니라 대사 체계와 DNA에도 손상을 주는 것을 확인할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

High voltage pulsed electric fields (PEF) treatment is one of the more promising nonthermal technologies to fully or partially replace thermal processing. The objective of this research was to investigate the microbial inactivation mechanisms of PEF treatment in terms of intra- and extracellular changes in the cells. Saccharomyces cerevisae cells treated with PEF showed cellular membrane damage. This resulted in the leakage of UV-absorbing materials and intracelluar ions, which increased with increasing treatment time and electric fields strength. This indicates that PEF treatment causes cell death via membrane damage and physical rupture of cell walls. We further confirmed this by Phloxine B staining, a dye that accumulates in dead cells. Using scanning and transmission electron microscopy, we observed morphological changes as well as disrupted cytoplasmic membranes in PEF treated S. cerevisae cells. In addition, PEF treatment led to damaged chromosomal DNA in S. cerevisiae.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

전자 현미경이나 광학 현미경을 통한 관찰 결과 사멸이나 손상을 입은 세포가 단지 세포막이나 세포벽의 파괴에 의한 것만으로 보기에는 형태학적으로 변화가 없는 세포가 다수 존재하여, 고전압 펄스 전기장에 의한 세포의 사멸내지는 손상이 세포막의 파괴뿐만 아니라 다른 대사 활동이나 세포 고유 기능에 영향을 줄 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 본 실험에서는 항생 물질이나 세포 대사 저해 물질을 사용하여 세포의 특정 부위에 대한 고전압 펄스 전기장 처리의 영향을 연구하였다. 50 kV/cm, 40^oC에서 53 μs 처리한 세포를 10 μg/mL (cyclohexamide는 2.
본 연구에서는 고전압 펄스 전기장에 의한 미생물의 사멸 기작을 기존에 보고된 물리적 충격에 의한 형태적 변화뿐만 아니라 항생 물질에 의한 site action, DNA 손상 등의 생물학적 변화를 통해 사멸기작을 상세히 알아보고자 하였다.
비가열 살균 기술 중 본격적인 상업적 실용화를 눈앞에 두고 있는 고전압 펄스 전기장에 의한 미생물의 사멸 기작에 대해 살펴보았다. 세포 현탁액을 고전압 펄스 전기장 처리하였을 경우 처리 시간이나 전기장의 세기가 증가할수록 세포 외액으로 세포내 물질의 유출이 증가하였으며, 세포막 투과성의 변화로 인하여 K⁺, Na⁺등이 이온 성분의 유출도 나타났다.

제안 방법

“Before heat” fluorescence 값을 측정한 다음 96oC에서 90초간 열을 가한 후 바로 ice water로 냉각하여 보관하면서 “after heat” fluorescence 값을 측정하였다.
50 kV/cm, 40oC에서 53 μs 처리한 세포를 10 μg/mL (cyclohexamide는 2.5 μg/mL)의 농도로 항생 물질이나 대사 저해 물질이 첨가된 YM 배지에 재접종하여 26oC에서 4시간동안 배양한 후 일정량을 PDA와 PDAS 배지를 사용하여 평판 배양을 통해 세포의 회복 정도를 확인하였다.
고전압 펄스 전기장 시스템은 실험실용 용량으로 설계하여 제작하였으며, 실험 장치의 전체적인 구성의 개략도는 Fig. 1과 같다. 전체적인 시스템은 크게 전원 공급부(power supply, model JPPS2550, Jaepae Hi-Tec, Inchon, Korea), 펄스발생기(pulse generator, model JP-PGT50, Jaepae Hi-Tec, Inchon, Korea), 처리용기(treatment chamber)의 세 가지로 구성되어 있다.
고전압 펄스 전기장 처리에 의한 chromosomal DNA의 손상정도를 좀 더 정확하게 판단하기 위하여 fluorescence spectrophotometer를 이용한 ethidium bind assay를 수행하였다. EtBr는 duplex DNA에 삽입되어 형광 발색 정도를 증가시킨다.
고전압 펄스 전기장 처리에 의한 효모의 세포막 손상 정도를 확인하기 위하여 50 kV/cm, 40oC에서 전기장을 인가하면서 처리시간에 따른 세포외 액의 흡광도(Fig. 2A)와 40oC에서 53 μs동안 인가되는 전기장 세기를 달리하면서 처리한 세포외 액의 흡광도(Fig. 2B)를 나타내었다.
고전압 펄스 전기장에 의한 S. cerevisia의 chromosomal DNA의 손상 정도를 알아보았다. Chromosomal DNA가 손상되면 agarose gel 상의 DNA band가 smear되어 나타나게 된다.
고정 후 ethanol과 acetone으로 탈수한 후 Spurr’s resin으로 혼입한 다음 유리칼(ultramicroton)로 절단하고 uranyl acetate로 20분간, lead stain으로 10분간 처리하여 투과 현미경 관찰에 사용하였다.
완전히 분해된 시료액은 정용 플라스크에서 필요에 따라 탈이온수를 가하여 원래의 부피로 맞춘 다음 atomic absorption spectrophotometer (model 2380, Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 균체의 Na 및 K 이온 함량을 측정하였다(22,23). 또한 동일하게 준비된 시료액을 위의 실험 방법에서와 마찬가지로 고전압 펄스 전기장 처리한 후 원심 분리하여 상등액을 얻고 그에 대한 Na와 K 이온 함량을 측정하였다. 이들 이온 성분의 농도는 μg/mg cells (dry weight)으로 계산하여 세포의 이온 총 함량에 대한 백분율로 나타내었다.
시료의 온도가 일정한 온도에 도달하게 하고, 전원 공급부에 전원을 공급하고 power supply의 변수를 조정하여 맞추었다. 미리 계산된 처리 시간에 따라 주파수와 시료의 유속을 조정하고 처리하고자 하는 전압까지 전원을 공급하여 처리 용기 내에 전기장을 형성시켜 시료를 처리하였다. 일정 시간 시료를 처리한 후 처리 라인에서 나오는 시료를 일정량 수거하여 다음 분석을 위해 사용하였다.
미생물의 세포막 손상 또는 투과성의 변화에 의한 세포내 물질의 외부로의 유출을 측정하기 위하여 세포 외액에서 자외선 흡수 물질을 측정하였다(19-21). 세포 배양액을 멸균 증류수로 1회 세척한 후 완충액(50 mM phosphate buffer, pH 7.
본 실험에서는 50 kV/cm, 40oC에서 53 μs로 고전압 펄스 전기장 처리한 후 주사 현미경과 투과 현미경 관찰을 시도하였다.
그러나 이러한 세포내 이온의 외부 유출은 일정하지 않고 변화가 심하다(21). 본 실험에서도 세포가 고전압펄스 전기장 처리를 받으면 세포벽이나 세포막이 손상을 입는 것으로 추축되어 처리 전후의 세포내 이온 유출을 측정하였다(Fig. 3). 그러나 앞선 실험에서 UV 흡수 물질이 처리 시간이 증가함에 따라 증가한 것과는 달리 외부로 유출된 이온 농도는 10-30 μs 이후에는 큰 변화가 없었다.
몇몇 연구자들은 이에 근거하여 염색 시약을 사용하여 미생물 세포의 손상 여부를 직접 확인할 수 있는 방법으로 사용하였다(23,24,36). 본 연구에서도 고전압 펄스 전기장 처리된 효모의 세포막의 손상 정도를 확인하기 위하여 고전압 펄스 전기장 처리된 세포 현탁액과 무처리 세포 현탁액에 1% phloxine B 염색 시약을 1% (v/v) 첨가한 후 10분 후에 세포 내로의 염색 시약의 침투 정도를 화상 분석기(Diaphot 300, Nikon, Tokyo, Japan)를 통하여 관찰하였다. Fig.
1M PBS로 두 번 세척한 후 30, 50, 70, 95% ethanol로 각각 10분 동안, 그리고 100% ethanol로 15분 동안 두 번 탈수한 다음 aceton, hexamethyldisilazane (HMDS)로 각각 30분 동안 처리하여 건조한다. 세포 현탁액을 carbon tape을 이용하여 metal stub에 정착하고 3분 동안 금으로 coating한 후 주사현미경으로 관찰하였다(25). 투과 현미경 관찰을 위하여 고정액으로 고정한 시료를 0.
처리라인은 일정한 온도로 유지한 항온 수조에 담궈 시료의 온도를 일정하게 유지시켰다. 시료의 온도가 일정한 온도에 도달하게 하고, 전원 공급부에 전원을 공급하고 power supply의 변수를 조정하여 맞추었다. 미리 계산된 처리 시간에 따라 주파수와 시료의 유속을 조정하고 처리하고자 하는 전압까지 전원을 공급하여 처리 용기 내에 전기장을 형성시켜 시료를 처리하였다.
균주 보관용 평판 배양은 YM agar(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)를 사용하였으며, 사용 전까지 0^oC에 보관하였다. 실험 균주의 생리적 상태를 동일하게 유지하기 위하여 접종균은 균주 보관용 평판 배지로부터 2-3 백금이를 YM broth 100 mL가 들어있는 250 mL 삼각플라스크에 접종한 후 26^oC에서 24시간 전 배양하였다. 전배양액 2mL를 취하여 200 mL YM broth가 들어 있는 500 mL 삼각 플라스크에 접종하여 같은 온도에서 16시간 배양하여 대수 증식기 후반의 균주를 실험에 사용하였다.
앞서 추출한 DNA 40 μL (1 μg/10 μL)를 2 mL ehtidium bromide (EtBr) solution (0.5 μg/mL of EtBr/20 mM triphotassium phosphate, pH 11.8/0.5 mM EDTA)에 넣고, excitation 525 nm, emission 600 nm에서 “before heat” fluorescence 값을 측정(SFM25, Kontron Instrument Ltd., London, UK)하였다.
우선 일정량의 시료액을 취하여 균체의 건조 중량을 측정하고, 나머지 시료는 6N 질산 용액이 담긴 Kjeldahl 플라스크에 넣어 150^oC에서 10시간 동안 분해하였다. 완전히 분해된 시료액은 정용 플라스크에서 필요에 따라 탈이온수를 가하여 원래의 부피로 맞춘 다음 atomic absorption spectrophotometer (model 2380, Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 균체의 Na 및 K 이온 함량을 측정하였다(22,23). 또한 동일하게 준비된 시료액을 위의 실험 방법에서와 마찬가지로 고전압 펄스 전기장 처리한 후 원심 분리하여 상등액을 얻고 그에 대한 Na와 K 이온 함량을 측정하였다.
5-2 시간 후 고정하였다. 이 시료를 0.1M PBS로 두 번 세척한 후 30, 50, 70, 95% ethanol로 각각 10분 동안, 그리고 100% ethanol로 15분 동안 두 번 탈수한 다음 aceton, hexamethyldisilazane (HMDS)로 각각 30분 동안 처리하여 건조한다. 세포 현탁액을 carbon tape을 이용하여 metal stub에 정착하고 3분 동안 금으로 coating한 후 주사현미경으로 관찰하였다(25).
미리 계산된 처리 시간에 따라 주파수와 시료의 유속을 조정하고 처리하고자 하는 전압까지 전원을 공급하여 처리 용기 내에 전기장을 형성시켜 시료를 처리하였다. 일정 시간 시료를 처리한 후 처리 라인에서 나오는 시료를 일정량 수거하여 다음 분석을 위해 사용하였다.
Louis, MO, USA)를 사용하였다(23,24). 일정시간 고전압 펄스 전기장 처리를 가한 다음 균체 시료액 1 mL에 1% (w/v)의 phloxine B 용액 1%를 첨가한 다음 10여분이 경과한 후 화상 분석기(Image analyser, Diapot 300, Nikon, Tokyo, Japan)를 이용하여 염색된 세포와 투명한 세포를 관찰하였다.
1과 같다. 전체적인 시스템은 크게 전원 공급부(power supply, model JPPS2550, Jaepae Hi-Tec, Inchon, Korea), 펄스발생기(pulse generator, model JP-PGT50, Jaepae Hi-Tec, Inchon, Korea), 처리용기(treatment chamber)의 세 가지로 구성되어 있다. 전원 공급부는 220V AC의 입력 전원을 고전압 변압기를 통하여 승압하고 정류하여 최대 50 kV DC 전원을 발생시킬 수 있도록 하였으며 최대 허용치 전력은 50 kW이다.
주사 전자 현미경(scanning electron microscope, JSM-5410LV, JEOL, Tokyo, Japan)과 투과 현미경(transmission electron microscope, JEM-1010, JEOL, Tokyo, Japan)을 이용하여 고전압 펄스전기장 처리에 의한 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다. 40^oC, 50 kV/cm의 전기장 세기로 53 μs 처리한 세포 현탁액과 무처리 시료를 고정액(5% paraformaldehyde, 5% glutaraldehyde, 0.
2M phosphate buffered saline; PBS)으로 고정한다. 주사 현미경 관찰을 위해서 고정액으로 고정한 시료를 0.1M PBS (pH 7.2)로 세척한 후 osmium tetroxide (2% OsO₄)로 1.5-2 시간 후 고정하였다. 이 시료를 0.
축전지는 corona와 arching을 방지하기 위하여 절연유(제 1 종 silicon oil)에 담았다. 처리 용기는 전극 간격 2 mm의 처리용기를 7개 병렬 연결하여 전체 처리 용적이 0.175 mL가 되도록 하였으며, 처리용기에 인가되는 전기장의 세기와 파형은 oscilloscope (Lecroy Digital Oscilloscope, model 9300 AM, Dual 400 MHz, Teledyne LeCroy, Geneva, Switzerland)로, 전류는 전압-저항 converting을 이용하여 측정할 수 있도록 자체 제작하여 측정하였다.
0)에 현탁하여 시료액을 준비하고 이를 40^oC에서 임의의 전기장 세기와 처리 시간으로 처리하였다. 처리된 시료액을 4^oC에서 4,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상등액을 취한 다음 spectrophotometer(model 8425A diode array spectrophotometer, Hewlett Packard Co., Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 220, 260 및 280 nm에서 흡광도를 측정하여 나타내었다.
처리한 세포액을 서로 다른 생장 저해 물질 또는 대사 저해물질(nikkomycin Z, cycloheximide, tunicamycin, amphotericin B, cerulenin)을 정상적인 세포의 대사 활동에 영향을 주지않는 농도(cyclohexamide 2.5 μg/L, others 10 μg/L)(27)로 첨가한 YM broth에 2% 접종한 후 26oC에서 4시간 동안 진탕 배양하면서 매시간 일정 양을 수거하여 단계별 희석을 한 후, PDA와 PDAS에 도말한 후 26oC에서 36시간 평판 배양하여 군락 수를 계수하여 세포의 회복 정도를 관찰하였다.
펄스 발생망은 펄스의 형태와 길이를 결정하는 중요한 부분으로서 전원 공급부에서 공급된 전압을 충전하고 rising time을 결정하는 축전지(capacitor, 1800 pF/each), 펄스의 길이와 falling time을 조절하는 방전 지연 inductor (discharge delay inductor, 2-20 μH)로 되어 있으며, exponential decay pulse와 square wave pulse를 발생시킬 수 있도록 구성되었다. 축전 방식은 resonance charging을 택하였으며, 축전지에 충전된 고전압을 순간적으로 방전하는 switch로는 열음극 방전관(thyratron, 50 kV, 2,500 A)을 사용하였으며, 방전시에 발생되는 열을 식히기 위하여 cooling device를 사용하여 열을 방출하였다. 축전지는 corona와 arching을 방지하기 위하여 절연유(제 1 종 silicon oil)에 담았다.
세포 현탁액을 carbon tape을 이용하여 metal stub에 정착하고 3분 동안 금으로 coating한 후 주사현미경으로 관찰하였다(25). 투과 현미경 관찰을 위하여 고정액으로 고정한 시료를 0.1M PBS로 세척한 후 8% bovine serum albumin (BSA)로 encapsulation 하였다(26). 원심 분리에 의하여 PBS를 제거하고 8% BSA 0.

대상 데이터

본 연구에 사용된 Saccharomyces cerevisiae 균주는 ATCC 4105로 한국종균협회(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)로부터 분양받아 사용을 하였다. 균주 보관용 평판 배양은 YM agar(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)를 사용하였으며, 사용 전까지 0^oC에 보관하였다. 실험 균주의 생리적 상태를 동일하게 유지하기 위하여 접종균은 균주 보관용 평판 배지로부터 2-3 백금이를 YM broth 100 mL가 들어있는 250 mL 삼각플라스크에 접종한 후 26^oC에서 24시간 전 배양하였다.
본 연구에 사용된 Saccharomyces cerevisiae 균주는 ATCC 4105로 한국종균협회(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)로부터 분양받아 사용을 하였다. 균주 보관용 평판 배양은 YM agar(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)를 사용하였으며, 사용 전까지 0^oC에 보관하였다.
5 μg/mL)의 농도로 항생 물질이나 대사 저해 물질이 첨가된 YM 배지에 재접종하여 26^oC에서 4시간동안 배양한 후 일정량을 PDA와 PDAS 배지를 사용하여 평판 배양을 통해 세포의 회복 정도를 확인하였다. 사용된 대사 저해 물질과 항생 물질은 cycloheximide, tunicamycin, amphotericin B, nikkomycin Z, ceruenin이다. Cycloheximide는 곰팡이나 기타 eucaryotes 등의 단백질 합성을 저해하는 물질로서 ribosome의 translocation을 저해하여 단백질 합성의 진행을 저해한다(38).
세포막의 기능이 정상적인 생균은 색소를 첨가하였을 때 이를 계속 외부로 배출하여 세포 자체가 염색이 되지 않으나, 세포막이 손상된 경우에는 세포 내부로 흡수되어 세포가 염색이 된다. 이 사실을 근거로 고전압 펄스 전기장에 의한 효모 세포의 세포막 손상 여부를 확인하기 위하여 적색 색소인 phloxine B (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하였다(23,24). 일정시간 고전압 펄스 전기장 처리를 가한 다음 균체 시료액 1 mL에 1% (w/v)의 phloxine B 용액 1%를 첨가한 다음 10여분이 경과한 후 화상 분석기(Image analyser, Diapot 300, Nikon, Tokyo, Japan)를 이용하여 염색된 세포와 투명한 세포를 관찰하였다.
효모 배양액을 원심 분리하여 탈이온수에 1회 세척한 후 현탁하여 이온 분석을 위한 시료액을 준비하였다. 우선 일정량의 시료액을 취하여 균체의 건조 중량을 측정하고, 나머지 시료는 6N 질산 용액이 담긴 Kjeldahl 플라스크에 넣어 150^oC에서 10시간 동안 분해하였다.

이론/모형

DNA의 손상정도를 파악하기 위하여 Lown의 방법(28)에 의하여 ethidium binding assay를 수행하였다. 앞서 추출한 DNA 40 μL (1 μg/10 μL)를 2 mL ehtidium bromide (EtBr) solution (0.

성능/효과

이러한 대사 저해 물질들을 신선한 배지에 첨가한 후 손상을 입은 세포를 접종하여 배양할 경우 각 대사 물질에 의해 저해 받는 부분이 손상을 입은 세포는 제대로 회복이 이루지지 못하게 되고, 그 이외의 세포들은 정상적인 생육을 하게 된다(40). Table 1에서 보는 바와 같이 고전압 펄스 전기장 처리를 받은 세포는 cycloheximide, cerulenin, nikkomycin Z가 첨가된 배지에서 각각 33, 60% 정도의 회복을 보였으나, tunicamycin이나 amphotericin이 첨가된 배지에서는 79.7, 86.2% 회복되었다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 고전압 펄스 전기장 처리에 의해 세포는 기존에 밝혀진 세포벽이나 세포막의 손상(chitin 합성이나 sterol 합성 체계 손상)에 의해 사멸될 뿐만 아니라 단백질 합성 체계에도 손상을 입은 것으로 판단된다.
6). 고전압 펄스 전기장 처리를 받은 세포는 세포벽과 세포질막 사이의 구분이 불분명해진 것들이 다수 관찰되었으며, 세포내 물질도 상당 부분 유실된 것을 볼 수 있었다. 또한 세포의 형태도 일반적인 형태에서 벗어나 안으로 함몰된 구조를 가진 것이나, bud scar 부분이 터져 세포내 물질이 외부로 유출되고 있는 것도 관찰되었다.
고전압 펄스 전기장 처리를 하지 않은 세포 처리액의 열처리 전과 후의 intensity 비는 1.08±0.04로써 거의 변화가 없었으나, 처리 받은 세포 처리액은 열처리 전과 후의 intensity 비는 0.78±0.03으로 약 27.3%의 DNA가 손상된 것으로 추정되었다.
5). 그러나 고전압 펄스 전기장 처리를 받은 세포는 처리 받지 않은 것에 비해 표면이 거칠고 굴곡이 있는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 강한 전기장에 의해 세포가 충격을 받았거나, 세포벽이나 세포막 내외에 전압차에 의해 물리적인 힘을 받아 형태의 변화를 일으킨 것으로 추측되며, 또는 세포 내 물질이 외부로 유출되면서 세포가 수축하면서 생긴 주름과 같은 형태의 것으로 추측된다.
4에서 보는 바와 같이 정상적인 세포는 침투된 염색 시약을 계속 배출하여 색소가 세포내로 유입되지 않았으며, 이를 통해 세포막의 기능이 정상적으로 작용하는 것을 알 수 있었다. 그러나 고전압 펄스 전기장 처리를 받은 세포는 처리 시간이 길어짐에 따라 점차 염색된 세포의 수가 많아지는 것을 알 수 있었다. 즉, 처리 시간이 길어짐에 따라서 세포막의 기능이 소실되거나 세포막 자체가 파괴되는 세포가 많아지는 것을 알 수 있다.
2B)를 나타내었다. 그림에서 보는 바와 같이 처리 시간이 증가함에 따라, 그리고 전기장의 세기가 커짐에 따라서 급격히 증가하는 양상을 나타내어 처리 시간이나 전기장의 세기가 증가함에 따라 세포막의 손상 정도가 커지는 것을 알 수 있었다.
3%의 DNA의 손상이 발생했음을 알 수 있었다. 따라서 고전압 펄스 전기장 처리가 세포벽이나 세포막의 손상뿐만 아니라 대사 체계와 DNA에도 손상을 주는 것을 확인할 수 있었다.
고전압 펄스 전기장 처리를 받은 세포는 세포벽과 세포질막 사이의 구분이 불분명해진 것들이 다수 관찰되었으며, 세포내 물질도 상당 부분 유실된 것을 볼 수 있었다. 또한 세포의 형태도 일반적인 형태에서 벗어나 안으로 함몰된 구조를 가진 것이나, bud scar 부분이 터져 세포내 물질이 외부로 유출되고 있는 것도 관찰되었다. 그러나 세포막이나 세포벽의 형태가 변화가 없는 것도 다수 관찰되었다.
비가열 살균 기술 중 본격적인 상업적 실용화를 눈앞에 두고 있는 고전압 펄스 전기장에 의한 미생물의 사멸 기작에 대해 살펴보았다. 세포 현탁액을 고전압 펄스 전기장 처리하였을 경우 처리 시간이나 전기장의 세기가 증가할수록 세포 외액으로 세포내 물질의 유출이 증가하였으며, 세포막 투과성의 변화로 인하여 K⁺, Na⁺등이 이온 성분의 유출도 나타났다. 염색시약에 의한 세포의 염색에서 처리시간이 증가함에 따라 염색되는 세포의 수가 증가하였으며, 전자현미경에 의한 세포의 관찰 결과 고전압 펄스전기장 처리를 받은 세포의 경우 처리 받지 않은 것에 비해 표면이 거칠고 굴곡이 있었으며, 세포막이 터져 세포내 물질이 외부로 유출되고 형태가 일그러진 것이 관찰되었다.
세포 현탁액을 고전압 펄스 전기장 처리하였을 경우 처리 시간이나 전기장의 세기가 증가할수록 세포 외액으로 세포내 물질의 유출이 증가하였으며, 세포막 투과성의 변화로 인하여 K⁺, Na⁺등이 이온 성분의 유출도 나타났다. 염색시약에 의한 세포의 염색에서 처리시간이 증가함에 따라 염색되는 세포의 수가 증가하였으며, 전자현미경에 의한 세포의 관찰 결과 고전압 펄스전기장 처리를 받은 세포의 경우 처리 받지 않은 것에 비해 표면이 거칠고 굴곡이 있었으며, 세포막이 터져 세포내 물질이 외부로 유출되고 형태가 일그러진 것이 관찰되었다. 항생물질 첨가에 따른 회복 실험에서 고전압 펄스 전기장 처리에 의해 세포의 단백질 합성 체계에 손상을 입었으며, chromosomal DNA의 분리를 통한 DNA의 손상여부 관찰 결과 약 27.
2% 회복되었다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 고전압 펄스 전기장 처리에 의해 세포는 기존에 밝혀진 세포벽이나 세포막의 손상(chitin 합성이나 sterol 합성 체계 손상)에 의해 사멸될 뿐만 아니라 단백질 합성 체계에도 손상을 입은 것으로 판단된다.
전자 현미경이나 광학 현미경을 통한 관찰 결과 사멸이나 손상을 입은 세포가 단지 세포막이나 세포벽의 파괴에 의한 것만으로 보기에는 형태학적으로 변화가 없는 세포가 다수 존재하여, 고전압 펄스 전기장에 의한 세포의 사멸내지는 손상이 세포막의 파괴뿐만 아니라 다른 대사 활동이나 세포 고유 기능에 영향을 줄 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 본 실험에서는 항생 물질이나 세포 대사 저해 물질을 사용하여 세포의 특정 부위에 대한 고전압 펄스 전기장 처리의 영향을 연구하였다.
그러나 고전압 펄스 전기장 처리를 받은 세포는 처리 시간이 길어짐에 따라 점차 염색된 세포의 수가 많아지는 것을 알 수 있었다. 즉, 처리 시간이 길어짐에 따라서 세포막의 기능이 소실되거나 세포막 자체가 파괴되는 세포가 많아지는 것을 알 수 있다. 세포는 약 32 μs 정도 처리를 받으면 거의 모든 세포가 염색되어 세포막이 파괴되어진 것으로 추정할 수 있다.
한편, 투과 현미경 관찰에서는 처리를 받지 않은 세포는 세포내 구성 물질, 즉 vacuole, cytoplasmic membrane, spindle reservoir, mitochondria와 같은 것들이 모두 관찰되었으며 세포의 형태도 일정한 구형의 형태를 보였다(Fig. 6). 고전압 펄스 전기장 처리를 받은 세포는 세포벽과 세포질막 사이의 구분이 불분명해진 것들이 다수 관찰되었으며, 세포내 물질도 상당 부분 유실된 것을 볼 수 있었다.
염색시약에 의한 세포의 염색에서 처리시간이 증가함에 따라 염색되는 세포의 수가 증가하였으며, 전자현미경에 의한 세포의 관찰 결과 고전압 펄스전기장 처리를 받은 세포의 경우 처리 받지 않은 것에 비해 표면이 거칠고 굴곡이 있었으며, 세포막이 터져 세포내 물질이 외부로 유출되고 형태가 일그러진 것이 관찰되었다. 항생물질 첨가에 따른 회복 실험에서 고전압 펄스 전기장 처리에 의해 세포의 단백질 합성 체계에 손상을 입었으며, chromosomal DNA의 분리를 통한 DNA의 손상여부 관찰 결과 약 27.3%의 DNA의 손상이 발생했음을 알 수 있었다. 따라서 고전압 펄스 전기장 처리가 세포벽이나 세포막의 손상뿐만 아니라 대사 체계와 DNA에도 손상을 주는 것을 확인할 수 있었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	가열 살균을 대체할 수 있는 기술로 개발되고 있는 비가열 살균 기술로는 무엇들이 있는가?	가열 살균을 대체할 수 있는 기술로 개발되고 있는 비가열 살균 기술로는 물리적 방법인 고전압 펄스 전기장(high voltage pulsed electric fields), 초고압(high hydrostatic pressure), 광펄스(intense pulsed light), 이온화 조사(ionizing radiation), 초음파(ultrasonication) 등이 있으며, 화학적 방법인 이산화탄소, 양이온 다중고분자(polycationic polymer), 세포벽 분해 효소, 항균제 또는 항균성 효소의 이용 등이 있다(4,6,7).
	식품 산업에서 널리 사용되고 있는 가열 살균 기술의 장점은 무엇인가?	식품산업에서 널리 사용되고 있는 가열 살균 기술은 살균의 효과가 뛰어날 뿐만 아니라 살균 적용 범위가 넓고 살균 후 높은 안전성을 갖는 장점을 가지고 있다. 하지만 가열 살균은 과도할 경우 열에 의한 영양 성분의 파괴, 물성 및 색의 변화, 향기 성분의 손실, 새로운 화합물의 형성 등에 의한 품질의 손실을 피할 수 없어 소비자들의 기호 만족도를 감소시키게 되는 단점이 있다(1,2).
	식품 산업에서 사용되는 가열 살균 기술의 단점은 무엇인가?	식품산업에서 널리 사용되고 있는 가열 살균 기술은 살균의 효과가 뛰어날 뿐만 아니라 살균 적용 범위가 넓고 살균 후 높은 안전성을 갖는 장점을 가지고 있다. 하지만 가열 살균은 과도할 경우 열에 의한 영양 성분의 파괴, 물성 및 색의 변화, 향기 성분의 손실, 새로운 화합물의 형성 등에 의한 품질의 손실을 피할 수 없어 소비자들의 기호 만족도를 감소시키게 되는 단점이 있다(1,2).

참고문헌 (40)

Mertens B, Knorr D. Development of non-thermal processes for food preservation. Food Technol. 46: 124-133 (1992)
Ray B. Control by New Nonthermal Methods. pp. 495-502. In: Fundamental Food Microbiology (2nd). Ray B, Bhunia A (eds). CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, USA (2001)
Stefan T, Claudia S, Guillermo SN, Volker H. Overview of pulsed electric fields processing for food. pp. 93-114. In: Emerging Technologies for Food Processing (2nd). Sun DW (ed). Academic Press, London, UK (2014)
Leistner L, Gorris LGM. Food preservation by combined processes. Final Report of FLAIR Concerted Action No. 7, Subgroup B. EUR 15776 EN. Brussels: European Commission, Directorate-General (1994)
Calderon-Miranda ML, Barbosa-Canovas GV, Swanson BG. Inactivation of Listeria innocua in liquid whole egg by pulsed electric fields and nisin. Int. J. Food Microbiol. 51: 7-17 (1999)

상세보기
Castro AJ, Barbosa-Canovas GV, Swanson BG. Microbial inactivation of foods by pulsed electric fields. J. Food Proc. Preserv. 17: 47-73 (1993)

상세보기
Qin BL, Pothakamury UR, Vega H, Martin O, Barbosa-Canovas GV, Swanson BG. Food pasteurization using high-intensity pulsed electric fields. Food Technol. 49: 55-60 (1995)
Pothakamury UR, Monsalve-Gonzalez A, Barbosa-Canovas GV, Swanson BG. High voltage pulsed electric field inactivation of Bacillus subtilis and Lactobacillus delbrueckii. Rev. Esp. Cien. Tec. Ali. 35: 101-107 (1995)
Harrison SL. High intensity pulsed electric field and high hydrostatic pressure processing of apple juice. PhD thesis, Washington State University, Pullman, WA, USA (1996)
Zimmerman U, Pilwat G, Riemann F. Dielectric breakdown of cell membranes. Biophys. J. 14: 881-899 (1974)

상세보기
Mansel WG, Markus WR. Pulsed electric field processing of liquid foods and beverages. pp. 115-145. In: Emerging Technologies for Food Processing (2nd). Sun DW (ed). Academic Press, London, UK (2014)
McDonald CJ, Lloyd SW, Vital MA, Petersson K, Innings F. Effect of pulsed electric fields on microorganisms in orange juice using electric field strengths of 30 and 50 kV/cm. J. Food Sci. 65: 984-989 (2000)

상세보기
Elz-Martinez P, Escol-Hernandez J, Soliva-Fortuny R, Martin-Belloso O. Inactivation of Lactobacillus brevis in orange juice by high-intensity pulsed electric fields. Food Microbiol. 22: 311-319 (2005)

상세보기
Saulis G. Electroporation of cell membranes: the fundamental effects of pulsed electric fields in food processing. Food Eng. Rev. 2: 52-73 (2010)

상세보기
Joshi RP, Hu Q, Schoenbach KH, Hjalmarson HP. Improved energy model for membrane electroporation in biological cells subjected to electrical pulses. Phys. Rev. E65: 041920 (2002)
Glaser RW, Leikin SL, Chernomordik LV, Pstushenko VE, Sokirko AI. Reversible electrical breakdown of lipid bilayers: formation and evolution of pores. Biochim. Biophys. Acta. 940: 275-287 (1988)

상세보기
Tsong TY. On electroporation of cell membranes and some related phenomena. Bioelectroch. Bioener. 24: 271-295 (1990)

상세보기
Knorr D, Geulen M, Grahl T, Sitzmann W. Food application of high electric field pulses. Trends Food Sci. Tech. 5: 71-75 (1994)

상세보기
Shin JK, Pyun YR. Inactivation of Lactobacillus plantarum by pulsed-microwave irradiation. J. Food Sci. 62: 163-166 (1997)

상세보기
Hong SI. Inactivation of Lactobacillus plantarum by high pressure carbon dioxide. PhD thesis, Yonsei University, Seoul, Korea (1997)
Shimada S, Andou M, Naito N, Yamada N, Osumi M, Hayashi R. Effects of hydrostatic pressure on the ultrastructure and leakage of internal substances in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biot. 40: 123-131 (1993)
Bender GR, Sutton SVW, Marquis RE. Acid tolerance proton permeabilities and membrane ATPases of oral Streptococci. Infect. Immun. 53: 331-338 (1986)

상세보기
Tatabe W, Muraji M, Fujii T. The relationship between electropermeabilization and growth phase in a suspension of yeast cells, Saccharomyces cerevisiae. Nippon Nogeik. Kaishi 70: 563-568 (1996)
Delorme E. Transformation of Saccharomyces cerevisiae by electroporation. Appl. Environ. Microb. 55: 2242-2246 (1989)
Phothakamury UR, Barbosa-Canovas GV, Swanson BG, Spence KD. Ultrastructural changes in Staphylococcus aureus treated with pulsed electric fields. Food Sci. Technol. Int. 3: 113-121 (1997)

상세보기
Mukherjee TM, Dixon B. Diagnostic electron microscopy procedures. Microsc. Soc. Am. Bull. 23: 200-205 (1993)
El-Sherbeini M, Clemas JA. Nikkomycin Z. Supersensitivity of an echinocandin-resistant mutant of Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob. Agents Ch. 39: 200-207 (1995)

상세보기
Lown JW. Ethidium binding assay for reactive oxygen species generated from reductively activated adriamycin. Vol. 105, pp 532-539. In: Methods in Enzymology. Packer L(ed). Academic press, New York, NY, USA (1984)
Luciana IG, Ana MRP, Rosa JJ. Effect of the sequence of nisin and pulsed electric fields treatments and mechanisms involved in the inactivation of Listeria innocua in whey. J. Food Eng. 79: 188-193 (2007)

상세보기
Russell NJ, Colley M, Simpson RK, Trivett AJ, Evans RI. Mechanisms of action of pulsed high electric field (PHEF) on the membranes of food-poisoning bacteria is an 'all-or-nothing' effect. Int. J. Food Microbiol. 55: 133-136 (2000)

상세보기
Scopes RK. Protein Purification Principles and Practice. 3rd ed. Springer-Verlag Heidelberger, Berlin, Germany. pp. 46-48 (1994)
Iandolo JJ, Ordal ZJ. Repair of thermal injury of Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 91: 134-142 (1966)
Hurst A, Hughes A, Collins-Thompson DL, Shah BG. Relationship between loss of magnesium and loss of salt tolerance after sublethal heating of Staphylococcus aureus. Can. J. Microbiol. 20: 1153-1158 (1974)

상세보기
Kim DU, Pyun YR. Food processing by ohmic heating. Food Sci. Ind. 27: 21-33 (1994)
Sastry SK, Kim HJ. Ohmic heating for thermal processing of Foods: Government, industry and academic perspectives. Food Technol. 50: 253-261 (1996)
Unal R, Yousef AE, Dunne PC. Spectrophotometric assessment of bacterial cell membrane damage by pulsed electric field. Innov. Food Sci. Emerg. 3: 247-254 (2002)

상세보기
Calderon-Miranda ML, Barbosa-Canovas GV, Swanson BG. Transmission electron microscopy of Listeria innocua treated by pulsed electric fields and nisin in skimmed milk. Int. J. Food Microbiol. 51: 31-38 (1999)

상세보기
Singleton P, Sainsbury D. Dictionary of microbiology and molecular biology 3rd Ed. John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, UK. p 807 (1987)
Vespa MN, Lebecq JC. The morphology of candida albicans in two different Earle base media in the presence of tunicamycin. Mycoses 39: 271-277 (1996)

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Buazzi MM, Marth EH. Sites of action by propionate on Listeria monocytogenes. Int. J. Food Microbiol. 15: 109-119 (1992)

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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