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문제 정의
- 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 짚신나물 뿌리를 추출한 시료를 가지고 항산화 및 항균활성, 안전성 시험을 비롯한 생리활성 시험과 미백시험을 비롯한 피부 효능개선 시험을 조사하여 기능성 화장품 소재로서의 개발 가능성을 검토하고자 하였다.
- 본 연구에서 짚신나물(A pilosa)의 뿌리부분에 대한 다양한 생리활성을 조사하여 기능성소재 응용가능성을 검토하였다. 짚신나물 뿌리 추출물은 멜라노마 세포에 대하여 낮은 세포독성을 나타냈다.
제안 방법
- 방법(16)을 변형하여 측정하였다. 기질로서 5 mM DL-DOPA 용액 0.2 mL, 0.1 M 인산완충용액 (pH 6.8) 0.2 mL 및 시료용액 0.5 mL의 혼합액에 mushroom tyrosinase (Sigma Chemical CO., 250 unit/mL) 0.1 mL을 첨가하여 37 "C 에서 10분간 반응시킨 다음 475 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 아래 식에 따라 tyrosinase 저해활성을 산출하였다. 각 처리농도에서의 결과 수치로 50% 저해 농도(ID so)을계산하여 tyrosinase 저해 활성 정도를 표현하였다.
- 250 mg/L. 500 mg/L, 750 mg/L, 1,000 mg/L 의 농도로 처리한 후, WST-1 분석법(13)을 이용하여 세포독성을 측정하였다(Fig. 1). 대조군과 대비하여 250 mg/L, 500 mg/L, 750 mg/L, 1,000 mg/L의 APE 농도에서 각각 0%, 0.
- (desc diffusion method)을 이용하였다. DMSO 10 pL 에 10 mg이 되도록 만든 후 DMSO만을 함유한 disc를 대조군으로 하고, 각 농도의 시료액을 포함한 disc를 시험 균으로 그람양성균 대표로서 B. subtilis, 그람음성균 대표로서 E. coli, 효모균 대표로서 C. albicans를: 균일하게 접종된 배지 위에 올려 놓고 301:에서, E coli 만 37C에서 48시간 동안 배양하여 disc주변의 투명환을 관찰하여 항균활성을 측정하였다(I 鬼. 3). 대조군에서는 균의 증식이 억제되지 않았으나 짚신나물 뿌리 추출물에 대하여는 항균활성이 나타났으며, 특히, 그람양성균에 대한 항균활성이 가장 높게 나타났다.
- DPPH radical 소거능 실험은 DPPH(l, l-diphenyl-2-picryl hydrazyl, Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) 에 의한 전자공여 능 (electron donating ability, ED A) 을 측정하였다 (14). 즉, 0.
- Melanin 합성에 중요한 단백질인 tyrosinase 저해활성 측정은 효소 작용 결과 형성되는 DL-P-3, 4-dihydroxyphenyl alanine(DOPA) dnume을 비색법에 의해 측정하는 Masamoto 등의 방법(16)을 변형하여 측정하였다. 기질로서 5 mM DL-DOPA 용액 0.
- 또한, 시간별로 항균작용이 어떤 변화를 보이는지 알아보기 위해 timAcurve를 작성하였다. 각각 균주 배 양액 에 짚신나물 뿌리 추출물 최종농도가 100 mg/L이 되도록 처리한 후, 일정 시간별로 배양액을 채취하였다. 채취한 배양액을 십진희석법으로 희석하고 각각 균주평판 배지에 접종하여 배양한 후, 생성되는 군락(colony) 의 수를 측정하고 CFU/mL로 환산하였다.
- albicane 의 배 양조건에 따라 24~48시간 동안 배 양한 다음 paper disc 주위의 clear zone 및 inhibition zone의 크기로 항균성을 조사하였다. 또한, 시간별로 항균작용이 어떤 변화를 보이는지 알아보기 위해 timAcurve를 작성하였다. 각각 균주 배 양액 에 짚신나물 뿌리 추출물 최종농도가 100 mg/L이 되도록 처리한 후, 일정 시간별로 배양액을 채취하였다.
- 대조군에서는 균의 증식이 억제되지 않았으나 짚신나물 뿌리 추출물에 대하여는 항균활성이 나타났으며, 특히, 그람양성균에 대한 항균활성이 가장 높게 나타났다. 또한, 추출물 시료 최종농도가 1Q0 mg/L가 되도록 처리한 후, 시간별로 각각 시험군에 대한 항균작용을 알아보기 위해, time curve를 작성하였다(Fig. 3). 대조군의 경우 시간이 경과함에 따라 균의 증식에 변함이 없었으나 추출물 시료처리 경우는 배양 12시간 경과 후, R subtilis, E.
- 멜라닌 정량은 Hosoi 등의 방법(17)을 변형하여 사용하였다. 24 weU plate에 2x1(/ cells/well로 멜라노마 세포를 분주하였고, 3-isobutyl-l- methylxanthine(IBMX)으로 멜라 난 생성을 유도한 후, 상기 세포독성 실험에서 관찰된 짚신나물 추출물시료 농도를 처리하고 48시간 동안 371 CQz 배양기에서 배양하였다.
- 역할을 하고 있다. 이러한 멜라닌 중합체 생합성을 효과적으로 저해하기 위한 tyrosinase 저해활성을 측정하기 위하여 짚신나물 뿌리 추출물에 대한 mushroom유래의 tyrosinase 저해활성을 관찰하였다(Fig. 4). 주출물시료 10 mgL 50 mgL 100 mg/L의 경우, 각각 20.
- 즉, 시료액을 0.22 um membrane filter로 여과하여 제균하고 멸균된 paper disc에 흡수시킨 후 시험용 평판배지 표면에 놓아 밀착시키고 각 균주(3 subtilis, E. coH, C. albicane 의 배 양조건에 따라 24~48시간 동안 배 양한 다음 paper disc 주위의 clear zone 및 inhibition zone의 크기로 항균성을 조사하였다. 또한, 시간별로 항균작용이 어떤 변화를 보이는지 알아보기 위해 timAcurve를 작성하였다.
- 짚신나물 뿌리 추출물(APE)에 대한 세포독성 실험 측정에서 정한 독성이 없는 농도에서 멜라닌 생성 저해 활성을 측정하였다(Fig. 5). 대조군 대비하여 50 mg/L, 100 mg/L, 250 mg/L, 500 mg/L의 APE 농도에서 각각 51.
- 각각 균주 배 양액 에 짚신나물 뿌리 추출물 최종농도가 100 mg/L이 되도록 처리한 후, 일정 시간별로 배양액을 채취하였다. 채취한 배양액을 십진희석법으로 희석하고 각각 균주평판 배지에 접종하여 배양한 후, 생성되는 군락(colony) 의 수를 측정하고 CFU/mL로 환산하였다.
- 여기서 얻은 pellet에 1 N NaOH(10% DMSO) 200 uL를 첨가하고 vortex 후 405 nm에서 흡광도값을 측정하였다. 추출물을 처리하지 않은 시료군을 대조군으로 하고 미백제로 알려진 합성물질인 aibutin을 표준시료로 사용하였으며 결과는 %로 환산하였다. 각 처리농도에서의 결과 수치로 50% 멜라닌 생성저해 농도(IDso)을 계산하여 멜라닌 생성 저해 활성을 표현하였다.
- 8 mL에 식물추출물 시료 02 mL를 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화력은 [1-(시료첨가 구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)]X100의 계산식에 의해 전자공여능(%)을 구하였으며, 대조구는 시료 대신 메탄올을 첨가하였고, positive contel로 L-ascotbic acid를 사용하였다. 각 처리농도에서의 결과 수치로 50% 저해 농도 (ID50)를 계산하여 DPPH 소거 활성 정도를 표현하였다.
대상 데이터
- Formazaiie dimethly sulfoxide(DMSO) 에 녹아서 보라색 빛을 띄는데 spectrophotometer로 540 nm 파장에서 OD 값을 재어서 정량한다. 미국 세포주은행(ATCC)에서 분양 받은 멜라 노마 세포(muBne melanoma B16F10)를 10% 우 태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS, Gibco, USA) 이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM)에서 배양하고 24 well plate에 2x1(/ cells/well 의 농도로 세포를 접종한 후, 375% CO2 조건에서 배양한다. 이후 배양세포에 추출물을 농도별로 처리하고 72시간 배양하였다.
- 짚신나물(4 pilcsa) 뿌리에 대한 추출물은 국립원예특작과학원 인삼특작부 추출물은행에서 분양받은 시료를 실험에 이용하였으며 제시된 추출방법은 시료 200 g에 70% 에탄올 1 L를 첨가하여 실온에서 2일간 2회 추출하고 이를 여과, 감압농축, 동결건조 하는 것이다.
데이터처리
- 모든 실험은 독립적으로 3회 반복 시행하고 실험 결과는 평균 土 표준편차로 표기하였으며, 통계적 유의성은 Studenfs t-test로 하였으며 p<0.05일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
이론/모형
- 짚신나물 뿌리 추출물에 대한 항균활성 측정은 디스크 확산법 (desc diffusion method)을 이용하였다. DMSO 10 pL 에 10 mg이 되도록 만든 후 DMSO만을 함유한 disc를 대조군으로 하고, 각 농도의 시료액을 포함한 disc를 시험 균으로 그람양성균 대표로서 B.
- 짚신나물 뿌리 추출물에 대해서 대조구로 아스코르브산 (ascorbic acid)를 이용하여 DPPH 라디칼 소거 활성 법(14)으로 항산화 활성을 측정하였다. 추출물 시료와 대조구 시료를 각각 10 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L의 농도로 제조하여 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과 (Fig.
- 항균효과는 agar disc diffusion방법(15)을 이용하여 측정하였다. 즉, 시료액을 0.
성능/효과
- 7%의 소거능 활성을 보였으며 따라서 추출물 시료의 농도가 증가할수록 라디칼소거능 활성이 증가하였다. APE 각각에 대한 같은 시료농도 대조구인 아스코르브산과 비교 하였을 때는 소거활성이다소 낮았으나, 100 mg/L의 추출물 농도에서는 대조구와 거의 같은 라디칼 소거활성을 보였다(91.3%). 또한, APE의 경우, 50% 라디칼 소거활성 농도는 20.
- 추출물을 처리하지 않은 시료군을 대조군으로 하고 미백제로 알려진 합성물질인 aibutin을 표준시료로 사용하였으며 결과는 %로 환산하였다. 각 처리농도에서의 결과 수치로 50% 멜라닌 생성저해 농도(IDso)을 계산하여 멜라닌 생성 저해 활성을 표현하였다.
- 항산화력은 [1-(시료첨가 구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)]X100의 계산식에 의해 전자공여능(%)을 구하였으며, 대조구는 시료 대신 메탄올을 첨가하였고, positive contel로 L-ascotbic acid를 사용하였다. 각 처리농도에서의 결과 수치로 50% 저해 농도 (ID50)를 계산하여 DPPH 소거 활성 정도를 표현하였다.
- 1 mL을 첨가하여 37 "C 에서 10분간 반응시킨 다음 475 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 아래 식에 따라 tyrosinase 저해활성을 산출하였다. 각 처리농도에서의 결과 수치로 50% 저해 농도(ID so)을계산하여 tyrosinase 저해 활성 정도를 표현하였다.
- 결과는 %로 환산하였다. 각 처리농도에서의 결과 수치로 50% 저해농도(ID50)을 계산하여 세포 독성 정도를 표현하였다.
- 5). 대조군 대비하여 50 mg/L, 100 mg/L, 250 mg/L, 500 mg/L의 APE 농도에서 각각 51.7%, 72.2%, 91.3%, 100%의 멜라닌 생성 억제 활성을 확인하였다. 또한, APE의 경우, 50% 멜라닌 저해활성 농도는 62.
- 1). 대조군과 대비하여 250 mg/L, 500 mg/L, 750 mg/L, 1,000 mg/L의 APE 농도에서 각각 0%, 0.59%, 22.45%, 65.46% 세포독성을 나타냈으며, 50% 세포 독성을 나타내는 농도(ID50)는 881.11 mg/L로 나타났다. 따라서 이후의 실험은 독성이 거의 없는 500 mg/L 이하의 농도에서 진행하였으며 멜라닌 생성 억제효과로서 보고된 백합 뿌리 추출물(18)의 경우는 세포독성이 거의 없는 농도가 100 mg/L 이하인 것과 비교하였을 때 천연물시료 중 독성이 없는 더 안전한 물질로 판단된다.
- 3). 대조군에서는 균의 증식이 억제되지 않았으나 짚신나물 뿌리 추출물에 대하여는 항균활성이 나타났으며, 특히, 그람양성균에 대한 항균활성이 가장 높게 나타났다. 또한, 추출물 시료 최종농도가 1Q0 mg/L가 되도록 처리한 후, 시간별로 각각 시험군에 대한 항균작용을 알아보기 위해, time curve를 작성하였다(Fig.
- 3). 대조군의 경우 시간이 경과함에 따라 균의 증식에 변함이 없었으나 추출물 시료처리 경우는 배양 12시간 경과 후, R subtilis, E. coli, C. albicans 각각 대조군에 대하여 50.5%, 40.2%, 33.7%의 증식 억제가 확인되었다. 즉, 모든 시험균의 증식이 억제됨을 확인할 수 있었으며 disc 확산법과 마찬가지로 그람양^ 균인 R subtilis에 대한 증식억제 효과가 가장 높게 나타났다.
- 11 mg/L로 나타났다. 따라서 이후의 실험은 독성이 거의 없는 500 mg/L 이하의 농도에서 진행하였으며 멜라닌 생성 억제효과로서 보고된 백합 뿌리 추출물(18)의 경우는 세포독성이 거의 없는 농도가 100 mg/L 이하인 것과 비교하였을 때 천연물시료 중 독성이 없는 더 안전한 물질로 판단된다.
- 8%의 저해 활성을 나타내었다. 또한, APE의 경우, 50% tyrosinase 저해 활성농도는 90.18 mg/L 였으며 대조군 표준시료인 kojic acid의 경우는 89.13 mg/L 임을 고려하면, 짚신나물 뿌리 추출물 시료가 대조군 kojic acid와 비교했을 때도 동일한 수준으로 우수하게 나타났으며 또한, 다른 천연소재 중 우수한 미백 활성 효과로서 보고된 바(19) 있는 녹나무과 추출물 100 mg/L의 경우 52.8% tyrosinase 저해활성을 보이는 것과 비교하였을 때, 향후 미백 기능성 소재로서의 활용 가능성이 매우 높다고 생각된다.
- 65 mg/L 였다. 또한, 기존 보고된 짚신나물 잎 열수추출물의 50% 라디칼 소거활성 농도 13 mgL과 비교해 볼 때(2, 3) 짚신나물 뿌리 부분의 추출물에도 항산화 활성을 나타내는 물질이 함유되어 있음을 의미하며 항산화 소재로서의 가능성을 지니고 있음을 확인할 수 있다.
- 70 mg/L) 및 항균활성이 매우 우수하게 나타났으며 특히 그람 양^세균에 대한 항균활성이 높았다. 또한, 짚신나물 뿌리 추출물처리 시 높은 tyrosinase 활성저해(IDso, 90.18 mg/L) 및 멜라닌 함량 저하를 보여주었다. 이는 짚신나물 추출물이 세포 내 tyrosinase 발현을 억제시킴으로서 멜라닌 합성을 저해하는 것으로 판단된다.
- 즉, 시험재료에 있어서 피부미백효과는 멜라닌 생성 저해에 따른 tyrosinase 저해효과가 나타나야 한다. 본 연구의 짚신나물 뿌리 추출물(APE)의 경우도 멜라닌 저해 활성이 우수하였으며 이에 따른 tyrosinase 저해활성도 높았다. 따라서 짚신나물 뿌리 주출물의 경우, 직접적인 tyrosinase 활성저해에 의한 기작으로 멜라닌 생성이 억제된 것으로 사료된다.
- 짚신나물 뿌리 추출물은 멜라노마 세포에 대하여 낮은 세포독성을 나타냈다. 세포독성이 거의 없는 농도에서 짚신나물 뿌리 추출물 처리 시 항산화(ID50, 20.70 mg/L) 및 항균활성이 매우 우수하게 나타났으며 특히 그람 양^세균에 대한 항균활성이 높았다. 또한, 짚신나물 뿌리 추출물처리 시 높은 tyrosinase 활성저해(IDso, 90.
- 7%의 증식 억제가 확인되었다. 즉, 모든 시험균의 증식이 억제됨을 확인할 수 있었으며 disc 확산법과 마찬가지로 그람양^ 균인 R subtilis에 대한 증식억제 효과가 가장 높게 나타났다. 따라서 짚신나물 추출물(APE)은 항균력이 우수하며, 특히 포자를 형성하여 살균이 상대적으로 어려운 그람양성균에 대한 항균력이 탁월함을 보임으로써 원인균에 대한 천연방부제로서의 소재개발 가능성을 기대할 수 있을 것으로 생각한다.
- 항산화 활성을 측정하였다. 추출물 시료와 대조구 시료를 각각 10 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L의 농도로 제조하여 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과 (Fig. 2), APE 농도 10 mg/L, 50 mg/L 경우 56.8%, 88.7%의 소거능 활성을 보였으며 따라서 추출물 시료의 농도가 증가할수록 라디칼소거능 활성이 증가하였다. APE 각각에 대한 같은 시료농도 대조구인 아스코르브산과 비교 하였을 때는 소거활성이다소 낮았으나, 100 mg/L의 추출물 농도에서는 대조구와 거의 같은 라디칼 소거활성을 보였다(91.
후속연구
- 즉, 모든 시험균의 증식이 억제됨을 확인할 수 있었으며 disc 확산법과 마찬가지로 그람양^ 균인 R subtilis에 대한 증식억제 효과가 가장 높게 나타났다. 따라서 짚신나물 추출물(APE)은 항균력이 우수하며, 특히 포자를 형성하여 살균이 상대적으로 어려운 그람양성균에 대한 항균력이 탁월함을 보임으로써 원인균에 대한 천연방부제로서의 소재개발 가능성을 기대할 수 있을 것으로 생각한다.
- 이는 짚신나물 추출물이 세포 내 tyrosinase 발현을 억제시킴으로서 멜라닌 합성을 저해하는 것으로 판단된다. 이와 같은 결과로 미루어 볼 때 짚신 나무 뿌리 추출물은 피부미백 소재 등 피부개선 효과를 비롯한 기능성 화장품에 활용하기 위한 매우 효과적인 재료가 될 수 있다고 판단된다.
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