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문제 정의
- 본 실험은 부분 간 절제 후 가미소요산 혈맥약침이 간 기능 회복 및 간 재생에 미치는 영향을 알아보기 위해 시행하였다. SD rat 를 avertin 마취 후 간의 좌엽을 절제하고 12시간 동안 생존한 쥐를 대조군(control group), 위약군(saline group), 실험군 (Gamisoyo-san group)으로 무작위 분류하였다.
- 이에 본 연구에서는 SD rat의 간을 부분절제한 후, 가미소요산 혈맥약침을 rat 꼬리정맥을 통해 주입한 다음 7일 후 혈청 내 간 효소 수치 및 간 재생률을 측정한 결과 간기능의 회복에 양호한 경과를 나타내어 이를 보고하는 바이다.
제안 방법
- SD rat 간의 약 30%를 차지하는 좌엽(left lobe)을 절제하였다. 본 실험에 적용한 부분 간 절제술은 Gaub과 Iversen의 방법19)을 응용하였다.
- 본 실험은 부분 간 절제 후 가미소요산 혈맥약침이 간 기능 회복 및 간 재생에 미치는 영향을 알아보기 위해 시행하였다. SD rat 를 avertin 마취 후 간의 좌엽을 절제하고 12시간 동안 생존한 쥐를 대조군(control group), 위약군(saline group), 실험군 (Gamisoyo-san group)으로 무작위 분류하였다. 대조군에게는 아무런 처치를 하지 않았고, 위약군에게는 꼬리정맥을 통해 PBS를 1주일 동안 3회 주사하였으며, 실험군에게는 가미소요산 혈맥약침액을 위약군과 같은 방법으로 꼬리정맥을 통해 1주일 동안 3회 주사하였다.
- 가미소요산 처방 구성은 『東醫寶鑑·血門』에 기록된 처방구성16)을 기준으로 삼았으며, 구성 약재를 무게 비율로 배합하여 약재의 총합이 약 15g이 되도록 하였다(Table 1).
- 가미소요산 혈맥약침이 부분 간절제 후 간 기능 회복 및 간 재생에 미치는 영향을 알아보기 위해 간 절제술 후 AST, ALT, ALP와 간 재생률을 분석한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 간 절제술이 끝난 익일부터 실험군(Gamisoyo-san) 에 대해서는 2일 1회씩 rat의 꼬리정맥을 통해 가미 소요산 혈맥약침을 투여하였다. 가미소요산의 투여 농도는 10㎎/㎏이 되도록 하였으며 실험기간 동안 총 3회 투여하였다. 위약군(saline group)에게는 동일한 용량의 PBS를 꼬리정맥을 통해 주입하였으며, 실험군과 동일하게 간 절제 수술이 끝난 익일부터 2일 1회씩 PBS를 투여하였다.
- 간 절제술을 시행하면서 절제한 간의 무게를 측정하고, 7일 후 ethyl ether를 이용하여 희생시킨 다음 전체 간을 적출하여 무게를 측정하였다. 또한 동일한 환경에서 자란 동일한 주령의 SD rat을 ethyl ether를 이용해 희생시킨 후 간을 적출하여 원래 간 무게(estimated whole liver weight)를 추정하였으며, 이를 이용하여 아래와 같은 방식으로 간 재생률 (liver regeneration ratio)을 계산하였다.
- 간 절제술을 시행한 후 7일 째에 쥐를 희생시키고 간을 적출하여 무게를 측정하였으며, 수술을 진행할 때 절제한 간 무게를 이용하여 간 재생률(liver regeneration ratio)을 계산하였다. 그 결과 수술 후 7일 째 실험군의 간 재생률은 87.
- 간 절제술이 끝난 익일부터 실험군(Gamisoyo-san) 에 대해서는 2일 1회씩 rat의 꼬리정맥을 통해 가미 소요산 혈맥약침을 투여하였다. 가미소요산의 투여 농도는 10㎎/㎏이 되도록 하였으며 실험기간 동안 총 3회 투여하였다.
- SD rat 를 avertin 마취 후 간의 좌엽을 절제하고 12시간 동안 생존한 쥐를 대조군(control group), 위약군(saline group), 실험군 (Gamisoyo-san group)으로 무작위 분류하였다. 대조군에게는 아무런 처치를 하지 않았고, 위약군에게는 꼬리정맥을 통해 PBS를 1주일 동안 3회 주사하였으며, 실험군에게는 가미소요산 혈맥약침액을 위약군과 같은 방법으로 꼬리정맥을 통해 1주일 동안 3회 주사하였다.
- 간 절제술을 시행하면서 절제한 간의 무게를 측정하고, 7일 후 ethyl ether를 이용하여 희생시킨 다음 전체 간을 적출하여 무게를 측정하였다. 또한 동일한 환경에서 자란 동일한 주령의 SD rat을 ethyl ether를 이용해 희생시킨 후 간을 적출하여 원래 간 무게(estimated whole liver weight)를 추정하였으며, 이를 이용하여 아래와 같은 방식으로 간 재생률 (liver regeneration ratio)을 계산하였다.
- 사육실은 24±2℃의 온도, 56±3%의 습도에서 12/12h day/ night cycle로 유지하였으며, 적응 기간에는 고형 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 수술 후 7일 째에 모든 쥐를 ethyl ether를 이용하여 희생시켰으며, 간 기능의 회복정도를 알아보기 위해 심장에서 전혈을 채취하여 혈청 내 AST, ALT, ALP를 검사하였다. 간 절제술을 시행한 후 간 재생에 있어서 간 기능검사(liver function test;LFT) 수치가 간의 어떠한 상태를 대변하는지에 대해서는 아직 자세한 연구가 이루어지지 않고 있지만, 기본적으로 AST, ALT는 간의 실질세포(parenchymal cell)에 존재하면서 간세포가 파괴될 시 혈중으로 방출되게 되며 ALP는 담관계 폐쇄가 발생할 시 혈중 농도가 증가하므로 이들은 전반적인 간 기능을 나타내게 된다34).
- 간 절제술을 실시한 후 12시간 동안 생존한 쥐를 실험에 사용하였다. 실험군은 아무런 약물도 투여하지 않은 대조군(control group), 꼬리정맥으로 phosphate-buffered saline(PBS)를 투여한 위약군(saline group), 꼬리정맥으로 가미소요산 혈맥약침을 투여한 실험군(Gamisoyo-san group)으로 구분하였으며, 각 군당 동물의 수는 네 마리로 하였다.
- 가미소요산의 투여 농도는 10㎎/㎏이 되도록 하였으며 실험기간 동안 총 3회 투여하였다. 위약군(saline group)에게는 동일한 용량의 PBS를 꼬리정맥을 통해 주입하였으며, 실험군과 동일하게 간 절제 수술이 끝난 익일부터 2일 1회씩 PBS를 투여하였다. 대조군(control group)에게는 아무런 처치를 하지 않았다.
- 을 기준으로 삼았으며, 구성 약재를 무게 비율로 배합하여 약재의 총합이 약 15g이 되도록 하였다(Table 1). 이후 약재를 넣은 플라스크에 70% ethanol을 시료무게의 10배 부피(151.5㎖)로 첨가하여 80℃로 1시간 동안 환류추출법으로 추출하였다. 추출액을 Whatmann 필터(Cat No.
- 실험동물을 희생하고 심장에서 전혈을 채취한 후 실온에서 30분 동안 방치하여 자연응고 시켰으며, centrifuge를 이용하여 15분간 3000 rpm으로 원심분리를 시행하여 상층액인 혈청을 분리하였다. 이후 혈청 내 glutamic-oxalacetic-transaminase (GOT/AST), glutamic pyruvic- transaminase (GTP/ALT), alkaline phosphatase (ALP)의 측정을 한국동물의과학연구소 (Korea)에 의뢰하였다.
- 그 후 좌엽을 수직으로 들어 올린 후 좌엽 기저부를 수술용 실을 이용하여 피가 통하지 않도록 묶은 다음 최대한 혈관에 가까운 곳을 scissor를 이용하여 절단하였다. 절단부위를 지혈한 후 복막은 흡수성 봉합사로 봉합을 하고 피부는 비흡수성 봉합사로 봉합을 하였으며, povidone-iodine을 이용하여 봉합 부위를 소독을 하였다.
- 5㎖)로 첨가하여 80℃로 1시간 동안 환류추출법으로 추출하였다. 추출액을 Whatmann 필터(Cat No. 1001)로 여과한 후 rotary evaporator를 이용하여 감압농축하여 가미소요산 추출물을 획득하였다. 최종적으로 획득한 추출물은 총 1.
대상 데이터
- 간 절제술을 시행하기 전에는 12시간 동안 단식시켰다. 간 절제술을 실시한 후 12시간 동안 생존한 쥐를 실험에 사용하였다. 실험군은 아무런 약물도 투여하지 않은 대조군(control group), 꼬리정맥으로 phosphate-buffered saline(PBS)를 투여한 위약군(saline group), 꼬리정맥으로 가미소요산 혈맥약침을 투여한 실험군(Gamisoyo-san group)으로 구분하였으며, 각 군당 동물의 수는 네 마리로 하였다.
- 실험동물은 8주령의 outbred male Sparague-Dawley rat를 사용하였으며, 대한바이오링크(Korea)에서 구매하여 1주일 동안 실험실에서 적응시켰다. 사육실은 24±2℃의 온도, 56±3%의 습도에서 12/12h day/ night cycle로 유지하였으며, 적응 기간에는 고형 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 실험에 사용한 약재는 대전한약국(대전, Korea)에서 구매하였으며, 구매한 약재는 ultrasonic cleaner를 이용하여 60분 동안 초음파 세척을 실시한 후 dry oven에서 60℃로 건조한 다음 정선하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 측정 결과는 mean±S.D. (standard deviation)으로 나타냈으며, 통계학적 분석을 수행하여 p<0.05일 때 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
- 통계분석은 SPSS version 18.0을 이용하여 실험군 간에 Mann-Whitney U test, Kruskal-Wallis test 를 실시하였다. 모든 측정 결과는 mean±S.
이론/모형
- SD rat 간의 약 30%를 차지하는 좌엽(left lobe)을 절제하였다. 본 실험에 적용한 부분 간 절제술은 Gaub과 Iversen의 방법19)을 응용하였다. 먼저 avertin을 300㎎/㎏ 용량으로 intraperitoneal injection하여 rat를 마취시킨 후 개복부위의 털을 제거하였다.
성능/효과
- 1. 실험군의 혈중 AST, ALT, ALP는 대조군 및 위약군에 비해 유의하게 감소하였다.
- 2. 실험군의 간 재생률은 87.76%로 대조군 82%, 위약군 71.46% 보다 높았으나 유의한 차이는 없었다.
- 간 재생률 계산 공식을 통해 각 실험군의 간 재생 률을 비교한 결과 간 절제술 후 7일째에 대조군은 82%, 위약군은 71.5%, 실험군은 87.8%의 재생률을 보여, 실험군에서 대조군과 위약군에 비해 높은 재생률을 나타내었으나 통계적으로 유의한 차이는 없 었다.(Table 3, Figure 4).
- 간 절제 7일 후 혈청 ALT 농도는 실험군에서 대조군 및 위약군에 비하여 유의하게 낮았다(Figure 2).
- 간 절제술을 시행한 후 7일 째에 쥐를 희생시키고 간을 적출하여 무게를 측정하였으며, 수술을 진행할 때 절제한 간 무게를 이용하여 간 재생률(liver regeneration ratio)을 계산하였다. 그 결과 수술 후 7일 째 실험군의 간 재생률은 87.76%로 대조군(82%) 과 위약군(71.46%) 보다 높은 간 재생률을 보였다.
- 본 실험에서 간 절제 후 7일째 혈중 AST, ALT, ALP가 rat의 정상 간수치 범위(AST: 45.7-80.8U/L, ALT: 17.5-30.2U/L, ALP: 56.8-128U/L)35)에 비해 크게 증가하여(AST: 172.35±88.16U/L, ALT: 172.35±32.65U/L, ALP: 1228.4±172.83U/L) 간절제에 의한 간기능 이상을 알 수 있었다.
- 이상의 결과, 가미소요산 혈맥약침은 부분 간절제후 간 기능 회복에 유효한 것으로 사료된다.
- 도인 또한 간손상 모델에서 AST, ALT, ALP의 개선 및 항섬유효과가 있다고 알려져 있으며39), 당귀는 간손상 모델에서 혈청 간효소를 감소시킬 뿐만 아니라 간장의 울혈, 간세포의 괴사 및 지방변화를 경감시킨다고 보고되고 있다40). 이와 같이 소요산에서 목단피 및 치자, 도인 등 약재가 추가된 가미소요산은 기존 소요산에 비해 더욱 강력한 간기능회복 효과, 담즙분비촉진작용, 소염작용, 어혈제거 등 작용을 발휘한다는 것을 예시하여 주었으며, 거어생신(祛瘀生新)의 작용에 의해 간기능의 회복 및 간재생을 촉진한 것으로 사료된다.
- 먼저 avertin을 300㎎/㎏ 용량으로 intraperitoneal injection하여 rat를 마취시킨 후 개복부위의 털을 제거하였다. 이후 수술 부위를 povidone-iodine 용액을 이용하여 소독한 후 xiphoid process 아래에서 linea alba를 따라 세로로 약 2~3cm 정도 절개하고 간 좌엽을 복강 밖으로 노출시킨 후 interlobular ligaments를 제거하여 간의 절제가 용이하게 하였다. 그 후 좌엽을 수직으로 들어 올린 후 좌엽 기저부를 수술용 실을 이용하여 피가 통하지 않도록 묶은 다음 최대한 혈관에 가까운 곳을 scissor를 이용하여 절단하였다.
- 1001)로 여과한 후 rotary evaporator를 이용하여 감압농축하여 가미소요산 추출물을 획득하였다. 최종적으로 획득한 추출물은 총 1.683g으로 수율은 약 11.22%였다.
- 한편 간 절제 후 가미소요산 혈맥약침을 시술한 실험군에서는 혈중 AST가 81.32±9.23U/L, ALT가 31.75±10.35U/L로 대조군과 위약군에 비하여 유의 하게 감소하여 정상범위에 근접하였으며, 혈중 ALP 또한 741.75±74.66U/L로 대조군(1228.4±172.83U/L) 및 위약군(1102.02±251.43U/L)에 비해 유의하게 감소하였다.
후속연구
- 본 연구는 부분 간 절제 모델에서 간 기능에 미치는 효과를 관찰한 기초연구이며 특히 일반적인 경구투여가 아닌 혈맥약침을 이용한 연구로, 향후 그 기전 및 임상효능에 대한 심도 깊은 추가 연구가 필요할 것이라 판단된다. 또한 혈맥약침과 일반 경구투여의 효과 차이에 대해서도 연구할 가치가 있다고 판단된다.
- 본 연구는 부분 간 절제 모델에서 간 기능에 미치는 효과를 관찰한 기초연구이며 특히 일반적인 경구투여가 아닌 혈맥약침을 이용한 연구로, 향후 그 기전 및 임상효능에 대한 심도 깊은 추가 연구가 필요할 것이라 판단된다. 또한 혈맥약침과 일반 경구투여의 효과 차이에 대해서도 연구할 가치가 있다고 판단된다.
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