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문제 정의
- 본 논문에서는 HIV/AIDS 환자를 현장에서 신속하게 진단하고 치료 경과를 지속적으로 모니터링할 수 있는 CD4 검사기기 개발을 목표로, 시료챔버에 주입한 혈액 한 방울 정도의 미량 시료 내 CD4 림프구를 형광 표지하기 위한 항원-항체 반응 조건을 정량적으로 평가하였다. 또한 형광강도 보정입자를 이용하여 개발된 검사기기의 검출 한계를 파악하고 CD4 림프구의 형광 표지 최적 조건을 도출하는 방법을 제시하였다.
- 본 논문에서는 HIV/AIDS의 현장 신속 진단법으로 최근에 활용되기 시작한 형광 영상 기반 CD4 검사법의 시료 전처리 단계에서 CD4 림프구를 형광 표지하기 위한 항원- 항체 반응 조건을 정량적으로 평가하였다. 이를 위해 항체농도, 반응시간, 시료챔버 등의 다양한 조건에 따라 변하는 형광 영상의 SNR을 측정해본 결과, 일반적인 CD4 검사프로토콜에서 권장하는 항체 농도(CAb = 10%)보다 더 낮은 항체 농도(CAb ≤ 3.
제안 방법
- 한 개의 영상에서 형광 표지된 CD4 림프구(N=4)의 테두리를 설정한 후 계조치의 평균값을 구하고 배경 또한 2개 영역을 설정하여 계조치의 평균값을 구했다. CD4 림프구의 평균 계조치를 배경의 평균 계조치로 나눈 신호대잡음비(signal-to-noise ratio; SNR)를 구하여 노출시간에 따른 SNR의 변화를 살펴보았다.
- 각 단계의 시료를 1 μL씩 슬라이드 위에 떨어뜨린 후 커버글라스를 덮어 관찰하였다.
- 따라서 항체 농도 또는 반응시간이 CD4 림프구의 형광 강도에 미치는 영향을 살펴보는 후속 실험에서는 Δtexp = 100 ms로 설정하였다.
- 본 논문에서는 HIV/AIDS 환자를 현장에서 신속하게 진단하고 치료 경과를 지속적으로 모니터링할 수 있는 CD4 검사기기 개발을 목표로, 시료챔버에 주입한 혈액 한 방울 정도의 미량 시료 내 CD4 림프구를 형광 표지하기 위한 항원-항체 반응 조건을 정량적으로 평가하였다. 또한 형광강도 보정입자를 이용하여 개발된 검사기기의 검출 한계를 파악하고 CD4 림프구의 형광 표지 최적 조건을 도출하는 방법을 제시하였다.
- 반응이 끝난 시료를 1 μL씩 슬라이드 위에 떨어뜨린 후 커버글라스를 덮어 형광 표지된 CD4 림프구(N=5)를 형광현미경으로 관찰하였다.
- 현재 CD4 현장검사기기로 유체 흐름을 이용하는 유세포분석기와 달리 시료챔버와 형광 염색된 세포의 영상 분석에 기반한 CD4 세포분석기가 개발되고 있다(6,8). 본 연구진은 선행연구를 통해 스마트폰 카메라와 자체 개발한 영상 획득 및 분석 에플리케이션을 이용한 세포분석기를 개발하여 시료챔버 내 혈구의 개수와 형상 측정 기능을 구현하고 형광검출 성능을 평가하였다(9).
- 형광 영상의 계조치를 형광 강도로 변환시키기 위하여 MESF(Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome)값을 이미 알고 있는 형광 강도 보정입자 시료(Quantum™ MESF Kits, Bangs Laboratories)를 사용하였다. 시료를 슬라이드와 시료챔버에 각각 주입하고 형광현미경에서 획득한 영상의 계조치를 측정하였다. 보정입자는 평균 지름이 7.
- 시료챔버에는 2번과 3번 시약을 1 μL씩 주입하여 영상을 획득하였다.
- 이때 CD4 림프구의 형광 영상을 최적의 조건에서 획득하고자 계조치 범위를 0-255로 고정하고 카메라 노출시간(Δtexp)을 50, 100, 150 ms로 조절하여 CD3-PE/Cy5 항체와 CD4-PE 항체가 모두 부착된 림프구의 영상을 얻은 후 분석 프로그램(ImageJ, http://imagej.nih.gov/ij/)을 이용하여 노출시간이 CD4 림프구의 형광 강도에 미치는 영향을 분석하였다.
- 시료챔버에는 2번과 3번 시약을 1 μL씩 주입하여 영상을 획득하였다. 이렇게 얻어진 보정입자 영상을 분석하여 SNR을 구하고 형광 표지된 CD4 림프구(N=5)의 SNR과 비교하였다.
- 반응이 끝난 시료를 1 μL씩 슬라이드 위에 떨어뜨린 후 커버글라스를 덮어 형광 표지된 CD4 림프구(N=5)를 형광현미경으로 관찰하였다. 카메라 노출시간을 100 ms로 고정한 상태에서 형광 영상을 획득하고 앞서 설명한 절차에 따라 영상을 분석하여 항체 농도에 따른 SNR의 변화를 살펴보았다.
- gov/ij/)을 이용하여 노출시간이 CD4 림프구의 형광 강도에 미치는 영향을 분석하였다. 한 개의 영상에서 형광 표지된 CD4 림프구(N=4)의 테두리를 설정한 후 계조치의 평균값을 구하고 배경 또한 2개 영역을 설정하여 계조치의 평균값을 구했다. CD4 림프구의 평균 계조치를 배경의 평균 계조치로 나눈 신호대잡음비(signal-to-noise ratio; SNR)를 구하여 노출시간에 따른 SNR의 변화를 살펴보았다.
- 이러한 오차와 상관없이 CD4 검사 프로토콜에서 권장하는 Δtinc = 15분보다 짧게 반응시켜도 SNR ≈ 2를 얻게 되므로 CD4 림프구를 검출할 수 있다. 한편 혼합에 의한 오차를 제거하고자 혼합효과를 가하지 않고 확산이 지배하는 반응조건을 조성하여 시료챔버 내에서 반응시간에 따른 CD4 림프구의 형광 강도를 분석하였다.
- 혈액과 항체를 반응시킨 후, 1 μL를 슬라이드 위에 떨어뜨린 후 커버글라스를 덮어 형광현미경(IX51, Olympus)에서 10배 대물렌즈(0.3NA), PE와 Cy5 형광 검출을 위한 광학필터조합(525AF45, 560DRLP, 595AF60 or 695AF55, Omega Optical) 및 냉각 CCD 카메라(Sensicam, Cooke)를 통해 관찰하였다.
- 혈액에 각각 다른 방사 파장을 갖는 형광 표지가 부착된 항체 CD4-PE(ab18282, abcam; λex= 488 nm, λem= 575nm)와 CD3-PE/Cy5(ab95510, abcam; λex = 496 nm, λem= 670 nm)을 넣어 백혈구의 일종인 CD4 림프구와 형광 표지가 붙은 항체를 결합시켰다.
- 혈액에 항체를 3.3% 및 10% 농도만큼 희석하여 반응 용기 내에서 일정하게 섞고 실온에서 Δtinc = 5, 15, 30, 60분 반응시킨 시료를 1 μL씩 슬라이드 위에 떨어뜨린 후 커버글라스를 덮어 형광현미경으로 관찰하였다.
- 형광 염색된 CD4 림프구를 배경으로부터 구별하는데 필요한 항체량을 알아보고자 전체 시료 양을 기준으로 항체 농도(C Ab)를 1, 2, 3.3, 5, 10, 20%으로 변화시켜 실온에서 혈액과 15분씩 반응시켰다. 반응이 끝난 시료를 1 μL씩 슬라이드 위에 떨어뜨린 후 커버글라스를 덮어 형광 표지된 CD4 림프구(N=5)를 형광현미경으로 관찰하였다.
- 혼합효과가 있는 경우 반응시간(Δtinc)이 혈액과 항체 결합에 미치는 영향을 확인하고자 항체 농도가 3.3%와 10%인 두 가지 시료에 대해 반응시간에 따른 SNR의 변화를 살펴보았다.
- 혼합효과뿐만 아니라 일정한 공간 내에서의 확산반응을 살펴보고자 같은 조건으로 준비한 시료 10 μL를 높이가 0.1 mm인 플라스틱 시료챔버(C-Chip, INCYTO)에 주입한 후 실온에서 Δtinc = 5, 15, 30, 60, 90, 120분 반응시켜 형광 표지된 CD4 림프구(N=5)를 형광현미경으로 관찰하고 분석하였다.
- 확산효과가 지배적일 때 반응시간이 혈액과 항체 결합에 미치는 영향을 확인하고자 혈액에 전체 시료양의 3.3% 및 10% 농도에 해당하는 항체를 넣고 혼합효과를 배제한 조건에서 바로 시료챔버에 10 μL를 주입하여 실온에서 Δtinc = 5, 15, 30, 60, 90, 120분 동안 반응시켜 형광 표지된 CD4 림프구(N=5)를 형광현미경으로 관찰하였다.
대상 데이터
- 형광 영상의 계조치를 형광 강도로 변환시키기 위하여 MESF(Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome)값을 이미 알고 있는 형광 강도 보정입자 시료(Quantum™ MESF Kits, Bangs Laboratories)를 사용하였다.
성능/효과
- Δtinc ≤ 90분 범위에서는 SNR이 대체적으로 증가하는 경향을 보였으나 Δtinc 9', '>9')">>90분에서는 SNR이 감소했다.
- (b)를 보면 Δtinc 증가에 따라 CD4 림프구의 형광 강도가 증가하나 증가율은 점차 감소함을 확인할 수 있다.
- 4(c)에서 볼 수 있듯이 혼합효과를 배제하고 확산에 의한 반응을 유도한 결과 혼합효과가 반영되었던 Fig. 3(c)의 SNR 경향과는 다르게 CAb = 3.3%인 시료가 CAb = 10%인 시료보다 반응시간에 상관없이 SNR이 낮았다. Δtinc ≤ 90분 범위에서는 SNR이 대체적으로 증가하는 경향을 보였으나 Δtinc 9', '>9')">>90분에서는 SNR이 감소했다.
- 그리고 확산효과를 주었을 때와 마찬가지로 Δtinc 9', '>9')">>90분에서 SNR이 낮아졌으며 혼합효과를 주었을 때 더 높은 SNR을 가졌다.
- 0이 되므로 현미경에서 형광 표지된 CD4 림프구를 충분히 관찰할 수 있고 적절한 영상처리를 통해 배경으로부터 분리해서 자동 계수할 수 있다. 만약 개발된 CD4 현장검사기기에서도 동일한 결과가 얻어진다면 일반적인 CD4 검사법에서 사용하는 CAb = 10% 보다 낮은 항체 농도를 사용해서 CD4 림프구를 검출 가능하고 결과적으로 고가의 항체 비용을 절감할 수 있다는 것을 의미한다.
- 본 논문에서 제시한 항원-항체 반응 조건의 정량적 평가 방법은 CD4 현장검사기기 개발에 활용할 수 있을 것으로 기대된다. 본 논문에서 제시한 방법에 따라 도출된 결과는 연구에 사용된 특정 형광현미경 및 카메라에 의존하지만, 형광 강도 보정입자를 사용하여 서로 다른 검사기기의 검출한계 등의 성능을 상호 비교할 수 있다.
- 이를 위해 항체농도, 반응시간, 시료챔버 등의 다양한 조건에 따라 변하는 형광 영상의 SNR을 측정해본 결과, 일반적인 CD4 검사프로토콜에서 권장하는 항체 농도(CAb = 10%)보다 더 낮은 항체 농도(CAb ≤ 3.3%)에서도 형광 표지된 CD4 림프구의 검출이 가능함을 확인하였다.
- 그리고 확산효과를 주었을 때와 마찬가지로 Δtinc 9', '>9')">>90분에서 SNR이 낮아졌으며 혼합효과를 주었을 때 더 높은 SNR을 가졌다. 이상의 결과로부터 시료챔버에서 확산 효과와 혼합효과의 영향을 비교해보면 CAb = 10%인 시료에서는 확산에 의해 짧은 반응시간으로도 높은 SNR을 얻을 수 있었으며, CAb = 3.3%인 시료에서는 혼합효과를 통해 높은 SNR을 얻을 수 있었다.
- 3%의 낮은 항체 농도를 갖는 시료는 혼합효과를 주어 짧은 반응시간(Δtinc ≤ 10분)으로 CAb = 10%의 항체 농도를 갖는 시료와 비슷한 수준의 형광 강도 검출이 가능했다. 카메라 노출시간, 항체농도, 혼합 및 확산 반응 시 반응시간의 영향과 형광 강도 정량화에서 각 데이터간의 차이를 분산분석(ANOVA test) 을 통해 분석해본 결과 p값이 유의수준인 0.05 보다 작으므로 통계적 유의성이 존재한다는 것을 확인했다. 본 논문에서 제시한 항원-항체 반응 조건의 정량적 평가 방법은 CD4 현장검사기기 개발에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
후속연구
- 05 보다 작으므로 통계적 유의성이 존재한다는 것을 확인했다. 본 논문에서 제시한 항원-항체 반응 조건의 정량적 평가 방법은 CD4 현장검사기기 개발에 활용할 수 있을 것으로 기대된다. 본 논문에서 제시한 방법에 따라 도출된 결과는 연구에 사용된 특정 형광현미경 및 카메라에 의존하지만, 형광 강도 보정입자를 사용하여 서로 다른 검사기기의 검출한계 등의 성능을 상호 비교할 수 있다.
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