쌀의 쌀눈은 배유에 비해 단백질, 지방, 비타민 B1 등의 영양분을 더 많이 함유하고 있다. 본 연구에서는 식물에서 발현 할 수 있는 p53플라스미드를 제작하였으며, 여러가지의 배지에서 쌀눈 발아의 최적조건을 확립하였다. p53 플라스미드는 pcDNA-p53 플라스미드에서 p53을 얻어내어 TA벡터에 subcloning을 한 후 식물 플라스미드인 pGEM-CaMV에 p53을 삽입하여 식물에서 발현 가능한 pGEM-CaMV-p53 플라스미드를 제작하였다. 그리고 효율적인 p53 유전자의 도입을 위하여 최적의 팽윤버퍼의 조성 및 배지의 조건을 확립하였다. 팽윤방법을 통한 유전자의 도입에서 팽윤버퍼는 염과 detergent의 서로 다른 농도로 조성하였지만, 이 버퍼조성 사이에서의 쌀눈 발아율의 유의한 차이는 확인되지 않았다. 또한 팽윤된 쌀눈의 발아를 극대화 시키기 위하여 고체한천배지, 액체 배지, 페이퍼 타올 배지의 3가지 조건에 대해서 발아실험을 진행하였다. 그 결과 고체배지에서의 발아율은 70% 정도로 가장 높고 액체배지에서의 발아율은 20% 정도로 가장 낮았으며, 페이퍼 타올배지에서의 발아율은 60% 정도였다. 앞서 확인한 최적의 발아조건에서 쌀눈에 p53 플라스미드를 도입하였고, 그 결과 쌀눈에서의 human p53 발현을 확인 할 수 있었다. 따라서, 팽윤방법에 의한 쌀눈에서의 효율적인 유전자 발현은 쌀의 새로운 부가가 치를 창출할 수 있을 것이다.
쌀의 쌀눈은 배유에 비해 단백질, 지방, 비타민 B1 등의 영양분을 더 많이 함유하고 있다. 본 연구에서는 식물에서 발현 할 수 있는 p53 플라스미드를 제작하였으며, 여러가지의 배지에서 쌀눈 발아의 최적조건을 확립하였다. p53 플라스미드는 pcDNA-p53 플라스미드에서 p53을 얻어내어 TA 벡터에 subcloning을 한 후 식물 플라스미드인 pGEM-CaMV에 p53을 삽입하여 식물에서 발현 가능한 pGEM-CaMV-p53 플라스미드를 제작하였다. 그리고 효율적인 p53 유전자의 도입을 위하여 최적의 팽윤버퍼의 조성 및 배지의 조건을 확립하였다. 팽윤방법을 통한 유전자의 도입에서 팽윤버퍼는 염과 detergent의 서로 다른 농도로 조성하였지만, 이 버퍼조성 사이에서의 쌀눈 발아율의 유의한 차이는 확인되지 않았다. 또한 팽윤된 쌀눈의 발아를 극대화 시키기 위하여 고체한천배지, 액체 배지, 페이퍼 타올 배지의 3가지 조건에 대해서 발아실험을 진행하였다. 그 결과 고체배지에서의 발아율은 70% 정도로 가장 높고 액체배지에서의 발아율은 20% 정도로 가장 낮았으며, 페이퍼 타올배지에서의 발아율은 60% 정도였다. 앞서 확인한 최적의 발아조건에서 쌀눈에 p53 플라스미드를 도입하였고, 그 결과 쌀눈에서의 human p53 발현을 확인 할 수 있었다. 따라서, 팽윤방법에 의한 쌀눈에서의 효율적인 유전자 발현은 쌀의 새로운 부가가 치를 창출할 수 있을 것이다.
Rice embryo is more abundant than endosperms in nutrients such as proteins, lipids, and vitamin B1. In this study, we constructed p53 plasmid that could be expressed in a plant system, and investigated optimal germination conditions in a variety of media. For construction of p53 plasmid, we performe...
Rice embryo is more abundant than endosperms in nutrients such as proteins, lipids, and vitamin B1. In this study, we constructed p53 plasmid that could be expressed in a plant system, and investigated optimal germination conditions in a variety of media. For construction of p53 plasmid, we performed p53 amplification from pCDNA-p53, subcloned to TA cloning vector, and then reconstructed into pGEM-CaMV plant expression vector. On the other hand, we prepared a variety of imbibition buffers and complete media for efficient germination of the rice embryo. Imbibition buffers prepared with different concentrations of salt or detergent showed no significant effect on germination efficiency. We prepared further culture media, such as solid agar, liquid media, and paper towel to establish the optimal conditions. Rice embryo showed germination rates of more than 70% in the solid medium, more than 60% in the paper towel medium, but less than 25% in liquid media, although germination rate did not differ with varying concentrations of salt and sucrose in culture media. Under the optimal germination conditions, we introduced the p53 plasmid using imbibition method, and finally detected human p53 gene expression in the germinated rice embryo. This method might present a novel, practical approach for evaluating efficient gene expression utilizing imbibition method in rice embryo.
Rice embryo is more abundant than endosperms in nutrients such as proteins, lipids, and vitamin B1. In this study, we constructed p53 plasmid that could be expressed in a plant system, and investigated optimal germination conditions in a variety of media. For construction of p53 plasmid, we performed p53 amplification from pCDNA-p53, subcloned to TA cloning vector, and then reconstructed into pGEM-CaMV plant expression vector. On the other hand, we prepared a variety of imbibition buffers and complete media for efficient germination of the rice embryo. Imbibition buffers prepared with different concentrations of salt or detergent showed no significant effect on germination efficiency. We prepared further culture media, such as solid agar, liquid media, and paper towel to establish the optimal conditions. Rice embryo showed germination rates of more than 70% in the solid medium, more than 60% in the paper towel medium, but less than 25% in liquid media, although germination rate did not differ with varying concentrations of salt and sucrose in culture media. Under the optimal germination conditions, we introduced the p53 plasmid using imbibition method, and finally detected human p53 gene expression in the germinated rice embryo. This method might present a novel, practical approach for evaluating efficient gene expression utilizing imbibition method in rice embryo.
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문제 정의
본 연구에서는 쌀눈에 팽윤방법을 이용하여 항암유전자인 p53을 도입하는 효율적인 방법을 연구하였으며, 이 때 요구되는 쌀눈 발아의 최적 조건을 연구하였다. 또한 연구한 최적의 발아조건을 토대로 한 실험에서 실제로 human p53 단백질이 쌀눈에서 정상적으로 발현하는지 확인하였다.
본 연구에서는 쌀눈에 팽윤방법을 이용하여 항암유전자인 p53을 도입하는 효율적인 방법을 연구하였으며, 이 때 요구되는 쌀눈 발아의 최적 조건을 연구하였다. 또한 연구한 최적의 발아조건을 토대로 한 실험에서 실제로 human p53 단백질이 쌀눈에서 정상적으로 발현하는지 확인하였다.
가설 설정
p53은 대표적인 종양억제유전자로 잘 알려져 있으며 정상세포에서의 apoptosis와 세포주기 조절에 관여한다. p53에 돌연변이가 일어나면 정상세포가 암으로 변이가 된다. p53돌연변이에 의한 암세포화는 전체 암의 50%에 해당하는 것으로 연구되었다[10].
제안 방법
현미에서 분리해낸 쌀눈에서의 human p53 유전자의 발현을 확인하기 위해 본 연구에서 확인된 최적조건의 팽윤버퍼와 고체한천배지에서 배양하였다. Human p53이 도입된 쌀눈을 확인하기 위해 배지에서 발아된 쌀눈을 중 3개를 막자 사발로 옮긴 후에 분쇄하여 단백질을 추출하였고 분해한 쌀눈을 전기영동 및 웨스턴 블로팅 과정을 통하여 p53의 발현 유무를 확인하였다. 이 때 각 쌀눈에서의 단백질 발현량의 차이가 있는지 확인하기 위해서 전기영동을 진행한 후 쿠마시 블루염색법을 진행하였다.
본 연구에서 확립된 버퍼와 배지의 최적조건에서 human p53 유전자가 도입된 형질전환 쌀눈에서의 p53 단백질 발현을 확인하였다. 3개의 쌀눈 중 2개에서 human p53 단백질의 발현을 웨스턴 블로팅을 통하여 관찰하였다.
대상 데이터
PCR과 Gel Elution과정을 통해 얻은 human p53 유전자를 TA 벡터에 ligation하여 pBT-53 플라스미드를 확보하고 이를 통하여 subcloning 과정을 거쳤다. 본 연구에서 사용된 제한효소는 XbaI과 NotI이다. 이렇게 얻은 pCaMV-p53 플라스미드는 형질전환과정에 의해 800 μg이상의 양으로 증폭하였다.
이 플라스미드들은 울산대학교 한인섭 교수, 포항공대 황인환 교수로부터 제공받았다. 본 연구에서 사용된 치료용 단백질인 human p53 유전자는 연구진이 가지고 있던 pcDNA-p53 플라스미드로부터 확보하였다.
본 연구에서 CaMV-35S 프로모터가 삽입된 플라스미드는 총 2종류로 β-glucuronidase (GUS)가 삽입된 pGEM-CaMV-GUS와 Green Fluroscence proteins (GFP)가 삽입된 pGEM-CaMV-GFP 이다. 이 플라스미드들은 울산대학교 한인섭 교수, 포항공대 황인환 교수로부터 제공받았다. 본 연구에서 사용된 치료용 단백질인 human p53 유전자는 연구진이 가지고 있던 pcDNA-p53 플라스미드로부터 확보하였다.
현미는 강원도 홍천 지방에서 생산된 오대 현미를 구매하여 사용하였다. 구매한 현미를 정제수로 5~6회 씻어내고 증류수로 채워 상온에서 약 2일 정도 암조건에서 배양시켜 발아율을 확인하였다.
이론/모형
Human p53 유전자의 정제를 위해 PCR기법을 이용하였다. 이를 위해 NCBI (http://www.
떼어낸 쌀눈에 유전자를 도입하기 위해 팽윤방법을 이용하였다[21]. 팽윤방법에 사용한 버퍼의 종류는 5가지로 1X SSC(Saline-Sodium Citrate), 0.
Human p53이 도입된 쌀눈을 확인하기 위해 배지에서 발아된 쌀눈을 중 3개를 막자 사발로 옮긴 후에 분쇄하여 단백질을 추출하였고 분해한 쌀눈을 전기영동 및 웨스턴 블로팅 과정을 통하여 p53의 발현 유무를 확인하였다. 이 때 각 쌀눈에서의 단백질 발현량의 차이가 있는지 확인하기 위해서 전기영동을 진행한 후 쿠마시 블루염색법을 진행하였다. 그 결과 쌀눈들 사이에서의 전체 단백질 발현량은 차이가 없었다(Fig.
성능/효과
팽윤버퍼에서 고체한천배지로 쌀눈들을 옮겨주고 상온에서 3일 동안 배양한 이 후, 발아율을 확인하였다. 그 결과 각각의 배지는 72, 78, 73, 70, 73%의 발아율을 보였고 이를 토대로 0.5X MSO+3% sucrose+0.6% 한천배지가 가장 최적 조건의 배지임을 확인하였다(Fig. 3A).
3C). 따라서, 배유가 없는 쌀눈에서 정상적인 발아를 위해서는 고체배지가 가장 최적의 조건이라고 할 수 있다.
페트리디쉬에 페이퍼 타올을 3~4장 깔고 총 5가지의 조건을 달리한 액체배지로 페이퍼 타올을 충분히 적신 후에 고체배지와 동일하게 쌀눈을 하나씩 옮겨 배양하였다. 발아율 확인 결과 63, 67, 65, 68, 63%로 0.5X MSO+0.3% sucrose배지가 가장 효율적인 것으로 나왔다. 이는 고체배지에서의 발아율보다 낮은 수치이다(Fig.
팽윤버퍼는 5가지의 조건을 설계하였는데, 이5가지 사이의 차이는 염의 농도차이, Detergent의 유무이다. 염의 유무측면에선 SSC를 첨가한 버퍼가 일반 증류수가 첨가된 버퍼에서 쌀눈에서의 human p53 발현율이 더 높게 나타났고, Detergent의 유무 측면에선 PEG가 첨가된 버퍼가 발현율이 높게 나타났다. 이는 플라스미드가 쌀눈의 세포 내로 이입될 때 Detergent가 이 과정을 더 효율적이게 해준다고 할 수 있다.
이를 통해 본 연구에서는 정량화된 p53 유전자의 도입률을 얻을 수는 없으나, human p53단백질이 정상적으로 쌀눈에서 발현한다는 것은 확인 할 수 있었다. 이러한 결과로 미루어 보아 형질전환 된 쌀눈을 먹음으로써 항암 단백질인 p53을 섭취할 수 있다는 가능성을 제시한다. 본 연구에서는 인위적으로 정제된 p53유전자를 얻어내어 만들어진 플라스미드를 직접 쌀 배아에 도입하였기 때문에 이 과정에서의 돌연변이 발생 가능성은 현저하게 낮아 안정적일 것이다.
3개의 쌀눈 중 2개에서 human p53 단백질의 발현을 웨스턴 블로팅을 통하여 관찰하였다. 이를 통해 본 연구에서는 정량화된 p53 유전자의 도입률을 얻을 수는 없으나, human p53단백질이 정상적으로 쌀눈에서 발현한다는 것은 확인 할 수 있었다. 이러한 결과로 미루어 보아 형질전환 된 쌀눈을 먹음으로써 항암 단백질인 p53을 섭취할 수 있다는 가능성을 제시한다.
4A). 최종적으로 p53 단백질의 발현유무를 확인하였을 때, 쌀눈 3개 중 2개에서 human p53 단백질의 발현을 53 kDa에서 확인할 수 있었다(Fig. 4B).
후속연구
그러나, 실험결과 각 버퍼의 조성 차이에 의한 쌀눈 발아율의 유의한 차이는 확인할 수 없었다. 본 연구에서는 비교적 소량의 쌀눈을 대상으로 진행된 조건이기 때문에 추후 대량으로 유전자 팽윤을 시킬 경우 버퍼의 조성은 달리 해야 할 것이다.
유사한 연구사례를 살펴보면, 락토페린을 생산할 수 있는 형질전환 벼 추출물을 쥐에게 경구투여 한 결과 면역 반응 생리 활성 효과가 나타난 사례가 있어[15], 본 연구에서의 p53 단백질 생체활성 여부에 대해서도 긍정적으로 접근할 수 있을 것이다. 앞서 언급된 대량생산체제에서의 문제점과 쌀눈에서 발현된 human p53 단백질의 생체활성에 대한 문제점이 향후 추가적인 연구를 통하여 개선 및 해결이 된다면 쌀눈을 매개로 하는 항암유전자의 발현이 다른 단백질의 도입 가능성을 제시하며, 쌀의 부가가치를 높일 수 있는 기술로 이어질 것이다.
페이퍼 타올배지에서는 고체한천배지와 비교해보면 발아율이 낮게 나타났으나 액체배지에 비하면 보다 높은 발아율을 나타내었다. 하지만 페이퍼 타올 배지도 대량으로 배양하기에 비효율적이라는 한계가 존재하며, 앞으로 대량생산체제에서 최적의 조건을 가진 배지에 대한 연구는 계속해서 진행되어야 한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
백미보다 쌀눈이 부착된 배아미를 섭취하는 것이 좋은 이유는?
그러나 쌀눈은 도정 과정에서 쌀겨와 함께 제거되며, 쌀눈과 쌀겨가 제거되고 남은 것을 백미라 한다. 이 때문에 백미는 특히 쌀눈의 비타민 B1이 부족하여 백미만을 섭취할 시 각기병과 같은 비타민 B1결핍증에 걸릴 수 있으므로 쌀눈이 부착된 배아미를 섭취해야 할 필요가 있다[8]. 또한, 현재 우리나라에서 쌀은 입맛의 고급화, 건강식품 선호, 수입 개방 확대 등으로 인해 소비가 감소하였으며, 감소된 소비에 비해 과잉생산 되고 있다.
발아실험 결과, 배지 조건에 따른 팽윤된 쌀눈의 발아율은?
또한 팽윤된 쌀눈의 발아를 극대화 시키기 위하여 고체한천배지, 액체 배지, 페이퍼 타올 배지의 3가지 조건에 대해서 발아실험을 진행하였다. 그 결과 고체배지에서의 발아율은 70% 정도로 가장 높고 액체배지에서의 발아율은 20% 정도로 가장 낮았으며, 페이퍼 타올배지에서의 발아율은 60% 정도였다. 앞서 확인한 최적의 발아조건에서 쌀눈에 p53 플라스미드를 도입하였고, 그 결과 쌀눈에서의 human p53 발현을 확인 할 수 있었다.
쌀눈의 영양학적 특징은?
쌀의 쌀눈은 배유에 비해 단백질, 지방, 비타민 B1 등의 영양분을 더 많이 함유하고 있다. 본 연구에서는 식물에서 발현 할 수 있는 p53 플라스미드를 제작하였으며, 여러가지의 배지에서 쌀눈 발아의 최적조건을 확립하였다.
참고문헌 (21)
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