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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 백미를 B subtilis CBD2로 배양한 발효 물을 이용하여 곡류 효소함유 식품을 개발하고자 하였으며 발효물에 함유되어 있는 amylase의 안정화를 위해 알긴산과 키토산을 피복물질로 사용하여 미세캡슐 분말로 제조하였고 미세캡슐화 한 분말의 물리화학적 특성 및 amylase 활성을 조사하였다.
- 본 연구에서는 백미 발효물을 곡류 효소함유 식품으로 개발하고자 Bacillus subtilisCRS를 접종하여 96시간 발효한 다음 알긴산 및 키토산을 피복물질로 사용하여 분무건조 미세캡슐 분말을 제조하였고, 분말의 물리화학적 특성 및 amylase 활성을 조사하였다. 백미 발효물의 생균수, pH 및 amylase 활성은 각각 7.
제안 방법
- In vitro 인체 내 소화모델은 Hur 등(18)의 in vitro human digestion의 multi-step model을 일부 수정하여 이용하였으며, 동결건조 및 분무건조 미세캡슐 분말의 amylase 활성측정을 통해 인체 내 소화모델을 분석하였다. 사용된 액은 대한약전에 따라 당일 제조 하였으며, 위장액(pH 1.
- 이후 소장액 18 mL를 첨가하여 1시간 반응 한 다음 대장액 6 mL를 첨가하여 2시간 반응을 진행하였다. 각 용액 첨가 시 sodium bicabonate(Duksan Pure Chemicals.) 및 sodium hydroxide(Duksan Pure Chemicals.)를 사용하여 pH를 보정한 다음 amylase 활성을 측정하였다.
- 43 unit/mL이었다. 백미 발효물의 미세캡슐 분말 제조는 알긴산 1.0% 및 키토산을 각각 0.3%, 0.5%, 1.0%를 첨가하여 분무건조 하였다. 분무건조 미세캡슐 분말의 수분함량은 2.
- 분무건조공정을 이용한 미세캡슐의 제조는 백미 발효물 500 mg] alginic acid(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 1.0%(SD-A) 와 chitosan(223 kDa, Kittolife, Seoul, Korea)을 각각 0.3%(SD-Ach0.3), 0.5%(SD-Ach0.5) 및 1.0%(SD-Achl.0)를 첨가한 다음 고압균질기(HG-15D, DAIHAN scientific Co., Wonju, Kow)를 이용하여 4, 000 tpm에서 15분간 균질화하였다. 제조된 균질액은 주입 온도 160t, 방출 온도 1KTC로 설정하였고, 분무속도는 17, 000 tpm에서 시료공급속도는 12 mL/min의 조건으로 아토마이저 (atomizer)가" 장착된 분무건조기 (KL8, Seogang Engineaing Co.
- 색도 측정은 분말을 표준색도가 Y=94.5, a=0.18, b=0.32 로 보정된 색차계 (Qromameter CR200, Nfinolta Co., Osaka, Japan)를 사용하여, 밝기를 나타내는 L0ightness), 적색 도를 나타내는 a(redness), 황색도를 나타내는 b(yellowness) 값을 측정하였으며, 색차 는 동결건조 분말을 대조구로 하여 아래와 같이 계산하였다.
- 생균수 측정은 배양액 1 mL에 0.85% sodium chloride (Duksan Pure Chemicals, Seoul, Korea) 용액 9 mL를 혼합하여 10배 희석법으로 희석한 다음, 각각의 희석액 100 uL를 1.5% agar(Sigma-Aldrich Co.)가 첨가 된 nutrient broth(NB, 腿o.)에 접종하여 평판 측정법으로 생균수를 측정하였다. 각각의 plate는 37t 배양기go Tedi Co.
- 수분함량 측정은 분말을 페트리디쉬에 담아 적외선 수분 측정기 (MB45, Moisture analyzer, INC., Ohaus, USA)를 이용하여 105X:에서 분말의 수분함량이 항량에 도달할 때까지 건조하여 측정하였다.
- 수분흡수지수(water absorption index, WAI) 및 수분 용해지수(water solubility index, WSI) 측정은 phillips의 방법(17)을 변형하여 측정하였다. 동결건조 및 미세캡슐 분말 0.
- 입자크기 측정은 레이저입도분석기(QS-13-320, Beckman coulter, Fullerton, CA, USA)를 이용하여 isopropyl alcohol 에분산시켜 측정하였다. 입자표면구조는 각 시료에 gold ion coating한 후 주사형 전자현미경 (S-4800, Hitachi high-Technologies Co.
- , Tokyo, Japan)을 이용하였다. 전자현미경을 이용한 관찰은 3.0 kV에서 1,000배 비율로 관찰하였다.
대상 데이터
- , Wonju, Kow)를 이용하여 4, 000 tpm에서 15분간 균질화하였다. 제조된 균질액은 주입 온도 160t, 방출 온도 1KTC로 설정하였고, 분무속도는 17, 000 tpm에서 시료공급속도는 12 mL/min의 조건으로 아토마이저 (atomizer)가" 장착된 분무건조기 (KL8, Seogang Engineaing Co., Ltd, Cheonan, Korea)를 이용하여 미세캡슐 분말을 제조한 다음, -7(rc 이하의 암소에 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다. 대조구로는 피복물질을 첨가하지 않고 동결건조기 (FreeZone-2.
- , Ltd, Cheonan, Korea)를 이용하여 미세캡슐 분말을 제조한 다음, -7(rc 이하의 암소에 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다. 대조구로는 피복물질을 첨가하지 않고 동결건조기 (FreeZone-2.5, Labconco Co., Kansas, MO, USA) 를 이용하여 건조한 분말을 사용하였다.
- 발효를 위해 사용된 미생물은 된장으로부터 분리 동정한 BacillussubtilisCBD2를 이용하였다(15). Starts는 백미 분말 20 g을 삼각플라스크에 넣고 멸균 한 다음 40 mL의 멸균수를 첨가하여 사용하였으며 B.
- 본 실험에 사용된 백미는 경상북도 의성군에서 2013년 10월에 재배된 것을 구입하여 건식 분쇄기(FM-909W, Haml Co., Sejong, Koma)로 분쇄한 다음 표준망체 (0.074 mm, Chung Gye Sang Gong Sa, Seoul, Korea) 를 통과시킨 분말을 사용하였다.
- 통해 인체 내 소화모델을 분석하였다. 사용된 액은 대한약전에 따라 당일 제조 하였으며, 위장액(pH 1.2)은 0.1 N hydrochloric acid(HCl, Duksan Pure Chemicals.)을, 소장액 (pH 6.8) 및 대장액 (pH 7.4)은 0.1 M sodium phosphate(Duksan Pure Chemicals.) 완충용액을 사용하여 제조하였다. 반응은 환류수조(BS-31, Jeio Tech Go.
데이터처리
- 실험결과는 3회 반복으로 행하여 평균土표준편차로 나타내었으며 SPSS(19.0, SPSS Inc., Chicagp, IL, USA)를 이용하여 분산분석(ANOVA)을 실시하였으며, 각 측정 평균값의 유의성 (p<0.05)은 Duncan's multiple range test로 검정하였다.
이론/모형
- 2에 나타내었다. 분무건조 미세캡슐 분말의 in vitro 소화모델을 확인하기 위해 muti-step model 의 방법을 이용하였으며, 이는 각각의 소화 단계별로 식품소재의 bioavailabil剪를 측정할 수 있을 뿐만 아니라 인체의 소화 조건과 매우 유사하다는 장점을 가지고 있다(18). 모든 분말은 위장액(pH 1.
- )에서 반응시켰다. 이 때 생성된 환원당의 함량은 3, 5-dinitrosaHcync acid(DNS, Sigma-Aldrich Go.)방법(16)으로 측정하였으며, 본 연구에서 효소 활성의 1 unite 1 분에 1 pmol의 glucose(Sigma-Aldrich Go.)를 생산하는 효소량으로 정의하였다.
성능/효과
- 백미 배양물은 초기에 비해 96시간 발효한 다음 pH가 감소하였으며, 이는 미생물에 의해 발효가 진행되면서 생성된 lactic acid와 acetic add 등의 여러가지 산의 생성과 관계가 있는 것으로 사료된다(20). Amylase 활성은 159.43 unit/mL로 나타났으며, Park 등(21)의 곡물별 담자균 배양물의 효소활성에서 120시간 발효한 다음 백미의 a-amylase 활성은 46.16~91.74 unit/mL를 나타내어 본 연구에서 배양된 백미 발효물의 활성이 높게 나타남을 알 수 있었다.
- 62 log CFU/g로 유의적인 차이를 나타내지 않았다. Amylase 활성은 동결건조 분말에서 506.02 unit/g으로 유의적으로 높게 나타났으며, 키토산 1.0% 첨가 분무건조 미세캡슐 분말에서 196.63 unit/g으로 활성이 가장 낮게 나타났다. 알긴산 단독 첨가군의 활성은 268.
- 또한, Chang 등(35)은 효소 특성 개선을 위한 ^■glucosidase의 효소 고정화 연구에서 키토산 비드 제 조시 높은 pH와 고온에서 비고정 효소보다 안정성이 증가한다고 보고하였다. in vitro 소화 모델을 통하여 각 소화 기관별 백미 발효 분말의 인체 내 소화모델을 확인한 결과, 분무건조 미세캡슐 분말은 위액에서 안정하게 통과하여 소장 및 대장에서 amylase 활성을 나타냄을 확인하였다. 즉, amylase함유 백미 발효 분말을 섭취한 다음 위장의 낮은 pH에서 효소활성을 잃지 않고 소장 및 대장에서 안정적으로 흡수 가능한 분말 제조가 가능 할 것으로 사료되며, 본연구에서 제조된 분무건조 미세캡슐 분말은 알긴산의 위장관 체류시간 연장과 일정한 방출효과를 가지는 키토산에 의해 산성 조건에서의 효소활성을 보호하며 인체 내 이용률 향상을 통해 효소식품 및 서방성 약물 전달체로서의 응용연구에 크게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 분무건조 미세캡슐 분말의 in vitro 소화모델을 확인하기 위해 muti-step model 의 방법을 이용하였으며, 이는 각각의 소화 단계별로 식품소재의 bioavailabil剪를 측정할 수 있을 뿐만 아니라 인체의 소화 조건과 매우 유사하다는 장점을 가지고 있다(18). 모든 분말은 위장액(pH 1.2)에서 활성을 나타내지 않았으며, 키토산을 0.3% 첨가한 분무건조 미세캡슐 분말은 소장액(pH 6.8)에서 269.14 unit/t也의 활성을 나타내었다. 특히 대장액 (pH 7.
- 백미에 a subtilisCRS를 2%로 접종하여 96 시간 발효한 결과 생균수는 7.61 log CFU/mL이었고 pH는 5.08을 나타내었다. 생균수는 Yang 등(19)의 B.
- 80 pm의 범위를 나타내었으며 분자량이 증가함에 증가한다고 보고하였다. 본 연구에서는 입자크기가 100 pn 이하로 균일한 분포를 보여주었고, 분무건조 공정을 통해 제조된 균일한 입자크기의 미세캡슐 분말은 흐름성이 양호할 것으로 사료된다.
- 57 unit/g으로 나타나 동결건조 분말 보다 낮게 나타났다. 분말의 인체 내 소화 모델에서, 모든 분말은 pH 12의 인공위액에서 활성을 나타내지 않았으며, 최종적으로 pH 7.4의 대장조건에서 알긴산에 0.3%의 키토산을 첨가한 분무건조 미세캡슐 분말이 85.93%의 amylase 활성을 나타내어 인체에서의 높은 이용률이 기대되었다.
- 0%를 첨가하여 분무건조 하였다. 분무건조 미세캡슐 분말의 수분함량은 2.90-3.68%였으며, 색도는 키토산 첨가량이 증가함에 따라 L값 및 a값은 감소하고, b값 및 값은 상대적으로 증가하였다. 입자크기는 분무건조 미세캡슐 분말에서 48.
- 분무건조 미세캡슐 분말의 입자표면구조는 전반적으로 구형의 모양을 나타냄에 따라 흐름성이 양호할 것으로 사료되며, 알긴산 단독 첨가군의 경우 매끈한 굴곡을 가진 표면구조를 나타내었으나, 키토산 함량이 증가할수록 표면 굴곡이 증가하는 경향을 나타내었다. Kim 등(28)은 부형제 종류에 따른 분말의 주사전자 현미경 관찰에서 입자 표면의 부드러운 구형이 아닌 움푹 들어간 자국들은 건조 과정 중에 입자들이 수축함에 따른 현상이라고 보고하였다.
- 색도는 동결건조 분말 L값, a값 및 b값이 각각 95.85, -0.30 및 5.60을 나타내었으며, 분무건조 미세캡슐 분말에서는 키토산 함량이 증가함에 따라 L값(92.25~96.18) 및 a값(-0.79~-l.26)은 낮아지고 b값(5.60~15.69)은 증가하는 경향을 나타내었다. 특히 동결건조 분말을 기준으로 본값은 키토산 0.
- 12%)보다 높게 나타났다. 생균수 및 amylase 활성은 동결건조 분말에서 각각 7.01 log CFU/g 및 506.02 unit/g으로 나타났으며, 분무건조 미세캡슐에서는 각각 4.46-4.62 log CFU/g 및 196.63~268.57 unit/g으로 나타나 동결건조 분말 보다 낮게 나타났다. 분말의 인체 내 소화 모델에서, 모든 분말은 pH 12의 인공위액에서 활성을 나타내지 않았으며, 최종적으로 pH 7.
- 나타내었다. 생균수는 동결건조 분말에서 7.01 log CFU/g으로 가장 높게 나타났으며, 분무건조 미세캡슐 분말간의 생균수는 4.46-4.62 log CFU/g로 유의적인 차이를 나타내지 않았다. Amylase 활성은 동결건조 분말에서 506.
- 수분용해지수는 분무건조 미세캡슐 분말에서 9.17-10.89%로 동결건조 분말 7.12%에 비해 높은 용해지수를 나타내었으며, 동결건조 분말 및 알긴산 단독 첨가에 비해 키토산 함량이 증가할수록 수분용해지수가 높게 나타남을 확인하였다. 미세캡슐의 입자크기가 작아질수록 수분용해지수가 높아지는 경향을 나타내었는데, Kum 등(31)은 품종 및 입자크기에 따른 쌀가루의 수분흡수지수 및 수분용해지수 측정 결과 입자크기가 작을수록 수분흡-수지수 및 수분용해지수가 증가한다고 보고하였으며, Ori 등(32)의 흑미의 입자크기 및 제분 조건에서 입자가 작을수록 수분용해지수가 3.
- 수분함량은 동결건조 분말에서 2.30%로 가장 낮은 함량을 나타내었으며, 분무건조 미세캡슐 분말에서 2.90~3.68%로 키토산 함량이 증가함에 따라 높게 나타났다. Beom 등(22)의 수창포 열풍 및 동결건조 분말의 수분함량에서 각각 8.
- 87 皿 보다 작았으며, 표면구조는 전반적으로 구형을 나타내었으나, 키토산 함량이 증가함에 따라 표면 굴곡이 증가하였다. 수분흡수지수는 분무건조 미세캡슐 분말에서 2.40~2.65로 동결건조 분말 2.66에 비해 낮은 흡수지수를 나타내었으며, 수분 용해지수는 분무건조 미세캡슐 분말에서 9.17~10.89%로 동결건조 분말(7.12%)보다 높게 나타났다. 생균수 및 amylase 활성은 동결건조 분말에서 각각 7.
- 63 unit/g으로 활성이 가장 낮게 나타났다. 알긴산 단독 첨가군의 활성은 268.57 unit/g이었으며, 키토산 첨가량이 증가함에 따라 활성이 낮아지는 경향을 나타내었다. Yang 등(19)의 Bacillus subtili最 이용한 곡류 발효 분말의 생균수 및 amylase 활성이 각각 6.
- 1에 나타내었다. 입자크기는 동결건조 분말에서 357.87 pm로 분무건조 미세캡슐 분말에 비해 유의적으로 크게 분석되었으며, 미세캡슐 분말의 입자크기는 48.13-68.48 pm로 키토산 함량이 증가할수록 유의적으로 감소되는 경향이었다. Park 등(27) 은 키토산 분자량에 따른 ecarotene의 미세캡슐화 및 품질 특성에서 분자량별로 입자크기가 26.
- 68%였으며, 색도는 키토산 첨가량이 증가함에 따라 L값 및 a값은 감소하고, b값 및 값은 상대적으로 증가하였다. 입자크기는 분무건조 미세캡슐 분말에서 48.13-68.48 呻로 동결건조 분말 357.87 皿 보다 작았으며, 표면구조는 전반적으로 구형을 나타내었으나, 키토산 함량이 증가함에 따라 표면 굴곡이 증가하였다. 수분흡수지수는 분무건조 미세캡슐 분말에서 2.
- 14 unit/t也의 활성을 나타내었다. 특히 대장액 (pH 7.4)에서 222.28 unit/mL의 활성을 유지하여 백미 발효 물의 섭취 후 위장 환경에서 생리활성을 잃지 않고 이를 소장 및 대장에서 방출되었으며, 최종적으로 85.93%의 인체 내 이용률을 통해 안정화 효과가 가장 잘 이루어진 것으로 나타났다. 동결건조 분말의 경우 소장액(pH 6.
- 식품산업에서 동결건조는 건조후의 복원성이 우수하여 널리 활용되고 있으나 Kim 등(33)의 연구에서 효소식품을 동결건조 하는 경우 장시간 건조에 따른 효소실활이 일어날 수 있다고 보고하였다. 특히 동결건조 분말은 효소의 저장 및 섭취과정에서 열과 강산, 강알칼리에서 효소 활성이 불안정하므로 pH 및 온도 등의 영향에 대한 안정성 향상을 위해 알긴산 및 키토산 피복물질을 통해 효소의 저장성 및 인체 내 안정화가 용이할 것으로 사료된다.
- 69)은 증가하는 경향을 나타내었다. 특히 동결건조 분말을 기준으로 본값은 키토산 0.3%에서 2.92로 가장 낮고 키토산 1.0%에서 10.95로 가장 높게 나타나 키토산 함량이 증가할수록 색 차의 변화가 증가하였다. Lee와 No(25)는 키토산 첨가 생면 연구에서 키토산 함량이 증가할수록 L값은 낮아지고 b 값은 높은 경향을 나타내었으며 Kim 등(26)은 키토산 및 젤라틴 폴리머 필름 제조에서 색도는 키토산 함량이 증가할수록 L값 및 a값은 감소되었고 b값은 반비례로 증가되어 본 연구와 유사한 경향을 나타내었다.
후속연구
- in vitro 소화 모델을 통하여 각 소화 기관별 백미 발효 분말의 인체 내 소화모델을 확인한 결과, 분무건조 미세캡슐 분말은 위액에서 안정하게 통과하여 소장 및 대장에서 amylase 활성을 나타냄을 확인하였다. 즉, amylase함유 백미 발효 분말을 섭취한 다음 위장의 낮은 pH에서 효소활성을 잃지 않고 소장 및 대장에서 안정적으로 흡수 가능한 분말 제조가 가능 할 것으로 사료되며, 본연구에서 제조된 분무건조 미세캡슐 분말은 알긴산의 위장관 체류시간 연장과 일정한 방출효과를 가지는 키토산에 의해 산성 조건에서의 효소활성을 보호하며 인체 내 이용률 향상을 통해 효소식품 및 서방성 약물 전달체로서의 응용연구에 크게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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