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문제 정의
- 위점막 손상을 유발시킨 마우스에 대한 枸杞子 30% 에탄올 추출물의 경구 투여가 항산화 효과를 통한 위점막 손상 억제에 미치는 효과를 알아본 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 이에 본 연구는 枸杞子 추출물의 항산화 효능을 통한 위점막 손상 억제 효과를 연구하여 이를 위점막 보호제로서 활용하고자 실시하였다.
- 억제 기전 연구가 이루어지지 않았다. 이에 본 연구자는 급성 위염 동물모델을 이용하여 조직학적 관찰, 산화적 스트레스 소거능, 웨스턴 분석을 통해 枸杞구의 효능을 평가하였고, 유의성있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- ABTS 라디칼 소거활성을 이용하여 항산화효과를 측정하였다15). 7 mM ABTS와 2.
- 실험 전, 정상군(Nor)은 아무런 처치를 하지 않았으며, 위점막 손상 대조군(Veh)은 증류수를 경구투여하였고, 枸杞子 30% 에탄올 추출물(100㎎/㎏, 200㎎/㎏ body wight) 및 sucralfate(10㎎/㎏ body weight)투여군은 각 농도에 맞게 경구 투여 한 후, 1시간 방치 하였다. 그 다음 위점막 손상을 유발하기 위하여 150mM HCl/60% ethanol을 각 0.5ml 씩 경구 투여하였고 한 시간 후 개복하여 위 조직을 적출하였다16).
- 4)를 이용하여 분쇄한 후 ROS를 측정하기 위하여 25 mM DCFH-DA를 혼합하였다. 그 다음 형광 광도계를 이용하여 0분부터 매 10분씩 emission wavelength of 530 nm와 excitation wavelength of 486 nm에서 30분간 측정한 산출 값을 계산하였다.
- 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody를 처리하여 4℃에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체 (PBS-T로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBS-T로 6분마다 5회 세척하였다. 그리고 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액을 GE Healthcare (Arlington Heights, IL, USA)에 노출시킨 후, Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co., Ltd., Seoul, Korea)에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 band를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 정량하였다.
- 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암주기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다. 사료는 고형사료 (조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0% 이하, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.6% 이상, 인 0.4% 이상, 삼양사, 항생제 무첨가)와 물을 충분히 공급하였다.
- Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였다. 손상된 위점막 측정은 I-Solution lite (Innerview Co., 한국) 프로그램을 이용하여 실제 손상 부위의 면적을 측정한 후, 위 전체 면적과 비교하여 비율로 표시하였다.
- 실험 전날까지 고형사료 (항생제 무첨가, 삼양사료 Co, korea)와 물을 충분히 공급하였고 위점막 손상 유발 실험 24시간 전부터 절식 하였다. 실험 전, 정상군(Nor)은 아무런 처치를 하지 않았으며, 위점막 손상 대조군(Veh)은 증류수를 경구투여하였고, 枸杞子 30% 에탄올 추출물(100㎎/㎏, 200㎎/㎏ body wight) 및 sucralfate(10㎎/㎏ body weight)투여군은 각 농도에 맞게 경구 투여 한 후, 1시간 방치 하였다. 그 다음 위점막 손상을 유발하기 위하여 150mM HCl/60% ethanol을 각 0.
- 실험 전날까지 고형사료 (항생제 무첨가, 삼양사료 Co, korea)와 물을 충분히 공급하였고 위점막 손상 유발 실험 24시간 전부터 절식 하였다. 실험 전, 정상군(Nor)은 아무런 처치를 하지 않았으며, 위점막 손상 대조군(Veh)은 증류수를 경구투여하였고, 枸杞子 30% 에탄올 추출물(100㎎/㎏, 200㎎/㎏ body wight) 및 sucralfate(10㎎/㎏ body weight)투여군은 각 농도에 맞게 경구 투여 한 후, 1시간 방치 하였다.
- 실험동물은 군당 6마리씩 5그룹으로 구분하여 실험을 실시하였다. 실험 전날까지 고형사료 (항생제 무첨가, 삼양사료 Co, korea)와 물을 충분히 공급하였고 위점막 손상 유발 실험 24시간 전부터 절식 하였다.
- 위 조직 내 산화적 스트레스를 ROS 및 ONOO-를 이용하여 측정하였다. 위 조직은 1 mM EDTA-50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.
- 위 조직에서 염증성 매개인자인 IκB-α, p-IκBα 및 NF- κB를 측정하였다. 대조군 (0.
- 4℃에서 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리한 후 핵을 포함하고 있는 상층액을 얻어 –80℃에서 각각 냉동 보관하였다. 위 조직의 세포질의 p-IκBα, IκBα, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6, β-actin 및 핵의 NF-κB, Histone 단백질의 발현을 측정하기 위하여 10 ㎍의 단백질을 8~15% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기연동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody를 처리하여 4℃에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체 (PBS-T로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBS-T로 6분마다 5회 세척하였다.
- 위의 세포질을 얻기 위해 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM Tris–HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 15 mM CaCl2, and 1.5 M sucrose, and then 0.1 M DTT and protease inhibitor cocktail을 첨가한 buffer A를 넣고 tissue grinder (Bio Spec Product, USA)로 분쇄한 후 10% NP-40 용액을 첨가하였다. 아이스 위에서 20분간 정치시킨 후 12,000 rpm 으로 2분간 원심분리 하여 세포질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다.
- 적출한 위 조직을 고정한 다음, 광학 디지털 카메라 (Sony, Tokyo, Japan)를 이용하여 촬영하였다. 손상된 위점막 측정은 I-Solution lite (Innerview Co.
- 위 조직의 세포질의 p-IκBα, IκBα, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6, β-actin 및 핵의 NF-κB, Histone 단백질의 발현을 측정하기 위하여 10 ㎍의 단백질을 8~15% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기연동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody를 처리하여 4℃에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체 (PBS-T로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBS-T로 6분마다 5회 세척하였다. 그리고 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액을 GE Healthcare (Arlington Heights, IL, USA)에 노출시킨 후, Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co.
- 아이스 위에서 20분간 정치시킨 후 12,000 rpm 으로 2분간 원심분리 하여 세포질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다. 핵을 얻기 위해 10% NP-40가 더해진 buffer A에 두 번 헹구고 100 ㎕의 buffer C (50 mM HEPES, 50 mM KCl, 0.3 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF and 10% glycerol)를 첨가해 재부유 시킨 뒤 10분마다 vortex을 3번 하였다. 4℃에서 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리한 후 핵을 포함하고 있는 상층액을 얻어 –80℃에서 각각 냉동 보관하였다.
대상 데이터
- ICR 마우스 6주령 수컷 30마리를 오리엔트(경기, 한국)에서 구입하여 1주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암주기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다.
- Nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare (Little. Chalfont, UK)에서 구입하였고, Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), phosphorylation inhibitor of nuclear factor kappa Bα (p-IκBα), inhibitor of nuclear factor kappa Bα (IκBα) phosphorylation of nuclear factor-kappa B (NF-κB), Inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), Histone, β-actin 과 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였으며, Protease inhibitor mixture, DMSO, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka. Japan)에서 구입하였다. 또한 Sucrose octasulfate-aluminum complex(Sucralfate)는 Sigma aldrich(St.
- 枸杞子 450 g을 분쇄한 후, 10배의 용량의 30% Ethanol을 이용하여 24시간 동안 상온 추출 하였다. 얻어진 枸杞子 추출물을 감압여과 한 후, 농축액을 동결 건조하여 33.
- Japan)에서 구입하였다. 또한 Sucrose octasulfate-aluminum complex(Sucralfate)는 Sigma aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며 2', 7'- Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)와 Dihydrorhodamine 123는 Molecular Probes (Eugene, OR, U.S.A.)에서 ECL Western Blotting Detection Reagents는 GE Healthcare 로부터 구입하여 사용하였다. 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit는 Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용한 枸杞子(Lycium chinense)는 옹기한약국 (대구, 한국)에서 구입한 것을 생약규격집에 맞추어 관능 검사하여 약전규격에 합격한 것만을 정선하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 수치는 mean±standard error (Mean±S.E)로 표시하였으며, SPSS (18.0 for Windows program)을 사용하여 one-way analysis of variance (ANOVA)로 각 자료의 통계적 유의성을 검증 하였고, 대조군과 투여군 사이에 p-value<0.05 일 때 유의성이 있는 것으로 판정 하였다.
이론/모형
- ROS 및 ONOO-의 실험방법은, 각각 Ali et al 과 Kooy et al의 방법을 이용하여 시행하였다17, 18).
- 전자공여능 (electron donating ability)은 DPPH free radical 소거법으로 측정되었다14). DPPH는 프리라디칼(free radical)이며, 용액은 보라색 (deep violet)이다.
성능/효과
- Ⅱ.-6 의 발현을 확인한 결과, COX-2의 발현은 정상군 (1.00± 0.08 (p<0.001))에 비해 대조군 (1.52±0.06)은 유의성 있게 증가하였으며 양성대조군인 SC10 투여군 (1.17±0.09 (p<0.01))에서는 감소하였고, LCE100 투여군 (1.37±0.10) LCE200 투여군 (1.25±0.10 (p<0.05))에서도 농도 의존적으로 감소하였다.
- 1. 枸杞子 30% 에탄올 추출물의 섭취는 150mM HCl/60% ethanol로 유발된 위점막 손상 마우스에서 위 조직의 육안적 손상을 농도 의존적으로 감소시켰다.
- 2. 枸杞子 30% 에탄올 추출물의 섭취는 150mM HCl/60% ethanol로 유발된 위점막 손상마우스에서 조직의 ROS 및 ONOO-를 양성대조군인 sucralfate와 유사하게 감소시켰다.
- 3. 枸杞子 30% 에탄올 추출물의 섭취는 150mM HCl/60% ethanol로 유발된 위점막 손상 마우스에서 조직의 IκB α를 증가시켰고 이에 맞게 p-IκBα, NF-κB의 발현 또한 유의하게 감소시켰다.
- 4. 枸杞子 30% 에탄올 추출물의 섭취는 150mM HCl/60% ethanol로 유발된 위점막 손상 마우스에서 조직에서 염증성 매개인자인 COX-2, iNOS, TNF-α를 유의하게 감소시켰으며, IL-6는 감소하는 경향만 보였다.
- ABTS 라디칼 소거 활성 효과 측정 실험에서는 ascorbic acid 및 LCE 30% 에탄올 추출물의 IC값이 각각 2.20± 0.02㎍/㎖, 107.87±0.63㎍/㎖로 나타나 LCE 30% 에탄올 추출물은 농도 의존적으로 항산화효과가 있음을 확인하였다(Fig. 1).
- 88%로 정상군에 비하여 매우 높게 나타났다. LCE100 투여군은 27.87±8.18%, LCE200 투여군은 21.87±2.08% (p<0.001)로 농도 의존적으로 위점막 보호효과를 나타내었으며 LCE200 투여군의 경우 양성대조군인 SC10 투여군(21.27±3.73%)와 유사하게 손상 정도가 감소되었다(Fig. 2).
- 枸杞子 30% 에탄올 추출물의 항산화 효능을 평가하기 위하여 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과, IC값이 각각 164.80±2.4 ㎍/㎖, 107.87±0.63㎍/㎖ 로 나타났다. 이로서 항산화 효과를 충분히 가지는 것을 확인하였으며, 위점막 손상 동물모델에 효과가 있을 것으로 예상되었다.
- 따라서 枸杞子 30% 에탄올 추출물의 투여가 급성 위염 유발 마우스 모델에서 위점막 손상 억제에 효과가 있다고 사료된다.
- 것으로 나타났다. 또한 IκBα의 발현에서도 양상이 일치함을 확인하였다.
- 또한 NFkB를 통하여 발현되는 COX-2, INOS, TNF-α, IL-6를 효과적으로 저해시킴으로서 위점막을 보호하는 것으로 보여진다(Fig. 6).
- 부검 후 분쇄한 위 조직을 이용하여 산화적 스트레스의 마커인 ROS를 측정한 결과, 대조군 (393±46 fluorescence/ ㎖/mg protein)은 정상군 (310±13 fluorescence/㎖/mg protein (p<0.001))에 비해 수치가 증가하였고, 양성대조군인 SC10 투여군 (300±19 fluorescence/㎖/mg protein)에서는 유의성 있게 감소하였으며 LCE100 투여군 (358±33 fluorescence/㎖/mg protein) 및 LCE200 투여군 (309± 19 fluorescence/㎖/mg protein)에서는 농도 의존적으로 감소하였으나 유의성은 없었다.
- 부검 후 적출된 위를 촬영하고 이미지 분석 프로그램을 활용하여 위의 전체면적 및 염증, 발적, 출혈 부위를 측정한 결과, 정상군에서는 손상부위가 나타나지 않았으며 위점막 손상대조군에서는 심한 손상을 나타내었다. 하지만 枸杞子 30% 에탄올 추출물은 농도 의존적으로 개선효과를 보였으며, 특히 枸杞子 30% 에탄올 추출물 200㎎/㎏ 투여군에서는 양성대조군인 sucralfate 10㎎/㎏ 투여군과 유사한 효과를 보였다.
- 뿐만 아니라 위 조직에서 염증성 사이토카인 및 매개인자를 분석한 결과 NFkB의 발현을 현저히 감소시켰고, COX-2, INOS, TNF-α, IL-6 및 p-IκBα를 억제하여 위점막 손상을 막는 것으로 나타났다. 또한 IκBα의 발현에서도 양상이 일치함을 확인하였다.
- 아무런 처치를 하지 않은 정상군인 마우스의 위점막 손상검사 결과, 점막의 손상이 발견되지 않았으나 위염 유발 전 증류수를 처리한 대조군은 위점막이 150 mM HCl/60% ethanol에 의해 손상을 받아 출혈, 발적 및 부종이 발생하였고, 손상 부위 면적 비율은 68.17±9.88%로 정상군에 비하여 매우 높게 나타났다. LCE100 투여군은 27.
- 위 조직을 분쇄하여 ROS 및 ONOO를 측정한 결과 대조군에서는 높은 산화적 스트레스를 보였고, 枸杞子 30% 에탄올 추출물 투여군에서는 농도 의존적으로 감소하는 결과를 나타내어 위점막 손상 보호효과는 산화적 스트레스를 억제함으로서 나타나는 것으로 유추할 수 있었다.
- 63㎍/㎖ 로 나타났다. 이로서 항산화 효과를 충분히 가지는 것을 확인하였으며, 위점막 손상 동물모델에 효과가 있을 것으로 예상되었다.
- 이상의 결과를 종합해보면 枸杞子 30% 에탄올 추출물은 항산화 효과를 충분히 가지고 있으며, 급성 위염 유발 동물모델에서 산화적 스트레스를 억제하여 NFkB의 발현을 감소시킨다. 또한 NFkB를 통하여 발현되는 COX-2, INOS, TNF-α, IL-6를 효과적으로 저해시킴으로서 위점막을 보호하는 것으로 보여진다(Fig.
- 심한 손상을 나타내었다. 하지만 枸杞子 30% 에탄올 추출물은 농도 의존적으로 개선효과를 보였으며, 특히 枸杞子 30% 에탄올 추출물 200㎎/㎏ 투여군에서는 양성대조군인 sucralfate 10㎎/㎏ 투여군과 유사한 효과를 보였다.
- 항산화 효능을 평가하기 위해 실시한 DPPH 라디칼 소거능 측정에서 ascorbic acid의 IC50값은 1.43±0.07㎍/㎖로 나타난 반면, LCE 30% 에탄올 추출물은 IC50 164.80±2.4 ㎍/㎖의 DPPH 라디칼 소거능이 보였다(Fig. 1).
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