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문제 정의
- 또 다른 기질 단백질인 β-catenine 세포들 사이의 연접에 직접적으로 관여함으로서 세포의 골격 유지 및 다양한 부착성 세포의 전사 조절에 중요한 역할을 담당하며, PLC-γ1은 세포 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다[1, 8]. 따라서 EECO 처리에 의한 apoptosis 유발에 있어서 이들 유전자들이 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다. 먼저 caspases의 발현 정도를 확인한 결과 Fig.
- 최근 연구에 따르면 AMPK는 암세포에서 cyclin dependent kinase inhibitor (CKI)인 p21을 유도하여 세포분열을 억제시킬 뿐만 아니라 Bcl-2 family의 발현을 조절하거나 p53의 인산 화를 유발시킴으로서 미토콘드리아의 기능이상을 유발하여 apoptosis를 일으키는 등 여러 경로를 통하여 인체암세포의 억제에 관여하는 것으로 보고되어 있다[15, 25, 28]. 따라서 EECO에 의한 apoptosis 유발에서 AMPK의 활성화가 관여하는지를 알아보기 위하여 AMPK 및 AMPK의 하위단계에서 작용하는 ACC의 발현 변화를 살펴보고 AMPK의 활성을 억제하였을 경우 EECO에 의하여 유발되는 변화에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다. 먼저 AMPK 및 ACC의 발현 변화를 확인한 결과 Fig.
- 따라서 본 연구에서는 천궁의 항암 효과와 그에 따른 생화 학적 기전의 해석을 위하여 인체 혈구암 세포주인 U937 세포를 대상으로 하여 천궁의 열수 추출물(water extract of C. offi- cinale, WECO), 에탄올 추출물(ethanol extract of C. officinale, EECO) 및 메탄올 추출물(methanol extract of C. officinale, MECO)이 암세포의 생존율 및 증식에 미치는 영향을 조사하였고, 이들 중 가장 효능이 좋은 EECO가 apoptosis에 어떠한 영향을 미치는지를 조사한 결과 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 개/ml 씩 분주한 다음 각각의 시료를 적정농도로 처리하여 배양하였다. 24시간 경과 후 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포를 모은 후 동량의 phosphate-buffered saline (PBS)와 0.5% try- pan blue solution (Gibco BRL)을 첨가하여 2분간 염색하고 hemocytometer에 적용하여 염색이 되지 않은 살아있는 세포의 수를 도립 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germa- ny)을 이용하여 계수하였다.
- Apoptosis 유발의 또 다른 증거를 제시하기 위하여 DNA 단편화 현상의 분석을 실시하였다. 상기와 동일한 방법으로 처리된 세포들을 모은 다음 lysis buffer [5 mM Tris-HCl (pH
- Apoptosis가 유발되었을 경우 특이적으로 나타나는 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 EECO가 처리된 세포를 모은 다음 fixing solution (3.7% formaldehyde in PBS)으로 10분 동안 고정하였다. 고정된 세포를 PBS에 부유시킨 후 cytospin (Shandon, UK)을 이용하여 slide glass에 부착시키고 0.
- EECO 처리에 따른 U937 세포의 성장 정도 및 형태에 어떠한 변화가 유발되는지를 확인하기 위하여 세포 배양용 6 well plate에 세포를 2×105개/ml의 개수로 well 당 2 ml씩 분주하고 EECO를 적정농도로 희석처리하여 24시간 동안 배양한 다음 도립현미경을 이용하여 200배의 배율로 각 농도에 따른 성장 정도 및 형태의 변화를 관찰하고 Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 실시하였다.
- EECO 처리에 따른 생존율 감소, 증식 억제 및 형태 변화가 apoptosis 유발과 관련이 있는 지를 확인하기 위하여 핵의 형태변화, DNA 단편화 현상 및 annexin V-FITC/PI 염색을 실시하였다. 먼저 핵의 형태변화를 확인하기 위하여 DAPI 염색을 실시하고 형광현미경으로 관찰한 결과 Fig.
- EECO가 유발하는 apoptosis 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 정상 및 EECO가 24시간 동안 처리된 세포들을 모은 다음 원심분리하여 상층액을 제거한 후 PBS를 이용하여 세척 하였다. 준비된 세포를 10 mM HEPES/NaOH, pH 7.
- EECO가 유발하는 apoptosis에 있어서 미토콘드리아가 어떠한 역할을 하는지를 확인하기 위하여 MMP를 조사하기 위하여 EECO를 처리하고 dual-emission fluorescent dye인 JC-1 으로 염색한 후 DNA flow cytometer를 이용하여 조사하였다.
- EECO가 유발하는 apoptosis에 있어서 미토콘드리아의 기능이상이 관여하는지를 확인하기 위하여 MMP 변화 정도를 확인하였다. 정상 및 EECO가 처리된 세포를 모은 다음 PBS에 부유시키고 5, 5′, 6, 6′-tetrachloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethyl-im- idacarbocyanine iodide (JC-1, Sigma) 용액을 첨가하여 상온 에서 20분 동안 반응시켰다.
- EECO에 의한 caspases 활성 정도를 확인하기 위하여 vitro caspases activity를 측정하였다. 준비된 세포에서 단백질을 추출하고 정량한 다음 150 μg의 단백질이 함유된 50 μl의 sample 에 기질 100 μM이 함유된 reaction buffer [40 mM HEPES (pH 7.
- U937 세포의 생존율 및 증식에 천궁 추출물인 WECO, EECO 및 MECO가 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 각각의 시료를 적정 농도로 24시간 동안 처리한 후 hemo- cytometer counting 및 MTT assay를 실시하였다. Fig.
- WECO, EECO 및 MECO 처리에 따른 생존율을 확인하기 위하여 세포 배양용 6 well plate에 U937 세포를 2×105개/ml 씩 분주한 다음 각각의 시료를 적정농도로 처리하여 배양하였다. 24시간 경과 후 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포를 모은 후 동량의 phosphate-buffered saline (PBS)와 0.
- 2A에 나타난 바와 같이 정상 배지에서 배양된 세포와는 다르게 EECO 처리 농도 증가에 따라 전체적인 핵의 밀도 감소와 더불어 apopto- sis가 유발된 세포에서 전형적으로 관찰되는 염색질 응축에 의한 apoptotic body의 형성이 관찰되었다. 다음으로 apopto- sis 유발의 또 다른 증거인 DNA 단편화 현상을 관찰하였다.
- 5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM phenymethy- lsulfonyl fluoride (PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]를 첨가 하여 반응시킨 후 원심분리를 이용하여 상층액에 있는 총단 백질을 분리하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 정량한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 균일한 농도의 단백질 sample을 만들었다. 이렇게 만들어진 단백질 sample 은 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용한 전기영동을 실시하여 분자량에 따라 분리한 다음 nitro- cellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시켰다.
- EECO 처리에 따른 생존율 감소, 증식 억제 및 형태 변화가 apoptosis 유발과 관련이 있는 지를 확인하기 위하여 핵의 형태변화, DNA 단편화 현상 및 annexin V-FITC/PI 염색을 실시하였다. 먼저 핵의 형태변화를 확인하기 위하여 DAPI 염색을 실시하고 형광현미경으로 관찰한 결과 Fig. 2A에 나타난 바와 같이 정상 배지에서 배양된 세포와는 다르게 EECO 처리 농도 증가에 따라 전체적인 핵의 밀도 감소와 더불어 apopto- sis가 유발된 세포에서 전형적으로 관찰되는 염색질 응축에 의한 apoptotic body의 형성이 관찰되었다. 다음으로 apopto- sis 유발의 또 다른 증거인 DNA 단편화 현상을 관찰하였다.
- 5 mM CaCl2가 포함된 annexin V binding buffer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 부유시킨 다음 annexin V-FITC 및 propidium iodide (PI, Becton Dickin- son)를 처리하여 암실에서 20분 동안 반응을 시켰다. 반응시킨 세포를 35-mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 DNA flow cytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson)에 적용시켜 apoptosis가 유발된 세포(V+/PI–)를 형광반응에 따라 측정한 후 CellQuest software 및 ModiFit LT 프로그램을 이용하여 분석하였다.
- 단백질이 전이 된 nitrocellulose membrane에 skim milk 용액을 이용하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 1차 및 2차 항체를 처리하여 반응시켰다. 반응이 끝난 후 암실에서 en- hanced chemiluminoesence (ECL) slution (Amersham Life Science Corp.)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 발현양을 분석하였다.
- 정상 및 EECO가 처리된 세포를 모은 다음 PBS에 부유시키고 5, 5′, 6, 6′-tetrachloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethyl-im- idacarbocyanine iodide (JC-1, Sigma) 용액을 첨가하여 상온 에서 20분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 원심분리를 이용하여 상층액을 제거한 다음 차가운 PBS를 첨가하고 35-mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 DNA flow cytometer 에 적용시켜 EECO 처리에 따른 MMP의 변화 정도를 분석하였다.
- WECO, EECO 및 MECO 처리에 의한 증식억제의 정도를 확인하기 위하여 MTT assay를 이용하였다. 상기와 동일한 방법으로 처리된 세포를 대상으로 배지를 제거하고 성장배지와 희석된 0.5 mg/ml 농도의 tetrazolium bromide salt (MTT, Amresco, Solon, OH, USA)를 처리하고 빛을 차단한 다음 동안 CO2 incubator에서 배양시켰다. 3시간 경과 후 MTT 시약을 제거하고 DMSO를 이용하여 formazan을 모두 녹인 다음 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- , 37℃의 조건하에서 배양하였다. 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 성장배지의 교환을 매 48시간 마다 실시하여 적정수의 세포를 유지하였다.
- 2% NP-40, 10 mM DTT] 50 μl를 혼합하여 각 sample 당 총 volume이 100 μl가 되게 하였다. 여기에 세 종류의 caspases 기질(caspase-3 : Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA), caspase-8 : Ile-Glu-Thr-Asp (IETD)-pNA, caspase-9 : Leu-Glu-His-Asp (LEHD)-pNA)을 각각 5 μl 씩 첨가하여 37℃, 암실에서 3시간 동안 반응시킨 후 이용하여 405 nm 파장에서 caspases 활성 정도에 따른 변화를 측정하였다.
- 5 μg/ml 농도의 4', 6-diamidino-2- phenylindole (DAPI, Sigma-Aldrich) 용액을 처리하여 상온 에서 15분간 염색하였다. 염색이 끝난 후 형광 현미경(fluores- cene microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 400배의 배율로 핵의 형태 변화를 관찰한 다음 Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하였다.
- 결과에서 볼 수 있듯이 EECO 25 μg/ml 처리군까지는 DNA 단편화 현상이 나타나지 않았지만 50 μg/ml 처리군에서 약한 DNA 단편화 현상이 관찰되기 시작하여 75 μg/ml 처리군에서부터 DNA 단편화 현상이 강하게 나타나는 것으로 조사되었다. 이러한 결과들을 살펴볼 때 EECO는 U937 세포에서 apoptosis를 유발 한다는 것을 알 수 있었으므로 이러한 apoptosis 유발의 정량 적인 분석을 위하여 annexin V-FITC/PI로 염색한 후 DNA flow cytometry 분석을 실시하였다. Fig.
- EECO가 유발하는 apoptosis에 있어서 미토콘드리아의 기능이상이 관여하는지를 확인하기 위하여 MMP 변화 정도를 확인하였다. 정상 및 EECO가 처리된 세포를 모은 다음 PBS에 부유시키고 5, 5′, 6, 6′-tetrachloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethyl-im- idacarbocyanine iodide (JC-1, Sigma) 용액을 첨가하여 상온 에서 20분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 원심분리를 이용하여 상층액을 제거한 다음 차가운 PBS를 첨가하고 35-mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 DNA flow cytometer 에 적용시켜 EECO 처리에 따른 MMP의 변화 정도를 분석하였다.
- 분리된 상층액에 isopropanol (Sigma-Aldrich)과 5 M NaCl를 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 원심분리시켜 DNA pellet을 추출하였다. 추출된 DNA pellet에 RNase A가 포함된 TE buffer 및 6X gel loading dye (Bioneer, Daejeon, Korea)를 첨가하고 1.6% agarose gel을 이용하여 50 V로 전기 영동 시킨 후 ethidium bromide (EtBr, Sigma-Aldrich)로 염색 하여 DNA 단편화 현상을 확인하였다.
대상 데이터
- 단백질 분석을 위하여 사용된 TRAIL, DR4, DR5, Fas, FasL Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bad, Bid, XIAP, cIAP-1, cIAP-2, surviving, caspase-3, caspase-8, caspase-9, PARP, β-catenin, PLCγ1, AMPK, pAMPK, ACC, pACC 및 actin 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며, im- munoblotting을 위해 사용된 2차 항체는 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, DNA flow cytometry를 위하여 사용된 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit는 Becton Dickinson (San Jose, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 또한 caspases의 in vitro 활성 측정을 위한 colorimetric assay kit는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였으며, AMPK의 활성을 억제하기 위하여 사용된 AMPK 억제제인 compound C는 Sigma-Aldrich (St. Luis, MO, USA) 제품을 이용하였다.
- 미토콘드리아 활성을 측정하기 위하여 사용된 5, 5′, 6, 6′- tetrachloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1)은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, DNA flow cytometry를 위하여 사용된 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit는 Becton Dickinson (San Jose, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 또한 caspases의 in vitro 활성 측정을 위한 colorimetric assay kit는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였으며, AMPK의 활성을 억제하기 위하여 사용된 AMPK 억제제인 compound C는 Sigma-Aldrich (St.
- 본 실험에 사용된 천궁은 동의대학교 부속 한방병원에서 제공 받았으며, WECO, EECO 및 MECO를 얻기 위하여 흐르는 물로 충분히 세척하고 건조시킨 후 잘게 분쇄하였다.
- 실험에 사용한 인체 혈구암 세포주인 U937 세포는 Amer- ican Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며 90% RPMI-1640 배지(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL), 2 mM glutamine, 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin (Gibco BRL)이 포함된 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃의 조건하에서 배양하였다. 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 성장배지의 교환을 매 48시간 마다 실시하여 적정수의 세포를 유지하였다.
데이터처리
- The data are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. The significancewas determined by the Student’s t-test (*p<0.05 vs. untreated control). (C) Morphological changes of cells by treatment withEECO were visualized by inverted microscope (Original magnification, 200×).
- Each point represents the mean ± SD of three independentexperiments. The significance was determined using Student’s t-test (*p<0.05 vs. untreated control; #p<0.05 vs. EECO-treatedcells). (E) The cells were stained with FITC-conjugated Annexin V and PI for DNA flow cytometry analysis.
- The data are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. The significancewas determined by the Student’s t-test (*p<0.05 vs. untreated control). (C) Morphological changes of cells by treatment withEECO were visualized by inverted microscope (Original magnification, 200×).
- 0 통계 프로그램을 이용하여 평균(mean) ± 표준편차(SD)로 나타냈다. 각 실험군의 분석 항목별 통계의 유의성 검증은 분산분석(Analysis of Vatiance, ANOVA)을 한 후, Student t-test를 이용하여 *p<0.05 수준에서 검증하였다.
- 상기의 모든 실험 결과는 SPSS ver. 18.0 통계 프로그램을 이용하여 평균(mean) ± 표준편차(SD)로 나타냈다. 각 실험군의 분석 항목별 통계의 유의성 검증은 분산분석(Analysis of Vatiance, ANOVA)을 한 후, Student t-test를 이용하여 *p<0.
이론/모형
- WECO, EECO 및 MECO 처리에 의한 증식억제의 정도를 확인하기 위하여 MTT assay를 이용하였다. 상기와 동일한 방법으로 처리된 세포를 대상으로 배지를 제거하고 성장배지와 희석된 0.
성능/효과
- U937 세포의 생존율 및 증식에 천궁 추출물인 WECO, EECO 및 MECO가 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 각각의 시료를 적정 농도로 24시간 동안 처리한 후 hemo- cytometer counting 및 MTT assay를 실시하였다. Fig. 1A에서 나타난 바와 같이 생존율 변화를 확인한 결과 WECO 처리군에서는 큰 변화가 나타나지 않은 반면에 EECO 및 MECO 처리군에서는 처리농도 증가에 따라 급격한 생존율의 감소가 관찰되었으며 특히 MECO에 비해서 EECO을 처리했을 경우 생존율의 감소가 더욱 강하게 유발되는 것으로 관찰되었다.
- 이러한 결과들을 살펴볼 때 EECO는 U937 세포에서 apoptosis를 유발 한다는 것을 알 수 있었으므로 이러한 apoptosis 유발의 정량 적인 분석을 위하여 annexin V-FITC/PI로 염색한 후 DNA flow cytometry 분석을 실시하였다. Fig. 2C에 나타난 바와 같이 정상배지에서 자란 세포의 apoptosis 유발 빈도는 약3.5% 정도였지만 EECO 처리농도 증가에 따라 apoptosis 유발 빈도가 증가하여 최고 농도인 100 μg/ml 처리군에서는 약52.5%의 세포에서 apoptosis가 유발되는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼 때 U937 혈구암세포에서 EECO 처리에 의한 생존율 감소, 증식 억제 및 형태 변화는 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있음을 알 수 있었다.
- Fig. 3에 나타난 바와 같이 EECO를 처리하지 않았을 경우에는 정상적인 MMP를 가진 세포는 약 93.2%, 손상된 MMP를 가진 세포는 약 6.8%로 나타났지만 EECO 처리농도 증가에 따라서 MMP 손상 정도가 증가하였으며, 최고 농도인 100 μg/ml 처리군에서는 약 74.5% 정도의 세포에서 MMP의 손상이 유발되는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 EECO에 의하여 유발되는 apoptosis에는 MMP의 손상을 통한 미토콘드리아 기능 이상이 관여하고 있다는 것을 알 수 있었다.
- 2B에 나타난 바와 같다. 결과에서 볼 수 있듯이 EECO 25 μg/ml 처리군까지는 DNA 단편화 현상이 나타나지 않았지만 50 μg/ml 처리군에서 약한 DNA 단편화 현상이 관찰되기 시작하여 75 μg/ml 처리군에서부터 DNA 단편화 현상이 강하게 나타나는 것으로 조사되었다. 이러한 결과들을 살펴볼 때 EECO는 U937 세포에서 apoptosis를 유발 한다는 것을 알 수 있었으므로 이러한 apoptosis 유발의 정량 적인 분석을 위하여 annexin V-FITC/PI로 염색한 후 DNA flow cytometry 분석을 실시하였다.
- 6A에 나타난 바와 같이 EECO 처리에 의하여 AMPK 및 ACC의 인산화가 현저하게 증가되는 것으로 나타났으므로 EECO에 의한 apoptosis 유발에 있어서 AMPK의 활성화가 관여한다는 것을 예상할 수 있었다. 다음으로 AMPK 억제제인 compound C를 선처리하여 AMPK 경로를 억제하였을 경우 EECO에 의한 apoptosis 유발에 어떠한 영향을 미치는지를 조사한 결과 Fig. 6B~E에 나타낸 바와 같이 EECO처리에 의하여 유발된 핵의 형태 변화, DNA 단편화 현상, 증식억제 및 annexin-V positive 세포의 증가 등이 com- pound C 선처리에 의하여 비교하여 현저하게 회복되는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 살펴볼 때 EECO는 AMPK의 활성화를 직접적으로 유발한다는 것을 알 수 있었으며, 이러한 AMPK의 활성화는 apoptosis 조절 단백질들의 발현에 영향을 줌으로서 EECO에 의한 apoptosis를 억제한다는 것을 예상할 수 있으므로 추가적인 연구를 통하여 이와 관련된 구체적인 기전을 확인할 필요가 있을 것으로 판단된다.
- 1배 증가하는 것으로 나타났다. 다음으로 활성화된 caspase-3에 의하여 특이하게 분해가 일어나는 기질 단백질의 발현에 미치는 EECO의 영향을 조사한 결과 Fig. 5A에 나타난 바와 같이 PARP, β-catenin 및 PLC-γ1의 발현 감소 또는 단편화 현상이 관찰되었다. 이상의 결과를 살펴볼 때 인체 혈구암 세포인 U937 세포에서 EECO가 유발하는 apoptosis는 cas- pase-8 및 -9의 활성화에 따른 caspase-3의 활성화 및 기질단백질들의 단편화가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
- 또한 IAP family 의 경우에는 caspases와 직접적으로 결합함으로서 caspases의 활성을 억제함으로서 apoptosis를 억제하는 것으로 알려져 있으므로 IAP family의 발현 억제는 caspases의 활성을 억제하지 못함으로서 apoptosis가 유발되는데 중요한 역할을 하게 된다[4]. 따라서 EECO에 의하여 유발되는 apoptosis에 이들 유전자가 어떠한 영향을 미쳤는지를 확인한 결과 Fig. 4에 나타난 바와 같이 extrinsic pathway에 관여하는 death receptor 인 DR4의 발현 증가 및 intrinsic pathway에 관여하는 Bcl-2의 발현 감소가 유발되었으며, 활성화된 caspase-8에 의하여 단편화되어 MMP 손실 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 Bid 단백질의 경우에도 EECO 처리에 의하여 total Bid의 발현이 감소하는 것으로 나타났으므로 단편화된 형태인 tBid의 증가가 유발되었다는 것을 예상할 수 있었다. 또한 IAP family의 경우에는 XIAP, cIAP-2 및 survivin의 발현에는 큰 변화가 관찰되지 않았지만, cIAP-1의 발현 감소가 관찰되었다.
- 5A에서 나타난 바와 같이 EECO 처리에 의하여 불활 성형인 pro-caspase-3, -8 및 -9 단백질의 발현은 감소하는 것으로 나타났으나 활성형 단백질 발현은 나타나지 않았다. 따라서 in vitro caspases activity assay를 통하여 이들 caspases의 활성 정도를 직접 분석한 결과, Fig. 5B에서 나타난 바와 같이 caspase-3, -8 및 -9의 활성이 EECO 처리 농도 의존적으로 증가하여 최고 농도인 100 μg/ml 처리군에서는 각각 4.9배, 2.7배 및 3.1배 증가하는 것으로 나타났다. 다음으로 활성화된 caspase-3에 의하여 특이하게 분해가 일어나는 기질 단백질의 발현에 미치는 EECO의 영향을 조사한 결과 Fig.
- 또한 Fig. 1B에서와 같이 U937 세포의 증식억제 정도를 확인한 결과에서도 생존율 감소 현상과 같이 WECO 및 MECO 처리군에 비해서 EECO 처리군에서의 증식억제 현상이 강하게 유발된다는 것을 알 수 있었다. 생존율 및 증식억제 현상을 가장 강하게 유발시키는 EECO가 세포의 형태 변화에 어떠한 영향을 미치는지를 확인한 결과 Fig.
- 4에 나타난 바와 같이 extrinsic pathway에 관여하는 death receptor 인 DR4의 발현 증가 및 intrinsic pathway에 관여하는 Bcl-2의 발현 감소가 유발되었으며, 활성화된 caspase-8에 의하여 단편화되어 MMP 손실 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 Bid 단백질의 경우에도 EECO 처리에 의하여 total Bid의 발현이 감소하는 것으로 나타났으므로 단편화된 형태인 tBid의 증가가 유발되었다는 것을 예상할 수 있었다. 또한 IAP family의 경우에는 XIAP, cIAP-2 및 survivin의 발현에는 큰 변화가 관찰되지 않았지만, cIAP-1의 발현 감소가 관찰되었다. 이상의 결과를 살펴볼 때 EECO는 extrinsic pathway 및 intrinsic pathway가 모두 관여함으로서 apoptosis를 유발한다는 것을 알 수 있었다.
- 따라서 EECO에 의한 apoptosis 유발에서 AMPK의 활성화가 관여하는지를 알아보기 위하여 AMPK 및 AMPK의 하위단계에서 작용하는 ACC의 발현 변화를 살펴보고 AMPK의 활성을 억제하였을 경우 EECO에 의하여 유발되는 변화에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다. 먼저 AMPK 및 ACC의 발현 변화를 확인한 결과 Fig. 6A에 나타난 바와 같이 EECO 처리에 의하여 AMPK 및 ACC의 인산화가 현저하게 증가되는 것으로 나타났으므로 EECO에 의한 apoptosis 유발에 있어서 AMPK의 활성화가 관여한다는 것을 예상할 수 있었다. 다음으로 AMPK 억제제인 compound C를 선처리하여 AMPK 경로를 억제하였을 경우 EECO에 의한 apoptosis 유발에 어떠한 영향을 미치는지를 조사한 결과 Fig.
- 따라서 EECO 처리에 의한 apoptosis 유발에 있어서 이들 유전자들이 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다. 먼저 caspases의 발현 정도를 확인한 결과 Fig. 5A에서 나타난 바와 같이 EECO 처리에 의하여 불활 성형인 pro-caspase-3, -8 및 -9 단백질의 발현은 감소하는 것으로 나타났으나 활성형 단백질 발현은 나타나지 않았다. 따라서 in vitro caspases activity assay를 통하여 이들 caspases의 활성 정도를 직접 분석한 결과, Fig.
- 1B에서와 같이 U937 세포의 증식억제 정도를 확인한 결과에서도 생존율 감소 현상과 같이 WECO 및 MECO 처리군에 비해서 EECO 처리군에서의 증식억제 현상이 강하게 유발된다는 것을 알 수 있었다. 생존율 및 증식억제 현상을 가장 강하게 유발시키는 EECO가 세포의 형태 변화에 어떠한 영향을 미치는지를 확인한 결과 Fig. 1C에서와 같이 처리 농도 증가에 따른 전체적인 세포 밀도의 감소와 함께 apoptosis 특징 중 하나인 membrane blebbing 현상을 포함한 심한 형태적 변형이 관찰되었다. 이상의 결과는 EECO 처리에 따른 생존율 감소 및 증식 억제 정도와 잘 일치함을 알 수 있었다.
- 1C에서와 같이 처리 농도 증가에 따른 전체적인 세포 밀도의 감소와 함께 apoptosis 특징 중 하나인 membrane blebbing 현상을 포함한 심한 형태적 변형이 관찰되었다. 이상의 결과는 EECO 처리에 따른 생존율 감소 및 증식 억제 정도와 잘 일치함을 알 수 있었다.
- 또한 IAP family의 경우에는 XIAP, cIAP-2 및 survivin의 발현에는 큰 변화가 관찰되지 않았지만, cIAP-1의 발현 감소가 관찰되었다. 이상의 결과를 살펴볼 때 EECO는 extrinsic pathway 및 intrinsic pathway가 모두 관여함으로서 apoptosis를 유발한다는 것을 알 수 있었다.
- 5%의 세포에서 apoptosis가 유발되는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼 때 U937 혈구암세포에서 EECO 처리에 의한 생존율 감소, 증식 억제 및 형태 변화는 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있음을 알 수 있었다.
- 5A에 나타난 바와 같이 PARP, β-catenin 및 PLC-γ1의 발현 감소 또는 단편화 현상이 관찰되었다. 이상의 결과를 살펴볼 때 인체 혈구암 세포인 U937 세포에서 EECO가 유발하는 apoptosis는 cas- pase-8 및 -9의 활성화에 따른 caspase-3의 활성화 및 기질단백질들의 단편화가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
- 이상의 결과를 종합해 보면 인체 혈구암세포인 U937 세포에서 EECO에 의하여 유발되는 apoptosis는 DR4의 발현 증가에 의한 caspase-8의 활성화와 연계된 Bid의 단편화 및 Bcl-2의 발현감소에 의한 미토콘드리아 기능 이상을 유발함으로서 caspase-9 및 -3의 활성화에 의한 기질단백질들의 단편화 등과 같은 전형적인 extrinsic 및 intrinsic pathway를 동시에 경유하는 multiple apoptotic pathway에 의하여 조절되며, 이러한 과정에서 AMPK의 활성화가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
- 5% 정도의 세포에서 MMP의 손상이 유발되는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 EECO에 의하여 유발되는 apoptosis에는 MMP의 손상을 통한 미토콘드리아 기능 이상이 관여하고 있다는 것을 알 수 있었다.
후속연구
- 6B~E에 나타낸 바와 같이 EECO처리에 의하여 유발된 핵의 형태 변화, DNA 단편화 현상, 증식억제 및 annexin-V positive 세포의 증가 등이 com- pound C 선처리에 의하여 비교하여 현저하게 회복되는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 살펴볼 때 EECO는 AMPK의 활성화를 직접적으로 유발한다는 것을 알 수 있었으며, 이러한 AMPK의 활성화는 apoptosis 조절 단백질들의 발현에 영향을 줌으로서 EECO에 의한 apoptosis를 억제한다는 것을 예상할 수 있으므로 추가적인 연구를 통하여 이와 관련된 구체적인 기전을 확인할 필요가 있을 것으로 판단된다.
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