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문제 정의
- 이러한 문제점을 해결하고자 다양한 버섯을 이용하여 합성염료의 분해하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 한국산 구름 버섯이 tryphenyl methane계 염료 중 crystal violet (CV)과 malachite green (MG)을 분해할 수 있는지를 조사하고, 이에 이용되는 효소의 종류와 활성도를 측정하고자 하였다.
제안 방법
- 단백질 정량은 Bradford (1976)의 방법을 사용했다. 1 mg/ml의 bovine serum albumin (BSA; Sigma Chemical Co., USA)을 이용하여 standard 그래프를 그리고, 이를 기준으로 샘플의 단백질량을 mg 단위로 측정하였으며 이것을 효소활성 측정에 사용하였다.
- 분양 받은 균주의 균사를 2호 cork borer를 사용하여 직경 5 mm로 뚫어서 disc를 만든 후 염료가 첨가된 지름 88 mm PDA 배지 한가운데에 접종하였다. 25oC의 배양기에서 암 배양하면서 72시간 마다 균사의 생장과 염료의 탈색 정도를 측정하였다. 고체 상태에서의 탈색율은 다음 식으로 계산하였다.
- H2O2가 기질인 veratryl alcohol을 산화시켜 veratrylaldehyde (ε310 = 9,300 M-1 cm-1)가 되는 정도를 측정하였다.
- , Japan)을 사용하였다. 각각의 염료를 50 mg/L의 농도로 조성하여 PDA (Potato dextrose agar) 또는 PDB (Potato dextrose broth)에 첨가하여 사용하였다.
- 버섯이 가지고 있는 효소 중 리그닌 분해에 사용하는 것으로 알려진 LiP, MnP, laccase의 활성을 탈색율 과정에서 조사하였다. 세 가지 효소 중에서 laccase가 CV와 MG의 분해과정에서 가장 높게 측정되었으며 시간이 지나면서 증가하는 추세를 보였다(Figs.
- 액체 상태에서의 탈색율을 측정하는 샘플을 사용하여 효소활성 정도를 측정하였다. 단백질 정량은 Bradford (1976)의 방법을 사용했다.
- 30 ml의 PDB에 배양한 5 mm 직경의 균사체 disc 10개를 접종하고 진탕 배양기에서 20 rpm으로 25oC에서 7일간 암 배양한 후 염료가 녹아있는 PDB를 20 ml 첨가하였는데 이때 염료의 최종 농도가 50 mg/L 되도록 조정하였다. 염료를 첨가한지 2시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일 후에 샘플을 취하여 탈색율을 측정하였다. 측정 방법은 배양액을 Advantec 2호 거름종이로 걸러낸 후, OPTIZEN 2120UV (Mecasys, Korea)로 각 염료의 최대흡수파장(λmax A)에서 흡광도를 측정하였다.
- 5) 400 μl와 40 mM veratryl alcohol 50 μl, H2O2 50 μl 혼합액에 샘플 500 μl를 넣은 직후 310 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이를 상온에서 10분 반응시킨 후 다시 310 nm에서의 흡광도 측정하여 값의 차이를 비교하였다. 1 unit은 1분간 생성된 산화물(㎛ol)의 양으로 정의하였으며 측정된 효소활성을 샘플의 총 단백질량으로 나누어서 계산하였다.
- 측정 방법은 배양액을 Advantec 2호 거름종이로 걸러낸 후, OPTIZEN 2120UV (Mecasys, Korea)로 각 염료의 최대흡수파장(λmax A)에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 기질로 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline6-sulfonic acid) (ABTS; ε420 = 36,000 M-1 cm-1)를 사용하였다.
- 본 실험에는 담자균문 구멍장이버섯목, 구멍장이버섯과, 송편버섯속에 속하는 백색부후균인 구름버섯(Trametes versicolor, IUM1700)을 인천대학교 버섯균주 은행(CCM; Culture Collection of Mushrooms)에서 분양 받아 실험에 사용하였다. 분양받은 균주는 PDA 평판배지(Potato dextrose agar; potato 200g, dextrose 20g, agar 20g, 증류수 1,000ml)에 10일간 25oC에서 암배양한 후 실험에 사용하였다.
- , 1997). 본 연구에서 이용된 구름버섯(Trametes versicolor)은 laccase와 MnP를 분비하는 것으로 알려져 있다(Johansson and Nyman, 1987; Goudopoulou et al., 2010; Baek et al., 2014).
- 본 실험에는 담자균문 구멍장이버섯목, 구멍장이버섯과, 송편버섯속에 속하는 백색부후균인 구름버섯(Trametes versicolor, IUM1700)을 인천대학교 버섯균주 은행(CCM; Culture Collection of Mushrooms)에서 분양 받아 실험에 사용하였다. 분양받은 균주는 PDA 평판배지(Potato dextrose agar; potato 200g, dextrose 20g, agar 20g, 증류수 1,000ml)에 10일간 25oC에서 암배양한 후 실험에 사용하였다.
- 실험에는 triphenyl methane계 염료인 crystal violet (CV; Junsei Chemical Co., Japan)과 malachite green (MG; Shinyo Chemical Co., Japan)을 사용하였다. 각각의 염료를 50 mg/L의 농도로 조성하여 PDA (Potato dextrose agar) 또는 PDB (Potato dextrose broth)에 첨가하여 사용하였다.
이론/모형
- Laccase의 활성도 측정 역시 Hong (2013)의 방법을 따라 기질로 ABTS (ε420 = 36,000 M-1 cm-1)를 사용하였다.
- Lignin peroxidase (LiP)의 활성도는 DeSouza-Ticlo (2008)와 Kirtikara et al (1995)의 방법을 참고하여 측정하였다. H2O2가 기질인 veratryl alcohol을 산화시켜 veratrylaldehyde (ε310 = 9,300 M-1 cm-1)가 되는 정도를 측정하였다.
- Manganese peroxidase (MnP)의활성도의측정은 Hong (2013)의 방법을 따랐다. 기질로 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline6-sulfonic acid) (ABTS; ε420 = 36,000 M-1 cm-1)를 사용하였다.
- 고체 상태에서의 염료의 탈색율을 측정하는 방법은 Jayasinghe et al. (2008)의 방법을 따랐다. 분양 받은 균주의 균사를 2호 cork borer를 사용하여 직경 5 mm로 뚫어서 disc를 만든 후 염료가 첨가된 지름 88 mm PDA 배지 한가운데에 접종하였다.
- 액체 상태에서의 탈색율을 측정하는 샘플을 사용하여 효소활성 정도를 측정하였다. 단백질 정량은 Bradford (1976)의 방법을 사용했다. 1 mg/ml의 bovine serum albumin (BSA; Sigma Chemical Co.
- 액체 상태에서의 탈색율 실험은 Jayasinghe et al. (2008) 의 방법을 참조하여 수행하였다. 30 ml의 PDB에 배양한 5 mm 직경의 균사체 disc 10개를 접종하고 진탕 배양기에서 20 rpm으로 25oC에서 7일간 암 배양한 후 염료가 녹아있는 PDB를 20 ml 첨가하였는데 이때 염료의 최종 농도가 50 mg/L 되도록 조정하였다.
성능/효과
- MG 역시 구름버섯 균사의 생장을 방해하지만 CV 배지에서 보다 MG 배지에서 균사의 생장이 2배나 빨랐다. MG의 탈색은 균사생장과 동시에 관찰되었으며 그 탈색 속도가 CV 탈색보다 월등히 빨라 접종 3일 만에 DI 값이 1이 되었으며 그 후로는 DI 값이 1 이상을 보여 오히려 균사의 생장보다 염료의 탈색속도가 더 빨랐다(Fig. 1B, Table 1).
- CV가 첨가된 배지에서 laccase의 활성도가 꾸준히 증가하여 7일 째에 가장 높은 활성을 보였으며 그 이후 활성도가 감소하다 13일 째에 다시 증가하였다. MnP 는 접종 초기에는 낮았으나 하루가 지난 후 증가하여 13일 째 까지 비교적 일정하게 유지되었다(Fig. 3). MG가 첨가된 배지에서는 laccase의 활성도가 시간에 비례하여 증가하여 염료가 모두 분해된 7일 째에 최대 활성도를 보였다.
- 고체배지에서 구름버섯은 CV와 MG를 모두 탈색시켰지만 균사의 생장속도와 탈색율은 다르게 나타났다. 구름 버섯의 균사는 CV 보다 MG가 첨가된 배지에서 빨리 자랐으며 염료의 탈색도 빨랐다. 이는 구름버섯이 두 염료 중에서 MG를 더 효율적으로 탈색시킨다는 것을 의미한다.
- 2). 균 접종 후 하루 동안 CV는 47%, MG는 74%가 탈색되었으며, 측정 2일 째에는 CV가 78%, MG는 97%까지 탈색되어 구름버섯의 빠른 염료 탈색능력을 확인할 수 있었다. 그 이후 CV가 탈색되는 속도는 감소하여 측정 13일 째에는 95%가 탈색되었다.
- 버섯이 가지고 있는 효소 중 리그닌 분해에 사용하는 것으로 알려진 LiP, MnP, laccase의 활성을 탈색율 과정에서 조사하였다. 세 가지 효소 중에서 laccase가 CV와 MG의 분해과정에서 가장 높게 측정되었으며 시간이 지나면서 증가하는 추세를 보였다(Figs. 3, 4). MnP 활성 역시 측정되었으나 laccase에 비해 상대적으로 낮았으며 LiP는 측정되지 않았다.
- 1A). 염료가 첨가되지 않는 PDA에서의 균사생장이 접종 9일 후에 완료된 것과 비교하면 CV는 구름버섯의 균사생장을 억제한다는 것을 알 수 있다. CV의 탈색은 접종 12일 이후부터 시작되었으며 접종 24일 후에 DI 값이 1이 되었으며 그 후로 균사가 생장을 마칠 때까지 DI 값이 1 전후로 유지되었다(Fig.
- 1, Table 1). 이는 구름버섯이 버섯의 생장을 방해하는 두 염료 중 MG를 더 효율적으로 분해하며 균이 생장함과 동시에 세포외효소를 분비하여 MG를 분해한다는 것을 나타낸다. 반면 CV는 MG 보다 독성이 강하며 처음 균사가 자라는 것을 억제하나 균이 PDA 배지에 있는 영양소를 이용하여 자라며 동시에 세포외효소를 이용하여 CV를 분해하는 것으로 판단된다.
- 이러한 결과는 구름 버섯이 MG의 분해과정에서 laccase를 주효소로 사용하며 MnP는 laccase에 보조적으로 어떤 역할을 하고 있음을 나타낸다. 한편 CV 탈색과정에서는 laccase 뿐만 아니라 MnP 활성이 2일째부터 증가하기 시작하여 활발한 탈색과정 동안 일정 수준으로 유지되는 걸로 보아 구름버섯에 의한 CV 탈색과정에서 MnP가 MG 탈색과정에서 보다 중요한 역할을 하며 laccase와 협동작용에 의해 CV 분해에 관여할 가능성이 있는 걸로 판단된다.
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