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문제 정의
- 최근 연구에서 산화적 스트레스가 비만 및 비만관련 질병의 발병에 주요한 역할을 하고 있다고 보고되었는데, Hwang 등(21)과 Lee 등(19)에 의하면 항산화 능력을 보유하고 있는 시료가 비만을 억제하는 효능을 나타낸다고 하였다. 따라서 항산화 능력을 보유하고 있는 FCE50에 대하여 비만세포 분화에의 영향을 조사하였다. FCE50 처리에 의한 3T3-L1 세포의 분화과정 중 지방구의 생성 억제 유무를 Oil Red O 염색법을 이용하여 측정하는데, Oil Red O 염색시약은 중성지질, 콜레스테롤 등과 결합하며 지방분화로 인해 축적된 대부분의 지질은 중성지방으로 염색된 세포의 붉은색 정도를 통해 분화 정도를 확인할 수 있다(22).
제안 방법
- 2일 후 10% FBS, 1% PS와 분화유도물질(0.5 mM IBMX, 0.5 μM DEX, 10 μg/mL insulin)이 들어있는 DMEM 배지를 이틀 동안 처리하고, 다시 10% FBS와 10 μg/mL 인슐린을 포함한 DMEM 배지를 처리하였다.
- 3T3-L1 세포에 대한 FCE50의 세포독성은 XTT 시약을 이용하여 측정하였다. 3T3-L1 전지방세포를 24-well plate에 well당 5×104 세포를 분주하여 세포가 100% 밀집되게 배양하였다.
- 3T3-L1 전지방세포를 24-well plate에 well당 5×104 세포를 분주하여 세포가 100% 밀집되게 배양하였다. 3T3-L1 전지방세포에서 지방세포로 분화하는 동안 각 농도의 FCE50을 처리하여 총 8일간 분화를 유도하였다. 8일째에 PBS에 100 μM phenazine methosulfate(PMS)와 1 mg/mL XTT(PMS : XTT=1:800) 시약을 혼합한 반응액을 각 well당 1 mL씩 분주하고 2시간 동안 37°C, 5% CO2 배양기에서 배양한 후 microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 3T3-L1 전지방세포의 배양과 유지는 10% NCS와 1% PS가 함유된 DMEM 배지를 이용하여 37°C, 5% CO2의 조건에서 세포성장이 이루어졌을 때 계대배양을 하도록 하였다.
- 8일째에 PBS에 100 μM phenazine methosulfate(PMS)와 1 mg/mL XTT(PMS : XTT=1:800) 시약을 혼합한 반응액을 각 well당 1 mL씩 분주하고 2시간 동안 37°C, 5% CO2 배양기에서 배양한 후 microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- ABTS 라디칼 소거능은 Re 등(13)의 방법을 변형하였고, microplate reader(BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 능은 Blosis(14)의 방법을 변형하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- ABTS 라디칼 소거능은 Re 등(13)의 방법을 변형하였고, microplate reader(BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 능은 Blosis(14)의 방법을 변형하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. Superoxide anion 라디칼 소거능은 xanthine/xanthine oxidase system의 방법으로 spectrophotometer를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다(15).
- FCE50 처리에 의한 3T3-L1 지방세포의 지방축적량을 측정하고자 8일 동안 분화된 3T3-L1 세포의 배양액을 제거한 후, 미리 제조해 놓은 Oil Red O 실험용액으로 지방구를 염색하였다. 세포내 축적된 지방성분과 결합된 Oil Red O는 100% 이소프로판올로 용출시킨 후 microplate reader를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- FCE50에 의한 지방축적 감소가 지방형성과 주요하게 관련된 전사인자의 발현억제로부터 유도되는지를 조사하기 위하여 지방형성 억제 활성을 나타낸 발효울금 50% 주정 추출물을 3T3-L1 전지방세포의 분화 동안 처리한 후 ACC mRNA 발현량을 확인하였다. ACC는 acetyl-CoA를 malonyl CoA로 전환시키는 효소이며, ACC의 활성이 감소되면 malonyl CoA의 농도가 줄어든다.
- Oxygen radical absorbance capacity(ORAC)는 Cao와 Prior(17)의 방법을 변형하여 측정하였다. ORAC는 g당 mmole Trolox equivalents(mmole TE/g)를 이용하여 표현하였으며, microplate reader를 이용하여 excitation 485 nm와 emission 528 nm에서 형광도를 측정하였다.
- 지질과산화 억제 능은 리놀렌산의 과산화를 억제하는 정도를 측정하는 TBA 방법을 이용하여 측정하였으며(16), 대조군으로 quercetin을 사용하였다. Oxygen radical absorbance capacity(ORAC)는 Cao와 Prior(17)의 방법을 변형하여 측정하였다. ORAC는 g당 mmole Trolox equivalents(mmole TE/g)를 이용하여 표현하였으며, microplate reader를 이용하여 excitation 485 nm와 emission 528 nm에서 형광도를 측정하였다.
- 5 μM DEX, 10 μg/mL insulin)이 들어있는 DMEM 배지를 이틀 동안 처리하고, 다시 10% FBS와 10 μg/mL 인슐린을 포함한 DMEM 배지를 처리하였다. 그 이후에는 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로 교체하여 지방세포 분화를 유도하였다(9). 지방세포 분화유도 동안 시료를 처리하지 않은 군을 지방세포군으로 명명하였으며, 시료 FCE50은 150, 200 그리고 250 μg/mL의 농도로 전지방세포의 분화 동안 처리하였다.
- 따라서 이후의 세포실험에서는 안전역인 250 μg/mL의 농도로 FCE50을 처리하였다.
- FCE50의 항산화 활성은 Table 1에 나타내었다. 라디칼 소거능은 ABTS와 DPPH를 이용하여 확인하였다. ABTS assay는 potassium persulfate와의 반응으로 생성된 peroxide 라디칼이 항산화성 물질에 의해 제거되면서 청록색이 탈색되는 것을 이용하여 라디칼 소거능을 측정하는 방법이다.
- 울금의 우수한 생리활성에도 불구하고 특유의 향미, 쓴맛, 이취로 인해 기능성 소재로 이용하는 데 어려움이 있어 쓴맛과 이취를 줄이기 위해 Aspergillus oryzae를 이용한 발효과정을 거쳐 발효울금을 제조하였다(12). 본 연구에서는 발효울금 50% 주정 추출물을 대상으로 항산화 활성을 측정하였으며, 3T3-L1 지방세포를 이용하여 분화단계에서 지방축적 억제 효과를 조사하였다.
- 울금의 우수한 생리활성에도 불구하고 특유의 향미, 쓴맛, 이취로 인해 기능성 소재로 이용하는 데 어려움이 있어 쓴맛과 이취를 줄이기 위해 Aspergillus oryzae를 이용한 발효과정을 거쳐 발효울금을 제조하였다(12). 본 연구에서는 발효울금 50% 주정 추출물을 대상으로 항산화 활성을 측정하였으며, 3T3-L1 지방세포를 이용하여 분화단계에서 지방축적 억제 효과를 조사하였다.
- 이후 37°C, 5% CO2 배양기에서 1시간 동안 반응시키고 PBS로 3번 세척한 후, well당 1 mL의 PBS를 넣고 excitation 485nm, emission 535 nm에서 형광도를 측정하였다.
- 지방세포 분화유도 동안 시료를 처리하지 않은 군을 지방세포군으로 명명하였으며, 시료 FCE50은 150, 200 그리고 250 μg/mL의 농도로 전지방세포의 분화 동안 처리하였다.
- 지방세포의 분화 시 유입되는 포도당이 중성지방으로 합성･축적되므로 FCE50이 지방세포 분화 억제에 미치는 영향을 확인하기 위하여 세포내 포도당 유입량과 세포배양액으로 방출되는 유리 글리세롤 양을 측정하였다. 지방세포로 유입된 포도당은 해당과정을 통해 glyceraldehyde-3-phosphate와 dihydroxyacetone-phosphate를 거쳐 글리세롤로 전환된 후, 지방산과 결합하여 중성지방을 생성한다.
- 추출된 RNA 1 mg을 QuantiFast™SYBR®Green RT-PCR kit(Qiagen, catalogue number 204174, Venlo, Netherlands)을 이용하여 GAPDH(5'-TGGCCTCCAAGGAGTAAGAAAC-3', 3'-GGCCTCTCTCTT-GCTCTCAGTATC-5'), acetyl-CoA carboxylase(ACC)(5'-TCCCCAAGTTCTTCACGTTCA-3', 3'-CAGGCTCCAAGTGGCGATAA-5') 프라이머와 함께 reverse transcription 반응을 55°C에서 10분 수행한 후, PCR initial activation 반응을 95°C에서 5분 수행하고 denaturation 반응을 95°C에서 5초, annealing과 extension 반응을 60°C에서 10초간 40 cycle을 반응시키고 Rotorgene 6,000 software version 1.7(Corbett, Sydney, Australia)을 이용하여 분석하였다.
- 포도당 유입량을 측정하기 위하여 8일간 분화된 3T3-L1 지방세포의 배양액을 제거한 후 PBS로 2번 세척하고 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose(2-NBDG) 실험용액을 처리하였다. 이후 37°C, 5% CO2 배양기에서 1시간 동안 반응시키고 PBS로 3번 세척한 후, well당 1 mL의 PBS를 넣고 excitation 485nm, emission 535 nm에서 형광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 3T3-L1 전지방세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassans, VA, USA)에서 구입하였으며, 분화에 사용되는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 배지와 newborn calf serum(NCS), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycine(PS), phosphate buffered saline(PBS)은 Hyclone사(Logan, UT, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- AdipoRed™는 Lonza사(Walkersvile, MD, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 라디칼 소거능 측정에 사용되는 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)(ABTS), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), thiobarbituric acid, 지방세포 분화에 사용되는 insulin, 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), dexamethasone(DEX) 및 Oil Red O, XTT는 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- 발효울금은 추출기(Kyungseo machine, Incheon, Korea)에 50% 주정을 투입하고 85°C에서 4시간 동안 0.7~0.75 kg/cm2의 압력 조건에서 추출하여 동결분말 후 분쇄(Hanil, Incheon, Korea)한 것으로 한국인스팜(주)(Jeonnam, Korea)로부터 제공받았다(FCE50, 수율 19%).
- 본 연구에서 사용된 발효울금은 전라남도 진도군에서 재배 수확된 울금을 세척･멸균한 후, 2% Aspergillyus oryzae를 접종･발효하여 실험에 이용하였다. 발효울금은 추출기(Kyungseo machine, Incheon, Korea)에 50% 주정을 투입하고 85°C에서 4시간 동안 0.
데이터처리
- 각 군 간의 결과 비교 및 유의성 검정은 Student t-test를 이용하여 통계처리한 후 P<0.05 수준에서 유의수준을 검정하였다.
- 실험결과는 평균(mean)±표준편차(SD) 및 평균(mean)±표준오차(SE)로 나타내었다.
이론/모형
- 3T3-L1 지방세포에 대한 FCE50의 세포독성을 평가하기 위하여 XTT assay를 실시하였다. 다양한 농도로 FCE50을 처리하였을 때의 세포 생존율은 Fig.
- in 3T3-L1 cells. Cell viability was determined by XTT assay. Each value is expressed as the mean±SD of three independent experiments.
- DPPH 라디칼 소거 능은 Blosis(14)의 방법을 변형하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. Superoxide anion 라디칼 소거능은 xanthine/xanthine oxidase system의 방법으로 spectrophotometer를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다(15). 라디칼 소거능은 백분율로 나타냈으며, [(Abscontrol－Abssample)/Abscontrol]×100을 이용하여 계산하였다.
- 세포내 중성지방 함량은 AdipoRed™ 시약에 지시되어 있는 정량법에 따라 수행하였다.
- 라디칼 소거능은 백분율로 나타냈으며, [(Abscontrol－Abssample)/Abscontrol]×100을 이용하여 계산하였다. 지질과산화 억제 능은 리놀렌산의 과산화를 억제하는 정도를 측정하는 TBA 방법을 이용하여 측정하였으며(16), 대조군으로 quercetin을 사용하였다. Oxygen radical absorbance capacity(ORAC)는 Cao와 Prior(17)의 방법을 변형하여 측정하였다.
성능/효과
- FCE50을 250 μg/mL의 농도로 처리하였을 때 포도당 유입량이 지방세포와 비교하여 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 3).
- 2B), Oil Red O 염색 결과와 동일하게 250 μg/mL의 FCE50을 처리하였을 때 지방구 내의 중성지방 함량이 약 29% 유의적으로 감소하였다. 따라서 FCE50은 3T3-L1 지방세포의 분화 유도과정에서 지방구의 생성을 억제하여 지방축적을 억제시키는 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. Park 등(11)은 항산화 활성을 지닌 울금 메탄올 추출물을 지방세포로의 분화과정 동안 처리하여 중성지방 축적량에 대한 영향을 측정한 결과, 완전 분화된 지방세포와 비교하여 그 축적량이 감소하는 결과를 보고하였는데, 이는 본 연구의 결과와 일치한다.
- 2A). 또한 염색된 지방구를 현미경으로 관찰한 결과, 전지방세포와 비교하여 지방세포가 분화된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2C). 이와 같은 결과는 Choi 등(5)이 보고한 항산화 활성을 가진 시료가 3T3-L1 전지방세포의 분화를 억제시킴으로써 지방축적이 억제된다는 결과와 일치하였으며, Park 등(11)의 연구 결과와도 일치했다.
- 본 연구에서는 FCE50을 대상으로 다양한 항산화 실험을 실시한 결과, FCE50이 항산화능을 보유하고 있음을 확인하였다. 또한 FCE50은 3T3-L1 전지방세포의 분화과정 중 세포내 지방축적을 유의적으로 감소시키며 포도당 유입을 감소시켰다.
- 세포내 중성지방 양을 측정한 결과(Fig. 2B), Oil Red O 염색 결과와 동일하게 250 μg/mL의 FCE50을 처리하였을 때 지방구 내의 중성지방 함량이 약 29% 유의적으로 감소하였다.
- 완전히 분화된 지방세포(100%)와 비교하였을 때, FCE50을 250 μg/mL의 농도로 처리한 군에서는 지방축적이 약 26% 유의적으로 감소함으로써 지방구 생성 억제 효과가 있음을 확인하였다(Fig. 2A).
- 지방합성과 관련된 ACC 효소의 mRNA 발현량을 측정한 결과, 완전히 분화된 지방세포와 비교하여 FCE50의 처리 시 그 발현량이 현저히 감소됨을 확인하였다. 이상의 결과로부터 FCE50은 항산화 활성을 보유하고 있으며, 이는 FCE50이 지방세포로의 분화과정 중 지방형성을 유의적으로 감소시키는 결과에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
- Park 등(11)은 항산화 활성을 지닌 울금 메탄올 추출물을 지방세포로의 분화과정 동안 처리하여 중성지방 축적량에 대한 영향을 측정한 결과, 완전 분화된 지방세포와 비교하여 그 축적량이 감소하는 결과를 보고하였는데, 이는 본 연구의 결과와 일치한다. 이상의 결과를 토대로 FCE50은 항산화 활성을 지녔으며, 3T3-L1 전지방세포의 지방세포로의 분화를 억제시킬 수 있는 것으로 사료된다.
- FCE50의 ORAC value는 약 61%를 나타냈다. 이상의 연구 결과를 통해 FCE50은 항산화 능력을 보유하고 있음을 확인하였다.
- 또한 FCE50은 3T3-L1 전지방세포의 분화과정 중 세포내 지방축적을 유의적으로 감소시키며 포도당 유입을 감소시켰다. 지방합성과 관련된 ACC 효소의 mRNA 발현량을 측정한 결과, 완전히 분화된 지방세포와 비교하여 FCE50의 처리 시 그 발현량이 현저히 감소됨을 확인하였다. 이상의 결과로부터 FCE50은 항산화 활성을 보유하고 있으며, 이는 FCE50이 지방세포로의 분화과정 중 지방형성을 유의적으로 감소시키는 결과에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
- FCE50의 superoxide anion 라디칼 소거능은 약 50%의 활성을 나타냈다. 지질 과산화억제능은 불포화지방산의 자동산화 중 2차 산물인 malondialdehyde의 생성 억제를 측정하는 방법으로 FCE50은 약 39%의 지질과산화 억제 활성을 보였다. ORAC assay는 수소 전자전달과 관련하여 APPH에 의해 생성된 peroxyl 라디칼이 항산화 물질로 인하여 감소되는 정도를 형광도로 측정하는 방법으로 식품 내에 존재하는 소수성 및 친수성 성분 모두에 반응하는 특징을 가지고 있다(20).
- 추출물을 250, 300, 400, 500 및 600 μg/mL의 농도로 처리한 후 세포독성을 측정한 결과 300 μg/mL의 농도까지 세포독성이 나타나지 않았으며 현미경 상에서의 morphology 변화도 관찰되지 않았다(데이터 미게재).
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