[논문]배추과에서 T-DNA 도입 위치 분석을 위한 효과적인 PCR 방법 개발 및 이용

이기호; 유재경; 박영두

doi:10.7235/hort.2015.14083

배추과에서 T-DNA 도입 위치 분석을 위한 효과적인 PCR 방법 개발 및 이용
Development of an Effective PCR Technique for Analyzing T-DNA Integration Sites in Brassica Species and Its Application 원문보기

원예과학기술지 = Korean journal of horticultural science & technology, v.33 no.2, 2015년, pp.242 - 250

이기호 (경희대학교 생명과학대학 원예생명공학과) , 유재경 (경희대학교 생명과학대학 원예생명공학과) , 박영두 (경희대학교 생명과학대학 원예생명공학과)

초록
AI-Helper

기능 유전체 연구에서 이동유전자 또는 T-DNA 도입을 이용한 삽입돌연변이체 분석은 미지의 유전자 기능을 분석할 수 있게 한다. 이에 따라 본 연구에서는 배추(Brassica rapa ssp. pekinensis)와 같은 고등 식물에서 genomic DNA조각을 분리할 수 있는 효과적인 PCR 방법을 개발하였다. 본 연구에서 개발한 variable argument thermal asymmetric interlaced PCR(VA-TAIL PCR)은 single-step annealin-gextension PCR 방법과 길게 구성된 유전자 특이적 primer 및 touch-up PCR 방법이 적용되었으며, 증폭 효율을 증가시키기 위하여 autosegment extension 증폭 방법이 적용되었다. 또한 개발된 VA-TAIL PCR 방법은 배추에 특화된 변성 primer를 Integr8 단백질체 데이터베이스를 분석하여 작성하였으며 대량의 배추 T-DNA 삽입 돌연변이 집단에서 각각의 T-DNA 인접 염기 서열을 분석하는 데 매우 정확하고 효과적인 것으로 분석되었다. 따라서 본 연구에서 개발된 VA-TAIL PCR 방법은 기존에 확인된 염기 서열을 이용하여 양쪽 방향을 모두 분석할 수 있기 때문에, 유전체 연구에서 T-DNA 또는 기 밝혀진 염기 서열에 인접한 미지의 염기서열을 확인하는데 매우 효과적일 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Insertional mutagenesis induced by T-DNA or transposon tagging offers possibilities for analysis of gene function. However, its potential remains limited unless good methods for detecting the target locus are developed. We describe a PCR technique for efficient identification of DNA sequences adjacent to the inserted T-DNA in a higher plant, Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis). This strategy, which we named variable argument thermal asymmetric interlaced PCR (VA-TAIL PCR), was designed by modifying a single-step annealing-extension PCR by including a touch-up PCR protocol and using long gene-specific primers. Amplification efficiency of this PCR program was significantly increased by employing an autosegment extension method and linked sequence strategy in nested long gene-specific primers. For this technique, arbitrary degenerate (AD) primers specific to B. rapa were designed by analyzing the Integr8 proteome database. These primers showed higher accuracy and utility in the identification of flanking DNA sequences from individual transgenic Chinese cabbages in a large T-DNA inserted population. The VA-TAIL PCR method described in this study allows the identification of DNA regions flanking known DNA fragments. This method has potential biotechnological applications, being highly suitable for identification of target genomic loci in insertional mutagenesis screens.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

본 연구에서는 T-DNA가 도입된 대량의 삽입돌연변이 배추 집단에서 T-DNA인접 염기서열 분석을 위하여 효율이 증가된 VA-TAIL PCR(Variable Argument - Thermal Asymmetric Interlaced PCR) 방법을 개발하였다. 개발된 방법은 고등 식물인 배추과에서 효과적으로 TAIL PCR을 적용하기 위하여 새로운 AD primer 제작하고, 인접염기서열의 PCR 증폭 효율을 높이기 위해 primer의 연쇄 반응 위치 부여(Antal et al.
도입된 pRCV2는 pCAMBIA 1301(CAMBIA, Canberra, Australia)과 pBluescript II KS(+)(Stratagene, CA, USA)이 결합된 14,730bp 크기의 벡터로 내부에 식물 선발 마커인 hpt(hygromycin resistance) 유전자와 플라스미드 회수 클로닝을 위한 ampicillin 저항성 유전자 및 origin이 포함되어 있다. 해당 pRCV2가 도입된 배추 돌연변이 집단을 구축하였으며(Lee et al., 2004), 본 연구에서는 VA-TAIL PCR의 효율성을 확인하기 위하여 플라스미드 회수 클로닝을 통해 인접 염기서열이 확인된 mutant line No. 346과 확인되지 않은 돌연변이 계통 14개를 임의로 선발하여 분석하였다.

제안 방법

위와 같은 방법으로 최적화된 VA-TAIL PCR 방법의 효율을 분석하기 위하여 Lee et al.(2010)의 보고에서 인접염기 서열이 확인된 mutant line No. 899의 left border 부분을 기존의 Liu and Whittier(1995)의 TAIL PCR 방법과 nested specific primer에 일부 염기 서열의 연속 지역이 없는 primer 조합(LSP1, LSP3, LcSP4, LcSP5)을 사용한 TAIL PCR 및 최적화된 VA-TAIL PCR을 실시하여 비교분석 하였다. 분석 결과 최적화된 VA-TAIL PCR 결과에서 BrAD4, BrAD5, BrAD6를 사용한 조합의 0.
FSTVAL program을 이용한 분석은 해당 program에서 제공하는 배추 데이터베이스를 BLASTN 알고리즘(cutoff e-value < 1e-5)을 적용하여 염색체 번호(A01-A10)와 도입 형태(intergenic, exon, intron, 5′ upstream1000, 3′ downstream-300), 인접 유전자명을 분석하였다.
Genetic mapping with VA-TAIL PCR products from transgenic Chinese cabbage. In silico genetic map positions (gray arrows) of the chromosomes denote the T-DNA flanking regions from pRCV2-tagged transgenic Chinese cabbage lines using VA-TAIL PCR analysis. The chromosome positioning analysis was conducted using the web-based analysis program, FSTVAL(http://bioinfo.
한편 각 단계의 주형 DNA는 이전 단계의 반응된 주형을 1/100 희석하여 사용하였다. PCR 산물은 agarose gel(1.0%)에 전기영동하여 확인하며, 특이적 반응물을 효과적으로 선발하기 위해 3번째 TAIL PCR산물과 4번째 TAIL PCR산물을 동시에 전기영동하여 동일한 위치에 나타나는 산물을 선발하였다. 염기서열 분석은 선발된 PCR 산물을 gel elution kit(cat#YDF100; HiYield^TM Gel/PCR DNA mini Kit, Real Biotech Corporation, Banqiao, Taiwan)를 이용하여 분리 및 정제 후 TA cloning vector(cat#A1360; pGEM-T^® easy vector; Promega, Madison, Wisconsin, USA)에 도입하여 Macrogen Co.
VA-TAIL PCR은 총 20µL의 PCR 반응혼합액에 5 unit Taq polymerase(cat#RR001B; TaKaRa Ex Taq®, Shiga, Japan), 2.5mM dNTP, 10× Taq polymerase buffer, 그리고 각 단계별로 0.2µM nested specific primer와 3.0µM BrAD 조합을 넣은 후 thermocycler(TGradient 96; Biometra, Goettingen, Germany)를 사용하여 실시하였다.
yCalculation of the Gibbs free energy (ΔG) for dimer h ybridization and h airpin formation during th e annealing step using th e Vector NTI oligo-calculator (VectorNTI AdvanceTM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
각각의 primer가 가지는 dimer 및 hairpin 형성 관련 ΔG의 분석은 Vector NTI oligo-calculator(VectorNTI AdvanceTM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였다.
각각의 primer는 single-step annealing-extension PCR 단계를 진행하기 위하여 annealing temperature를 65℃이상으로 작성하였으며, primer의 반응 효율을 증가시키기 위하여 Gibbs free energy(ΔG) > 0 되도록 구성하였다.
0µM BrAD 조합을 넣은 후 thermocycler(TGradient 96; Biometra, Goettingen, Germany)를 사용하여 실시하였다. 각각의 반응은 left border 방향의 경우 LSP1, LSP2, LSP3, LSP4 순서로 실시하였으며, right border 방향의 경우 RSP1, RSP2, RSP3, RSP4 순서로 단계별 반응을 실시하였다. 또한 primer의 연쇄가 TAIL PCR효율에 미치는 영향을 분석하기 위한 대조 방법의 경우 LSP1, LSP3, LcSP4, LcSP5 순서로 진행하였다.
본 연구에서는 T-DNA가 도입된 대량의 삽입돌연변이 배추 집단에서 T-DNA인접 염기서열 분석을 위하여 효율이 증가된 VA-TAIL PCR(Variable Argument - Thermal Asymmetric Interlaced PCR) 방법을 개발하였다. 개발된 방법은 고등 식물인 배추과에서 효과적으로 TAIL PCR을 적용하기 위하여 새로운 AD primer 제작하고, 인접염기서열의 PCR 증폭 효율을 높이기 위해 primer의 연쇄 반응 위치 부여(Antal et al., 2004) 및 autosegment(Mukai and Nakagawa, 1996), touch-up PCR(Ailenberg and Silverman, 2000) 방법을 응용한 가변적인 PCR 반응 프로그램을 적용하였다. 이에 따라 본 방법을 이용하면 T-DNA가 도입된 대량의 배추 집단에서 정확하고 효과적으로 T-DNA 인접 염기 서열을 분석할 수 있을 것으로 기대된다.
배추과에 효과적인 TAIL PCR 방법을 개발하기 위해 6개의 BrAD(Brassica rapa specific AD) primer를 작성하였다. 고등 식물에서 가장 높은 빈도로 존재하고 있는 단백질의 도메인을 선택하기 위하여, EMBL-EBI의 Integr8에서 제공하는 단백질체 분석 정보를 검색하였으며, 획득된 단백질 정보를 NCBI GenBank 데이터베이스의 protein BLAST로 분석하여 배추 속에서 가장 높은 일치율을 나타내는 염기서열을 수집하였다. 분석 결과 [Zinc finger protein LSD1; InterPro ID IPR005735], [Serine/threonine protein kinase; InterPro ID IPR008271], [Leucine-rich repeat (LRR) protein; IPR012569], [RNA recognition motif domain; InterPro ID IPR001890] 도메인(domain)을 선발하였다.
(1988)이 제시한 방법을 이용하였다. 공시 재료에서 선발된 T₁ 돌연변이 배추 종자 15계통을 파종 후 7주간 생육한 잎을 이용하여 gDNA를 추출하였다. 분리된 gDNA는 NanoDrop^® UV-Vis Spectrophotometer(ND-1000; Thermo Scientific, MA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하고 A260/A280 비가 1.
또한 반응의 특이성을 증가시키기 위하여 각각의 primer의 3′ 말단의 3-5bp를 다음 단계에 이용하는 primer의 5′ 말단과 일치하도록 구성하였다. 그 결과 T-DNA의 left border 방향의 LSP1, LSP2, LSP3, LSP4와 right border 방향의 RSP1, RSP2, RSP3, RSP4를 작성하였으며, primer의 일부 염기 서열의 연속 지역이 VA-TAIL PCR 결과에 미치는 영향을 분석하기 위하여 일부 염기 서열의 연속 지역이 없는 대조군으로 left border 방향의 LcSP4과 LcSP5를 추가로 작성하였다(Table 2 and Fig. 1). 각각의 primer가 가지는 dimer 및 hairpin 형성 관련 ΔG의 분석은 Vector NTI oligo-calculator(VectorNTI Advance^TM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였다.
그리고 TAIL PCR의 효율을 최대화하기 위해서 single-step annealing-extension PCR를 위한 양방향의 nested specific primer를 Tm 68-70°C로 구성하고 touch-up PCR 방법을 동시에 적용하여 각 cycle마다 annealing 온도가 0.5°C씩 증가하도록 구축하고, autosegment extension PCR의 적용을 위하여 각 TAIL cycle마다 extension 시간을 1초씩 증가시켰으며, 각각의 특이적 primer의 결합 위치를 3-5bp가 연쇄되도록 구축하였다(Tables 2 and 3).
각각의 반응은 left border 방향의 경우 LSP1, LSP2, LSP3, LSP4 순서로 실시하였으며, right border 방향의 경우 RSP1, RSP2, RSP3, RSP4 순서로 단계별 반응을 실시하였다. 또한 primer의 연쇄가 TAIL PCR효율에 미치는 영향을 분석하기 위한 대조 방법의 경우 LSP1, LSP3, LcSP4, LcSP5 순서로 진행하였다. 한편 각 단계의 주형 DNA는 이전 단계의 반응된 주형을 1/100 희석하여 사용하였다.
그 결과 총 6개의 배추 특이 AD primer를 작성하였으며, BrAD(Brassica rapa specific AD) primer 집단으로 명명하였다(Table 1). 또한 돌연변이 배추에 도입된 pRCV2 vector를 특이적으로 증폭하는 4개의 nested specific primer(SP)를 도입된 vector의 left border와 right border방향으로 각각 2sets 작성하였다. 각각의 primer는 single-step annealing-extension PCR 단계를 진행하기 위하여 annealing temperature를 65℃이상으로 작성하였으며, primer의 반응 효율을 증가시키기 위하여 Gibbs free energy(ΔG) > 0 되도록 구성하였다.
또한 반응의 특이성을 증가시키기 위하여 각각의 primer의 3′ 말단의 3-5bp를 다음 단계에 이용하는 primer의 5′ 말단과 일치하도록 구성하였다.
배추과에 효과적인 TAIL PCR 방법을 개발하기 위해 6개의 BrAD(Brassica rapa specific AD) primer를 작성하였다. 고등 식물에서 가장 높은 빈도로 존재하고 있는 단백질의 도메인을 선택하기 위하여, EMBL-EBI의 Integr8에서 제공하는 단백질체 분석 정보를 검색하였으며, 획득된 단백질 정보를 NCBI GenBank 데이터베이스의 protein BLAST로 분석하여 배추 속에서 가장 높은 일치율을 나타내는 염기서열을 수집하였다.
배추과에 효과적인 TAIL PCR 방법을 개발하기 위해 먼저 배추에 효과적으로 적용 가능한 배추 특이 AD primer를 작성하였다. 배추 특이 AD primer는 The European Molecular Biology Laboratory’s European Bioinformatics Institute(EMBL-EBI)의 Integr8(http://www.
배추에서 최적화된 VA-TAIL PCR 방법을 이용하여 배추돌연변이 집단 중 T-DNA 인접 염기서열이 확인되지 않은 돌연변이 계통 14개를 임의로 선발하여 분석하였다. 그 결과VA-TAIL PCR을 통하여 특이적인 산물을 확인할 수 있었으며, T-DNA 인접 염기서열이 유의성 있게 분석되었다(Table 4).
분리된 gDNA는 NanoDrop® UV-Vis Spectrophotometer(ND-1000; Thermo Scientific, MA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하고 A260/A280 비가 1.8이고, A260/A230비가 2.0으로 분석된 gDNA를 이용하여 VA-TAIL PCR을 진행하였다.
분석 결과 [Zinc finger protein LSD1; InterPro ID IPR005735], [Serine/threonine protein kinase; InterPro ID IPR008271], [Leucine-rich repeat (LRR) protein; IPR012569], [RNA recognition motif domain; InterPro ID IPR001890] 도메인(domain)을 선발하였다. 수집된 높은 빈도의 도메인 염기서열 가운데, 높은 상동성을 보이는 부분을 BLAST로 비교 분석하여 특이적 결합 비율을 180-300가지로 무작위성(degeneracy)을 제한함으로써 반응 특이성을 확보하였다(Table 1). 한편 게놈 크기가 283.
이에 따라 도입된 T-DNA를 특이적으로 증폭하기 위해 left border방향과 right border방향으로 각각 1set씩 작성된 nested specific primer는 PCR 효율을 증가시키기 위하여 ΔG > 0 되도록 구성하였으며, primer 의 3′ 말단의 3-5bp를 다음 단계에 이용하는 primer의 5′ 말단과 일치하도록 구성되었다.

대상 데이터

공시 재료로 사용한 형질전환 돌연변이체는 Agrobacterium tumefaciens(LBA4404)을 이용하여 플라스미드 회수 클로닝(plasmid rescue cloning)용 백터인 pRCV2(Kim et al., 2003)가 도입된 배추(B. rapa ssp. pekinensis var. Seoul)를 이용하였다. 도입된 pRCV2는 pCAMBIA 1301(CAMBIA, Canberra, Australia)과 pBluescript II KS(+)(Stratagene, CA, USA)이 결합된 14,730bp 크기의 벡터로 내부에 식물 선발 마커인 hpt(hygromycin resistance) 유전자와 플라스미드 회수 클로닝을 위한 ampicillin 저항성 유전자 및 origin이 포함되어 있다.
배추 특이 AD primer는 The European Molecular Biology Laboratory’s European Bioinformatics Institute(EMBL-EBI)의 Integr8(http://www.ebi.ac.uk/integr8) 데이터베이스와 National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 분석하여 작성하였다.

데이터처리

(Seoul, Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 분석 결과는 NCBI의 BLAST program(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)를 이용하여 증폭된 산물에 대한 정보를 분석하였으며, 배추 염색체 내 도입된 T-DNA의 위치를 확인하기 위하여 Flanking Sequence Tag Validator(FSTVAL; http://bioinfo.mju.ac.kr/fstval/)을 이용하였다(Kim et al., 2012). FSTVAL program을 이용한 분석은 해당 program에서 제공하는 배추 데이터베이스를 BLASTN 알고리즘(cutoff e-value < 1e-5)을 적용하여 염색체 번호(A01-A10)와 도입 형태(intergenic, exon, intron, 5′ upstream1000, 3′ downstream-300), 인접 유전자명을 분석하였다.

이론/모형

돌연변이 배추에서 gDNA를 추출하기 위해 McCouch et al.(1988)이 제시한 방법을 이용하였다. 공시 재료에서 선발된 T₁ 돌연변이 배추 종자 15계통을 파종 후 7주간 생육한 잎을 이용하여 gDNA를 추출하였다.
In silico genetic map positions (gray arrows) of the chromosomes denote the T-DNA flanking regions from pRCV2-tagged transgenic Chinese cabbage lines using VA-TAIL PCR analysis. The chromosome positioning analysis was conducted using the web-based analysis program, FSTVAL(http://bioinfo.mju.ac.kr/fstval/).
Table 3. VA-TAIL PCR cycle conditions used in this study.
VA-TAIL PCR은 pRCV2 vector로 형질전환되어 선발된 배추 돌연변이체를 대상으로 수행하였으며, 개발된 방법의 효율을 비교하기 위하여 기존의 Liu and Whittier(1995)의 TAIL PCR 프로그램을 대조 방법으로 이용하였다(Table 3). VA-TAIL PCR은 총 20µL의 PCR 반응혼합액에 5 unit Taq polymerase(cat#RR001B; TaKaRa Ex Taq^®, Shiga, Japan), 2.

성능/효과

, 2010), 이는 분석된 시료 집단의 크기 차이에 기인한 것으로 본 연구의 VA-TAIL PCR을 이용하여 다수의 집단을 분석한다면 선행 연구와 동일한 결과가 나올 것으로 판단된다. 결론적으로 본 연구에서 최적화한 배추과에 효과적인 VATAIL PCR 방법과 6개의 BrAD primer 집단을 이용하면, 배추과 작물에서 T-DNA가 삽입된 인접 염기서열을 분석하거나, 미지의 영역을 분석 시에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
gov)를 분석하여 작성하였다. 그 결과 총 6개의 배추 특이 AD primer를 작성하였으며, BrAD(Brassica rapa specific AD) primer 집단으로 명명하였다(Table 1). 또한 돌연변이 배추에 도입된 pRCV2 vector를 특이적으로 증폭하는 4개의 nested specific primer(SP)를 도입된 vector의 left border와 right border방향으로 각각 2sets 작성하였다.
특히 특이적 primer인 SP3와 SP4의 경우 각각 7bp가 겹치게 구성되어 있으며 각각의 반응이 독립적으로 이루어졌기 때문에, 각각의 반응에서 동일한 위치의 PCR 산물을 특이적 산물로 판단할 수 있다. 그 결과 최적화된 VA-TAIL PCR 방법에서는 총 4개의 특이적 산물이 확인되었으나(Fig. 2C), 기존의 TAIL PCR 방법에서는 비특이적 산물의 양상만이 확인되었다(Fig. 2A). 또한 nested specific primer에 일부 염기 서열의 연속 지역이 없는 primer 조합을 이용한 경우에서도 전체적인 산물의 양상은 비슷해졌으나, 특이적 산물의 증폭 효율이 낮았다(Fig.
배추에서 최적화된 VA-TAIL PCR 방법을 이용하여 배추돌연변이 집단 중 T-DNA 인접 염기서열이 확인되지 않은 돌연변이 계통 14개를 임의로 선발하여 분석하였다. 그 결과VA-TAIL PCR을 통하여 특이적인 산물을 확인할 수 있었으며, T-DNA 인접 염기서열이 유의성 있게 분석되었다(Table 4). 배추 염색체 상에 도입된 T-DNA의 위치 분석을 실시한 결과, 선행 연구에서 T-DNA의 도입위치를 확인한 mutant line No.
2A). 또한 nested specific primer에 일부 염기 서열의 연속 지역이 없는 primer 조합을 이용한 경우에서도 전체적인 산물의 양상은 비슷해졌으나, 특이적 산물의 증폭 효율이 낮았다(Fig. 2B). 즉, 본 연구에서 최적화된 VA-TAIL PCR 방법이 배추를 이용한 연구에서 기존의 TAIL PCR 방법보다 훨씬 효과적임을 확인할 수 있었으며, nested specific primer의 연쇄가 증폭 효율에 효과적임을 확인할 수 있었다.
346를 포함한 총 15개 삽입 돌연변이체 중 intergenic 부분에 T-DNA가 도입된 계통이 8개(53%)이며, exon 지역 3개(20%), intron 지역 1개(7%), 5′ upstream-1000 지역 1개, 3′ downstream-500 지역 1개로 분석되었다. 또한 이러한 T-DNA는 염색체 A06에 4개(26.7%)가 도입되어 가장 많은 것으로 나타났으며, 다음으로는 염색체 A01, 염색체 A02, 염색체 A10에 각각 2개씩(13.3%)이 도입된 것을 확인하였다(Table 4 and Fig. 3). 플라스미드 회수 클로닝을 이용하여 배추 돌연변이 집단의 T-DNA 인접 염기서열을 분석한 연구 결과에서 mutant line No.
배추 염색체 상에 도입된 T-DNA의 위치 분석을 실시한 결과, 선행 연구에서 T-DNA의 도입위치를 확인한 mutant line No. 346를 포함한 총 15개 삽입 돌연변이체 중 intergenic 부분에 T-DNA가 도입된 계통이 8개(53%)이며, exon 지역 3개(20%), intron 지역 1개(7%), 5′ upstream-1000 지역 1개, 3′ downstream-500 지역 1개로 분석되었다.
고등 식물에서 가장 높은 빈도로 존재하고 있는 단백질의 도메인을 선택하기 위하여, EMBL-EBI의 Integr8에서 제공하는 단백질체 분석 정보를 검색하였으며, 획득된 단백질 정보를 NCBI GenBank 데이터베이스의 protein BLAST로 분석하여 배추 속에서 가장 높은 일치율을 나타내는 염기서열을 수집하였다. 분석 결과 [Zinc finger protein LSD1; InterPro ID IPR005735], [Serine/threonine protein kinase; InterPro ID IPR008271], [Leucine-rich repeat (LRR) protein; IPR012569], [RNA recognition motif domain; InterPro ID IPR001890] 도메인(domain)을 선발하였다. 수집된 높은 빈도의 도메인 염기서열 가운데, 높은 상동성을 보이는 부분을 BLAST로 비교 분석하여 특이적 결합 비율을 180-300가지로 무작위성(degeneracy)을 제한함으로써 반응 특이성을 확보하였다(Table 1).
899의 left border 부분을 기존의 Liu and Whittier(1995)의 TAIL PCR 방법과 nested specific primer에 일부 염기 서열의 연속 지역이 없는 primer 조합(LSP1, LSP3, LcSP4, LcSP5)을 사용한 TAIL PCR 및 최적화된 VA-TAIL PCR을 실시하여 비교분석 하였다. 분석 결과 최적화된 VA-TAIL PCR 결과에서 BrAD4, BrAD5, BrAD6를 사용한 조합의 0.4-1.0kb사이에 특이적 산물이 확인되었다(Fig. 2C). 특히 특이적 primer인 SP3와 SP4의 경우 각각 7bp가 겹치게 구성되어 있으며 각각의 반응이 독립적으로 이루어졌기 때문에, 각각의 반응에서 동일한 위치의 PCR 산물을 특이적 산물로 판단할 수 있다.
2B). 즉, 본 연구에서 최적화된 VA-TAIL PCR 방법이 배추를 이용한 연구에서 기존의 TAIL PCR 방법보다 훨씬 효과적임을 확인할 수 있었으며, nested specific primer의 연쇄가 증폭 효율에 효과적임을 확인할 수 있었다.

후속연구

, 2004) 및 autosegment(Mukai and Nakagawa, 1996), touch-up PCR(Ailenberg and Silverman, 2000) 방법을 응용한 가변적인 PCR 반응 프로그램을 적용하였다. 이에 따라 본 방법을 이용하면 T-DNA가 도입된 대량의 배추 집단에서 정확하고 효과적으로 T-DNA 인접 염기 서열을 분석할 수 있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	인접 염기서열을 확인하는 방법은 무엇이 있는가	인접 염기서열을 확인하는 방법으로는 Hamilton et al.(1991)에 의해 보고된 플라스미드 회수법(plasmid rescue)과 inverse PCR(Ochman et al., 1988), ligation-mediated PCR(Cottage et al., 2001; Rosenthal and Jones, 1990), thermal asymmetric interlaced(TAIL)-PCR(Liu and Whittier, 1995)과 같은 PCR 방법을 응용한 다양한 방법들이 보고되었다. 특히 TAIL PCR 법은 알고 있는 염기서열 정보를 바탕으로 특이적 nested primer와 16bp 정도의 변성 primer가 다중 단계의 온도 변화 단계를 적용한 반복 프로그램에 의하여 반응을 일으키는 것으로, 낮은 특이적 반응(low-stringency)과 높은 특이적 반응(high-stringency)이 반복적으로 이루어지면서 목적 DNA의 인접염기서열을 증폭시켜주는 방법으로 동물, 식물 및 곰팡이까지 널리 이용되고 있으며(Hirochika, 2001; Jeon et al.
	TAIL PCR 법이란?	, 2001; Rosenthal and Jones, 1990), thermal asymmetric interlaced(TAIL)-PCR(Liu and Whittier, 1995)과 같은 PCR 방법을 응용한 다양한 방법들이 보고되었다. 특히 TAIL PCR 법은 알고 있는 염기서열 정보를 바탕으로 특이적 nested primer와 16bp 정도의 변성 primer가 다중 단계의 온도 변화 단계를 적용한 반복 프로그램에 의하여 반응을 일으키는 것으로, 낮은 특이적 반응(low-stringency)과 높은 특이적 반응(high-stringency)이 반복적으로 이루어지면서 목적 DNA의 인접염기서열을 증폭시켜주는 방법으로 동물, 식물 및 곰팡이까지 널리 이용되고 있으며(Hirochika, 2001; Jeon et al., 2007; Pillai et al.
	TAIL PCR 법의 단점은?	, 2006), microarray까지 적용되어 대량의 시료를 한번에 분석할 수 있게 되었다(Mahalingam and Fedoroff, 2001). 그러나 이러한 TAIL-PCR은 획득할 수 있는 산물의 크기가 0.3-4kb 정도로 제한적이며, 그 성공률도 20-40% 이다(Liu and Whittier, 1995). 이러한 효율의 제약을 극복하기 위하여 primer의 길이를 조절하는 high-efficiency TAIL PCR(Liu and Chen, 2007; Michiels et al.

참고문헌 (31)

Alonso, J.M. and J.R. Ecker. 2006. Moving forward in reverse: genetic technologies to enable genome-wide phenomic screens in Arabidopsis. Nat. Rev. Genet. 7:524-536.

상세보기
Ailenberg, M. and M. Silverman. 2000. Controlled hot start and improved specificity in carrying out PCR utilizing Touch-Up and Loop Incorporated Primers (TULIPS). Biotechniques 29:1018-1024.

상세보기
Amsterdam, A., C. Yoon, M. Allende, T. Becker, K. Kawakami, S. Burgess, N. Gaiano, and N. Hopkins. 1997. Retrovirus-mediated insertional mutagenesis in zebrafish and identification of a molecular marker for embryonic germ cells. Cold Spring Harb Symp. Quant. Biol. 62:437-450.
Antal, Z., C. Rascle, M. Fevre, and C. Bruel. 2004. Single oligonucleotide nested PCR: a rapid method for the isolation of genes and their flanking regions from expressed sequence tags. Curr. Genet. 46:240-246.

상세보기
Azpiroz-Leehan, R. and K.A. Feldmann. 1997. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: going back and forth. Trends Genet. 13:152-156.

상세보기
Bechtold, N. and G. Pelletier. 1998. In planta Agrobacteriummediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods Mol. Biol. 82:259-266.

상세보기
Cottage, A., A. Yang, H. Maunders, C. Lacy, and N. Ramsay. 2001. Identification of DNA sequences flanking T-DNA insertions by PCR-walking. Plant Mol. Biol. Rep. 19:321-327.

상세보기
Hamilton, B.A., M.J. Palazzolo, J.H. Chang, K. VijayRaghavan, C.A. Mayeda, M.A. Whitney, and E.M. Meyerowitz. 1991. Large scale screen for transposon insertions into cloned genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2731-2735.

상세보기
Hirochika H. 2001. Contribution of the Tos17 retrotransposon to rice functional genomics. Curr. Opin. Plant Biol. 4:118-122.

상세보기
Jeon, J.S., S. Lee, K.H. Jung, S.H. Jun, D.H. Jeong, J. Lee, C. Kim, S. Jang, K. Yang, J. Nam, K. An, M.J. Han, R.J. Sung, H.S. Choi, J.H. Yu, J.H. Choi, S.Y. Cho, S.S. Cha, S.I. Kim, and G. An. 2000. T-DNA insertional mutagenesis for functional genomics in rice. Plant J. 22:561-570.

상세보기
Jeon, J., S.Y. Park, M.H. Chi, J. Choi, J. Park, H.S. Rho, S. Kim, J. Goh, S. Yoo, J. Choi, J.Y. Park, M. Yi, S. Yang, M.J. Kwon, S.S. Han, B.R. Kim, C.H. Khang, B. Park, S.E. Lim, K. Jung, S. Kong, M. Karunakaran, H.S. Oh, H. Kim, S. Kim, J. Park, S. Kang, W.B. Choi, S. Kang, and Y.H. Lee. 2007. Genome-wide functional analysis of pathogenicity genes in the rice blast fungus. Nat. Genet. 39:561-565.

상세보기
Kim, H.S., S.H. Kim, and Y.D. Park. 2003. Development of rescue cloning vector with phophinothricin resistant gene for effective T-DNA tagging. J. Kor. Soc. Hort. Sci. 44:407-411.
Kim, J.S., J. Kim, T.H. Lee, K.M. Jun, T.H. Kim, Y.H. Kim, H.M. Park, J.S. Jeon, G. An, U.H. Yoon, B.H. Nahm, and Y.K. Kim. 2012. FSTVAL: a new web tool to validate bulk flanking sequence tags. Plant Methods 8:19.

상세보기
Lee, G.H., Y.J Kang, S.K. Yi, S.B. Lim, and Y.D. Park. 2010. Development of a highly effective T-DNA inserted mutant screening method in a Chinese cabbage (Brassica rapa L. spp. pekinensis) reverse genetics system. Plant Biotechnol. Rep. 4:201-211.

원문보기 상세보기
Lee, M.K., H.S. Kim, J.S. Kim, S.H. Kim, and Y.D. Park. 2004. Agrobacterium-mediated transformation system for large-scale production of transgenic Chinese cabbage (Brassica rapa L. ssp. pekinensis) plants for insertional mutagenesis. J. Plant Biol. 47:300-306.

원문보기 상세보기
Liu, Y.G. and Y. Chen. 2007. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques 43:649-656.

상세보기
Liu, Y. and R. Whittier. 1995. Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking. Genomics 25:674-681.

상세보기
Mahalingam, R. and N. Fedoroff. 2001. Screening insertion libraries for mutations in many genes simultaneously using DNA microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7420-7425.

상세보기
Martienssen, R.A. 1998. Functional genomics: probing plant gene function and expression with transposons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2021-2026.

상세보기
McCouch, S.R., G. Kochert, Z.H. Yu, Z.Y. Wang, G.S. Khush, W.R. Coffman, and S.D. Tanksley. 1988. Molecular mapping of rice chromosomes. Theor. Appl. Genet. 76:815-829.

상세보기
Michiels, A., M. Tucker, W.V.D. Ende, and A.V. Laere. 2003. Chromosomal walking of flanking regions from short known sequences in GC-Rich plant genomic DNA. Plant Mol. Biol. Rep. 21:295-302.

상세보기
Mukai, H. and T. Nakagawa. 1996. Long and accurate PCR (LA PCR). Jpn. J. Clin. Med. 54:917-922.
Ochman, H., A. Gerber, and D. Hartl. 1988. Genetic application of an inverse polymerase chain reaction. Genetics 120:621-623.
Ohler, L.D. and E.A. Rose. 1992. Optimization of long-distance PCR using a transposon-based model system. PCR Methods Appl. 2:51-59.

상세보기
Pillai, M.M., G.M. Venkataraman, S. Kosak, and B. Torok-Storb. 2008. Integration site analysis in transgenic mice by thermal asymmetric interlaced (TAIL)-PCR: segregating multipleintegrant founder lines and determining zygosity. Transgenic Res. 17:749-754.

상세보기
Reddy, P.S., S. Mahanty, T. Kaul, S. Nair, S.K. Sopory, and M.K. Reddy. 2008. A high-throughput genome-walking method and its use for cloning unknown flanking sequences. Anal. Biochem. 381:248-253.

상세보기
Rosenthal, A. and D. Jones. 1990. Genomic walking and sequencing by oligo-cassette mediated polymerase chain reaction. Nucl. Acid. Res. 18:3095-3096.
The Rice Annotation Project. 2007. Curated genome annotation of Oryza sativa ssp. japonica and comparative genome analysis with Arabidopsis thaliana. Genome Res. 17:175-183.

상세보기
Weld, R.J., K.M. Plummer, M.A. Carpenter, and H.J. Ridgway. 2006. Approaches to functional genomics in filamentous fungi. Cell Res. 16:31-44.

상세보기
Yang, T.J., J.S. Kim, K.B. Lim, S.J. Kwon, J.A. Kim, M. Jin, J.Y. Park, M.H. Lim, H.I. Kim, S.H. Kim, Y.P. Lim, and B.S. Park. 2005. The Korea Brassica genome project: a glimpse of the Brassica genome based on comparative genome analysis with Arabidopsis. Comp. Funct. Genomics. 6:138-146.

상세보기
Yu, J.G., G.H. Lee, J.S. Kim, E.J. Shim, and Y.D. Park. 2010. An insertional mutagenesis system for analyzing the Chinese cabbage genome using Agrobacterium T-DNA. Mol. Cells 29:267-275.

원문보기 상세보기

저자의 다른 논문 :

LOADING...

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증