[논문]우렁쉥이(Halocynthia roretzi) 껍질로부터 분리된 다당류의 면역증강 효과

이대훈; 홍주헌

doi:10.3746/jkfn.2015.44.5.673

우렁쉥이(Halocynthia roretzi) 껍질로부터 분리된 다당류의 면역증강 효과
Immune-Enhancing Effects of Polysaccharides Isolated from Ascidian (Halocynthia roretzi) Tunic 원문보기

한국식품영양과학회지 = Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, v.44 no.5, 2015년, pp.673 - 680

이대훈 (대구가톨릭대학교 식품공학전공) , 홍주헌 (대구가톨릭대학교 식품공학전공)

초록
AI-Helper

본 연구에서는 우렁쉥이 껍질 유래 다당류의 기능성식품 소재로의 활용 가능성을 확인하기 위하여 조다당류의 분리 및 정제를 통해 획분을 얻었으며 다양한 면역증강 효과를 확인하였다. 건조된 조다당류를 DEAE-sepharose CL-6B를 이용하여 크로마토그래피한 후 총당 및 uronic acid 함량을 분석한 결과, 증류수로 용출되는 비흡착 획분(APF-I, fraction No. 11~17)과 흡착된 후 NaCl 용액에 의해 용출되는 획분(APF-II, fraction No. 22~37)을 얻었다. 정제된 APF-I 및 APF-II의 이화학적 특성으로 총당 함량은 각각 66.62%, 27.03%, uronic acid 함량은 47.53%, 15.87%, hexosamine 함량은 16.62%, 46.79% 및 단백질 함량은 2.43%, 4.94%로 나타났다. APF-I 및 APF-II에 대해 RAW 264.7 세포에 처리하여 독성을 평가한 결과 $5{\mu}g/mL$ 농도까지 유의적으로 세포사멸이 나타나지 않아 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다. Nitric oxide 생산량은 APF-I이 $5{\mu}g/mL$ 농도에서 $22.23{\mu}m$ 함량을 나타내어 LPS 대비 73.48%로 타 구간에 비해 높은 생성량을 나타내었으며, cytokine 생성량(TNF-${\alpha}$ 및 IL-6) 또한 APF-I $5{\mu}g/mL$ 농도에서 각각 LPS 대비 104%, 100.1%를 나타내어 LPS와 유사한 생성량을 나타내었다. Polymerase chain reaction을 통한 면역관련 유전자 발현 분석 결과, iNOS, COX-2, TNF-${\alpha}$, IL-6에서 APF-I 구간에서 LPS 처리군 보다 높은 발현량을 나타내어 면역증강을 목적으로 한 기능성식품 개발에 활용 가능하다고 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, the immune-enhancing effects of purified polysaccharides from ascidian (Halocynthia roretzi) tunic were investigated. Crude polysaccharides (AP) were isolated by enzyme extraction (neutrase, $60^{\circ}C$, 15h), ethanol precipitation, and lyophilization. In addition, crude polysaccharides were further fractionated into unabsorbed fractions (APF-I, fraction No. 11~17) and absorbed fractions (APF-II, fraction No. 22~37) by DEAE-sepharose CL-6B column chromatography in order to isolate immune regulating polysaccharide. The major constituents in APF-I and APF-II were total sugar (66.62% and 27.03%), uronic acid (47.53% and 15.87%), hexosamine (16.62% and 46.79%), and protein (2.43% and 4.94%), respectively. APF-I increased production of nitric oxide (NO) and cytokines, such as tumor necrosis factor-alpha (TNF-${\alpha}$) and interleukin (IL)-6 in a dose-dependent manner. The mRNA expression levels of inducible NO synthetase, cyclooxygenase-2, TNF-${\alpha}$, and IL-6 were markedly increased as determined by polymerase chain reaction analysis. The above data led us to conclude that macrophage activation of purified polysaccharides was higher than that of crude polysaccharides. The polysaccharides isolated from ascidian tunic investigated herein are useful as natural immune enhancing agents.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

따라서 본 연구에서는 우렁쉥이 껍질로부터 조다 당류를 추출하였고 분리 및 정제를 통해 얻어진 분획물의 면역증강 효과를 확인하기 위해 NO 및 이와 관련된 cytokine들인 tu mor necrosis factor-alpha(TNF-a), interleukin(IL)-6의 생성량과 유전자 발현 정도를 분석하였고 면역증진 기능성 식품 소재로서의 활용 가능성을 조사하였다.
본 연구에서는 우렁쉥이 껍질 유래 다당류의 기능성식품 소재로의 활용 가능성을 확인하기 위하여 조다 당류의 분리 및 정제를 통해 획분을 얻었으며 다양한 면역증강 효과를 확인하였다. 건조된 조다 당류를 DEAE-sepharose CL-6B를이용하여 크로마토그래피한 후 총당 및 uronic acid 함량을 분석한 결과, 증류수로 용출되는 비흡착 획분(APF-I, fraction No.

제안 방법

, Rocky Hill, NJ, USA)으로제조사의 지침에 따라 측정하였다. TNF-a 및 IL-6의 함량은 kit에 포함된 TNF-a 및 IL-6로 작성한 표준곡선을 이용하여 계산하였다.
05 mL를 96-well plate에 넣고 잘 섞은 후 100°C에서 10분간 가열하였다. 그다음 상온에서 15분간 냉각 후 0.125% carbazole(w/v, Sigma-Aldrich Co.) 0.05 mL를 가하고 다시 100°C에서 10분간 가열하였으며 상온에서 15분 방냉한 후 microplate reader(UVM-340, ASYS Co., Eugendorf, Austria)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, galacturonic acid(Sigma-Aldrich Co.) 를 이용하여 작성한 표준 곡선으로부터 함량을 계산하였다.
, Bucheon, Korea) 하여 회수한 상등액에 최종 농도가 3% 되도록 trichloroacetic acid(TCA, Acros organics, Geel, Belgium)를 첨가하여 실온에서 30분간 방치한 후, 원심분리(3, 000Xg, 20분) 하여 침전된 단백질을 제거하였다. 단백질을 제거한 상등액을 감압 농축(Model N-1N, Eyela Co., Tokyo, Japan)한 다음, 농축액 대비 5배량의 ethanol을 첨가하여 24시간 교반하고 원심분리(3, 000Xg, 20분) 하여 조다 당류를 회수하였고, 동결건조기(Free Zone 2.5, Lab- conco Co., Kansas, MO, USA)로 건조하여 -70°C 이하의 암소에 보관하면서 분리 및 정제용 시료로 사용하였다.
1 ug/mL)를 처리하고 6시간 배양하였다. 배양된 세포를 모아 원심분리(1, 000Xg, 3분, Gyro 1236 MG, Gyrozen, Daejeon, Korea) 하여 상증액을제거하고, PBS로 cell을 세척한 후 pellet을 얻어 Rneasy mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 얻어진 RNA(1 ug)를 Revertaid first strand cDNA synthesis kit(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)으로 cDNA를 합성하여 RT-PCR(Mastercycler® nexus, Eppendorf, Hamburg, Germany)을 수행하였다. 사용된 primers se- quence는 Table 1과 같으며, PCR 조건은 94°C-30초 (denaturation), 55°C-30초(annealing), 72°C-1분(exten sion)으로 28회 증폭 후 72°C(re-extension)로 PCR 산물을 획득하였고, Eco view(Dae Myung Science Co.
)를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 후 상등액 50 uL에 동량의 Griess 시약(Sigma-Aldrich Co.)을 혼합하여 10분간 반응시킨 후 microplate reader (UVM-340, ASYS Co.)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, NO 생성량은 sodium nitrite(Sigma-Aldrich Co.)의 농도별 표준 곡선을 이용하여 계산하였다.
배양된 세포를 모아 원심분리(1, 000Xg, 3분, Gyro 1236 MG, Gyrozen, Daejeon, Korea) 하여 상증액을제거하고, PBS로 cell을 세척한 후 pellet을 얻어 Rneasy mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 얻어진 RNA(1 ug)를 Revertaid first strand cDNA synthesis kit(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)으로 cDNA를 합성하여 RT-PCR(Mastercycler® nexus, Eppendorf, Hamburg, Germany)을 수행하였다. 사용된 primers se- quence는 Table 1과 같으며, PCR 조건은 94°C-30초 (denaturation), 55°C-30초(annealing), 72°C-1분(exten sion)으로 28회 증폭 후 72°C(re-extension)로 PCR 산물을 획득하였고, Eco view(Dae Myung Science Co., Ltd., Seoul, Korea)를 포함한 1% agarose gel 상에서 전기영동 (Mupid-ex, Advance, Tokyo, Japan) 한 다음, 밴드의 강도를 Image J(National Institutes of health, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다.
세포독성은 MTT assay로 측정하였으며, 배양된 세포주를 5X104 cell/well의 농도로 조정하여 96-well plate에 100 uL씩 첨가하여 24시간 배양하고 이후 새로운 배지에 시료를 농도별로 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS 완충용액에 녹인 methyl thiazol-2-YL-2, 5- diphenyl tetrazolium bromide(MTT 5 mg/mL, Sigma- Aldrich Co.
2 mL 넣고 5분 반응시켰다. 여기에 0.2 mL 3-meth- yl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride mon- ohydrate(MBTH, Sigma-Aldrich Co.)를 넣고 37°C에서 30분 반응한 후 0.5% ferric chloride(w/v Duksan Pure Chemical Co.) 0.2 mL를 넣고 5분간 방치한 다음 650 nm 에서 흡광도를 측정하였으며, N-acetyl-glucosamine(Sig- ma-Aldrich Co.)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 계산하였다.
우렁쉥이 껍질 유래 조다 당류의 추출은 열풍 건조된 우렁쉥이 껍질 분말 10 g에 증류수를 고형분 대비 20배 첨가하고, 기질에 대하여 단백질 농도비가 1/50이 되도록 neu- trase(Novozymes, Bagsvaerd, Denmark)를 첨가하여 shaking incubator(BS-31, JEIO TEC)로 60°C, 150 rpm에서 15시간 동안 교반 추출하였다. 추출물은 원심분리(3, 000 Xg, 20분, VS-6000CFN, Vision Scientific Co.
우렁쉥이 껍질로부터 분리한 조다 당류(AP)를 DEAE- sepharose CL-6B를 이용하여 염 농도를 0~1.0 M로 증가시키면서 정제하였으며, 증류수로 용출되는 비흡착 획분 (APF-I, fraction No. 11~17)과 흡착된 후 NaCl 용액에 의해 용출된 획 분(APF-H, fraction No. 22~37)의 총당 및 uronic acid 함량 분석 결과는 Fig. 1과 같다. Pavao 등(22) 은 우렁쉥이로부터 분리된 조다 당을 DEAE-cellulose를 이용하여 염의 농도 증가(0~1.
우렁쉥이 껍질로부터 추출한 조다당류와 조다 당류에서 분리 정제한 다당류의 수율은 동결 건조(FreeZone 2.5, Labconco Co.)한 다음 건물 중량을 구하였고 시료 조제에 사용한 원료 건 물량에 대한 백분율로 나타내었다.
우렁쉥이 껍질에서 추출 분리된 조다 당류 및 다당류 정제 물은 농도별로 RAW 264.7 세포를 5X105 cell/well이 되도록 배양된 24-well plate에 처리하여 배양기에서 24시간 배양한 후, 배양 상등액을 이용하여 TNF-a 및 IL-6의 양을 ELISA kit(Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ, USA)으로제조사의 지침에 따라 측정하였다. TNF-a 및 IL-6의 함량은 kit에 포함된 TNF-a 및 IL-6로 작성한 표준곡선을 이용하여 계산하였다.
2오} 같다. 조다당류는 5~100 Ug/mL 농도에서, 분리 정제된 다당류는 0.5~10 ug/mL 농도로 처리하였을 때 각각 100 Ug/mL 및 5 ug/mL 이하 농도까지 유의적인 세포사멸이 나타나지 않아 세포독성이 없음을 확인하여 면역증강 세포실험의 농도로 설정하였다. NO는 면역계에서 외부 물질에 대한 방어 작용을 하는 중요한 신호전달 물질로 NOS의 작용에 의해 L-arginine이 L-citruline으로 변화되는 과정에서 생성되며, 대부분의 조직 세포에 영향을 미쳐 순환기계에서는 혈관 이완 물질로, 중추신경계에서는 신경 전달 물질로, 면역계에서는 방어 물질로 알려져 있다(28).
총당 함량은 5% phenol(w/v, Duksan Pure Chemical Co., Seoul, Korea) 1 mL오} sulfuric acid(Duksan Pure Chemical Co.) 5 mL를 시료 1 mL와 반응 시 킨 후 분광광도계(Ultra spec 2100pro, Biochrom Ltd., Cambridge, UK) 를 사용하여 470 nm에서 흡광도를 측정하였으며, glucose (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 계산하였다.
15시간 동안 교반 추출하였다. 추출물은 원심분리(3, 000 Xg, 20분, VS-6000CFN, Vision Scientific Co., Ltd., Bucheon, Korea) 하여 회수한 상등액에 최종 농도가 3% 되도록 trichloroacetic acid(TCA, Acros organics, Geel, Belgium)를 첨가하여 실온에서 30분간 방치한 후, 원심분리(3, 000Xg, 20분) 하여 침전된 단백질을 제거하였다. 단백질을 제거한 상등액을 감압 농축(Model N-1N, Eyela Co.

대상 데이터

본 실험에 사용된 우렁쉥이 껍질은 국내산으로 경상남도 통영시 소재 수산물 공판장에서 제공받아 실험에 사용하였다. 이물질을 제거하고 육과 분리한 우렁쉥이 껍질을 수회 수세 후 50°C에서 열풍 건조(OF-22, JEIO TEC, Daejeon, Korea)한 다음 분쇄기(J-NCM, Jisico, Seoul, Korea)로 분쇄하여 60 mesh 표준망체(Chung Gye Sang Gong Sa, Seoul, Korea)를 통과한 분말을 -20°C 이하의 암소에 보관하면서 추출용 시료로 사용하였다.
40071) 세포는 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea) 에서분양받아 사용하였다. 세포배양은 DMEM 배지(Welgene, Daegu, Korea)를 이용하여 각각 10% fetal bovine serum (Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA), 1% penicillin- streptomycin(Gibco BRL Co.)을 첨가하여 배양하였다. 세포는 모두 37°C, 5%로 조절된 CO₂incubator(MCO-18 AIC, SANYO Co.
실험에 사용한 대식세포 주인 RAW 264.7(KCTC No. 40071) 세포는 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea) 에서분양받아 사용하였다. 세포배양은 DMEM 배지(Welgene, Daegu, Korea)를 이용하여 각각 10% fetal bovine serum (Gibco BRL Co.
이물질을 제거하고 육과 분리한 우렁쉥이 껍질을 수회 수세 후 50°C에서 열풍 건조(OF-22, JEIO TEC, Daejeon, Korea)한 다음 분쇄기(J-NCM, Jisico, Seoul, Korea)로 분쇄하여 60 mesh 표준망체(Chung Gye Sang Gong Sa, Seoul, Korea)를 통과한 분말을 -20°C 이하의 암소에 보관하면서 추출용 시료로 사용하였다.

데이터처리

7 cell. Means SD (n=3) with different letters above bars are significantly different by Duncan's multiple range test (P<0.05). LPS, lipopolysaccharide; AP, crude polysaccharide from ascidi an tunic; APF-1 , polysaccharide fraction-1 from ascidian tun ic; APF- H , polysaccharide fraction- H from ascidian tunic.
7 cell. Means SD (n=3) with different letters above bars are significantly different by Duncan's multiple range test (P<0.05). LPS, lipopolysaccharide; AP, crude polysaccharide from ascidi an tunic; APF-1 , polysaccharide fraction-1 from ascidian tun ic; APF- H , polysaccharide fraction- H from ascidian tunic.
실험 결과는 3회 반복 실험한 다음 평균 士 표준편차로 나타내었으며 SPSS(19.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를이용하여 분산분석(ANOVA)을 실시하였고 각 측정 평균값의 유의성(尸<0.05)은 Duncan's multiple range test로 검정하였다.

이론/모형

Hexosamine 함량은 Blix(21)의 방법에 준하여 시료 100 uL를 1 M hydrochloric acid(HCl, Duksan Pure Chemical Co.) 용액으로 가수분해하였고 2.5% sodium nitrite(w/v, Sigma-Aldrich Co.) 0.4 mL를 넣은 후 15분간 반응한 다음 12.5% ammonium sulfamate(w/v, Sigma-Aldrich Co.)를 0.2 mL 넣고 5분 반응시켰다. 여기에 0.
다당류의 분리 및 정제를 위하여 조다 당류를 50 mM so dium phosphate buffer(pH 6.0)에 용해(50 mg/mL) 및 원심분리(3, 000Xg, 20분, VS-6000CFN, Vision Scientific Co.) 하여 불용성 물질을 제거한 후 DEAE-sepharose CL- 6B(Amersham Bio-sciences Co., Piscataway, NJ, USA) 를 충진제로 이용하여 column(2.5x30 cm)에 충진시키고, 50 mM sodium phosphate buffer(pH 6.0)로 평형화한 후 0~1 M NaCl로 농도구배를 주어 유속 1 mL/min으로 10 mL씩 분취하여 총당의 경우 phenol-sulfuric acid 방법 (18)으로, uronic acid의 경우 Cesaretti 등(19)의 방법으로 측정한 후 용출 양상에 따라 획분을 수집하고 증류수로 투석 및 농축한 다음 동결 건조하여 -70°C에 보관하면서 실험에 사용하였다.
총 단백질 함량은 Lowry 등(20)의 방법으로 측정하였으며 표준물질로는 bovine serum albumin(Sigma-Aldrich Co.)을 사용하였다.

성능/효과

5에 나타내었다. iNOS 및 COX-2의 발현량 증가를 측정한 결과, 정제물(5 ug/mL)을 처리한 APF- I 구간에서。-actin 대비 각각 84.27% 및 112.50%의 가장 높은 발현량을 보여 대조군과 유의적인 차이를 확인할 수 있었으며 LPS(0.1 ug/mL) 처리군보다 높은 발현량(114.51% 및 124.38%)을 나타내었다. 반면 AP는 iNOS 및 COX-2에서 각각 23.
94%로 나타났다. APF-I 및 APF-H에 대해 RAW 264.7 세포에 처리하여 독성을 평가한 결과 5 ug/mL 농도까지 유의적으로 세포사멸이 나타나지 않아 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다. Nitric oxide 생산량은 APF- I 이 5 ug/mL 농도에서 22.
26%로 낮은획분을 수집하였다는 연구 결과와 일치하는 경향을 나타내었으며, uronic acid 함량이 높은 다당류는 면역 활성 및 항 보체 활성 등을 갖는 것으로 알려져 있다(26). Hexosamine 은 AP에서 21.40%의 함량을 나타내었으며 정제 후 APF- I 및 APF-H에서 각각 16.62% 및 46.79%로 나타나 APF- n의 함량이 높았는데, 이는 Albano오} Mourao(27)의 오만둥이 껍질에서 크로마토그래피 한 다당 획분의 hexosamine 함량 분석 결과, 염 농도가 증가할수록 2.4~2.8%에서 14.8 ~27.0%로 증가하였다는 보고와 유사한 경향을 나타내었다. 총단백질 함량은 AP에서 33.
57%에 비해 저농도에서도 유의적으로 높은 생성량을 보여주었다. IL-6 또한 APF-I 5 Ug/mL 농도에서 100.1% 생성량 증가를 통해 LPS오} 유사한 함량을 나타내었으며, 1 ug/mL 농도에서 4.60%로 AP 50 ug/mL의 5.25%와 비교 시 유사한 함량을 나타내어 정제를 통해 면역 활성이 증가되었음을 확인하였다. Hong 등 (32)은 군소에서 분리한 glycosaminoglycan을 RAW 264.
7 세포에 처리하여 독성을 평가한 결과 5 ug/mL 농도까지 유의적으로 세포사멸이 나타나지 않아 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다. Nitric oxide 생산량은 APF- I 이 5 ug/mL 농도에서 22.23 um 함량을 나타내어 LPS 대비 73.48%로 타 구간에 비해 높은 생성량을 나타내었으며, cytokine 생성량(TNF-a 및 IL-6) 또한 APF-I 5 ug/ mL 농도에서 각각 LPS 대비 104%, 100.1%를 나타내어 LPS와 유사한 생성량을 나타내었다. Polymerase chain reaction을 통한 면역 관련 유전자 발현 분석 결과, iNOS, COX-2, TNF-a, IL-6에서 APF-I 구간에서 LPS 처리 군보다 높은 발현량을 나타내어 면역증강을 목적으로 한 기능성 식품 개발에 활용 가능하다고 사료된다.
03%의 함량을 나타내어 APF-I이 AP에 비해 2배 이상 높은 함량을 보여주었다. Uronic acid 함량은 APF- I에서 47.53%로 가장 높았으며 APF-H 및 AP에서 각각 15.87% 및 8.75%로 분석되어 APF-I 구간이 가장 높게 나타났다. 이는 Koo 등(25)의 톳과 모자반 fucoidan의 크로마토그래피 획분에서 염 농도가 증가할수록 uronic acid 함량이 6.
tokine 분비능은 0.5~5 ug/mL 농도에서 유의적인 생성량 증가를 나타내었으며, 그중 TNF-a는 APF-I 5 ug/mL 농도에서 LPS(0.1 ug/mL) 대비 104.4%의 생성량을 나타내어 AP 50 ug/mL 농도의 77.57%에 비해 저농도에서도 유의적으로 높은 생성량을 보여주었다. IL-6 또한 APF-I 5 Ug/mL 농도에서 100.
건조된 조다 당류를 DEAE-sepharose CL-6B를이용하여 크로마토그래피한 후 총당 및 uronic acid 함량을 분석한 결과, 증류수로 용출되는 비흡착 획분(APF-I, fraction No. 11~17)과 흡착된 후 NaCl 용액에 의해 용출되는 획분(APF-H, fraction No. 22~37)을 얻었다. 정제된 APF-I 및 APF-H의 이화학적 특성으로 총당 함량은 각각 66.
3에 나타내었다. 대조군에 비하여 APF-I 및 APF-n 1 ug/mL의 농도에서 각각 7.96 및 7.33 uM로 유의적으로 NO 생성량이 증가하였으며, APF-I 5 ug/mL 농도에서 22.23 uM의 함량을 나타내어 LPS(0.1 ug/mL) 대비 73.48%로 타 구간에 비해 가장 높은 생성량을 나타내었다. 이는 AP 50 ug/mL (11.
65%로 낮은 발현량을 보여 조다 당류 추출물에 비해 다당류 정제물에서 유전자 발현이 강하게 나타남을 확인하였다. 또한 cytokine 생성량을 확인하기 위한 TNF-a 및 IL-6 mRNA 발현량을 확인한 결과 iNOS 및 COX-2의 결과와 유사하게 APF-I 구간에서 대조군(56.75% 및 5.56%)과 AP(73.73% 및 11.80%)에 비해 밴드의 발현이 현저히 증가하여(110.13% 및 116.13%), cytokine 생성량과 일치하는 경향을 나타내었다. Na 등(35)은 매생이 유래 정제 다 당의 면역 관련 유전자 발현에서 정제 다당 5~10 ug/mL 처리 시양성대조군으로 사용된 LPS와 유사한 발현량을 나타내었으며, Chae 등(36)은 별불가사리 추출물의 생쥐 비장 면역세포 활성화 효과에서 1, 000 ug/mL 농도에서 양성대조군으로 사용된 LPS와 유사한 발현량을 나타냄에 따라 대식세포의 활성 증진에 기인한다고 보고하였다.
38%)을 나타내었다. 반면 AP는 iNOS 및 COX-2에서 각각 23.80% 및 26.65%로 낮은 발현량을 보여 조다 당류 추출물에 비해 다당류 정제물에서 유전자 발현이 강하게 나타남을 확인하였다. 또한 cytokine 생성량을 확인하기 위한 TNF-a 및 IL-6 mRNA 발현량을 확인한 결과 iNOS 및 COX-2의 결과와 유사하게 APF-I 구간에서 대조군(56.
48%로 타 구간에 비해 가장 높은 생성량을 나타내었다. 이는 AP 50 ug/mL (11.76 uM)와 비교 시 정제를 통해 1/10의 저농도에서 NO 생성량이 크게 증가함을 확인하였다. Jung 등(29)의 함초조다당 추출물을 대식세포에 농도별로 처리한 결과 50 u g/mL 농도에서 3.
22~37)을 얻었다. 정제된 APF-I 및 APF-H의 이화학적 특성으로 총당 함량은 각각 66.62%, 27.03%, uronic acid 함량은 47.53%, 15.87%, hexosamine 함량은 16.62%, 46.79% 및 단백질 함량은 2.43%, 4.94%로 나타났다. APF-I 및 APF-H에 대해 RAW 264.
0%로 증가하였다는 보고와 유사한 경향을 나타내었다. 총단백질 함량은 AP에서 33.19% 함유하고 있었으나, 정제 후 각각 2.43% 및 4.94%로 감소함을 확인하였다.
43%(APF-n)였다. 총당 함량은 APF- I에서 66.62%로 가장 높은 함량을 나타내었으며, AP 및 APF-H에서 각각 27.53% 및 27.03%의 함량을 나타내어 APF-I이 AP에 비해 2배 이상 높은 함량을 보여주었다. Uronic acid 함량은 APF- I에서 47.

후속연구

1%를 나타내어 LPS와 유사한 생성량을 나타내었다. Polymerase chain reaction을 통한 면역 관련 유전자 발현 분석 결과, iNOS, COX-2, TNF-a, IL-6에서 APF-I 구간에서 LPS 처리 군보다 높은 발현량을 나타내어 면역증강을 목적으로 한 기능성 식품 개발에 활용 가능하다고 사료된다.
19 uM을 생성하여 본 연구 결과에서 우수한 NO 생성량을 나타냄을 확인하였으며, Park 등(17)의 우렁쉥이 껍질 조다 당 추출물의 면역 활성 연구에서 대식세포에 시료를 처리한 결과 농도가 증가함에 따라 NO 생성량이 증가하였다는 결과와 유사한 경향을 보였다. 생체는 외부로부터 이물질이 침입하게 되면 자기방어를 위해 대식세포가 활성화되어 탐식작용 및 다양한 면역증강물질을 생성하게 되는데(30), 본 연구에서는 저농도에서도 높은 NO 생성 능을 나타내어 면역세포 자극을 통한 외부 물질 침입 등의 감염에 대한 1차 방어를 통해 면역반응이 일어나는 초기의 생체 방어에 유리한 작용을 할 수 있을 것으로 사료된다.
Na 등(35)은 매생이 유래 정제 다 당의 면역 관련 유전자 발현에서 정제 다당 5~10 ug/mL 처리 시양성대조군으로 사용된 LPS와 유사한 발현량을 나타내었으며, Chae 등(36)은 별불가사리 추출물의 생쥐 비장 면역세포 활성화 효과에서 1, 000 ug/mL 농도에서 양성대조군으로 사용된 LPS와 유사한 발현량을 나타냄에 따라 대식세포의 활성 증진에 기인한다고 보고하였다. 이를 통해 다 당류 정제 물의 면역 활성이 조다 당류 추출물에 비해 유의적으로 높은 발현을 나타냄을 확인하였으며 우렁쉥이 껍질의 효용 가치 증대를 통한 다양한 기능성 식품 소재로의 활용으로 폐자원 이용 증대와 해역의 오염 및 여러 문제점을 감소시킬 수 있을 것으로 사료된다.
TNF-a는 인체에 침입한 병원체에 대한 숙주의 방어에 관여하고 또한 IL-1, IL-6, IFNs와같은 cytokine들의 분비를 유도함으로써 인체의 면역반응을 조절한다고 알려져 있으며(33), IL-6는 T cell과 대식세포에서 분비되는 cytokine으로 외부 침입 인자에 의한 인체감염 시 면역반응을 촉진시키는 역할을 한다. 특히 IL-6오} 같은 pro-inflammatory cytokine의 분비는 감염에 의한 숙주의 생존 및 손상된 조직의 복구에 필수적이라고 알려져있어(34), 조다당류 정제 물 처리에 의한 TNF-a 및 IL-6의 생성량이 증가함에 따라 질병 발생 시 면역능을 조절하는 중요한 내인성 인자 증가로 인한 암, 천식 및 류마티스 관절염 등의 예방 효과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다.

참고문헌 (36)

Yamada H. 1992. Chemical and pharmacological studies on efficacy of Japanese and Chinese herbal medicines. Kitasato Arch Exp Med 65: 159-180.
Scalbert A, Manach C, Morand C, Remesy C, Jimenez L. 2005. Dietary polyphenols and the prevention of diseases. Crit Rev Food Sci Nutr 45: 287-306.

상세보기
Nakachi K, Matsuyama S, Miyake S, Suganuma M, Imai K. 2000. Preventive effects of drinking green tea on cancer and cardiovascular disease: epidemiological evidence for multiple targeting prevention. Biofactors 13: 49-54.

상세보기
Belardelli F. 1995. Role of interferons and other cytokines in the regulation of the immune response. Apmis 103: 161-179.

상세보기
Liu YJ. 2001. Dendritic cell subsets and lineages, and their functions in innate and adaptive immunity. Cell 106: 259-262.

상세보기
Salazar-Mather TP, Hokeness KL. 2003. Calling in the troops: regulation of inflammatory cell trafficking through innatecytokine/chemokine networks. Viral Immunol 16: 291-306.

상세보기
Flurkey WH. 1991. Identification of tyrosinase in mushrooms by isoelectric focusing. J Food Sci 56: 93-95.

상세보기
Jung DW, Park SI. 2005. Effect of green tea power on the growth inhibition of oral bacteria in yoghurt. Korean J Food Sci Ani Resour 25: 500-506.
Byun MW. 2013. Immunomodulatory activities of apple seed extracts on macrophage. J Korean Soc Food Sci Nutr 42: 1513-1517.

원문보기 상세보기
Cho DM, Bae KJ, Choi GH, Lee JW. 2011. The market analysis and perspectives of polysaccharide in Japan. J Chitin Chitosan 16: 157-163.
Lee SJ, Ha WH, Choi, HJ, Cho SY, Choi JW. 2010. Antihyperlipidemic and antidiabetic activities of the ascidian tunic in Sprague-Dawley rats. Kor J Fish Aquat Sci 43: 567-572.
Kang IS, Youn HS, Park JY, Chun BS. 2006. Extraction of $\beta$ -carotene from Ascidian tunic(Halocynthia roretzi) using supercritical carbon dioxide and co-solvent. Korean J Biotechnol Bioeng 21: 194-198.
Pavao MS, Albano RM, Lawson AM, Mourao PA. 1989. Structural heterogeneity among unique sulfated-L-galactans from different species of ascidians (tunicate). J Biol Chem 264: 9972-9979.
Hong BI, Jung BC, Jung WJ, Ruck JH, Choi BD, Lee KH. 2002. Utilization of pigments and tunic components of ascidian as an improved feed aids for aquaculture: 3. Functional properties of sulfated polysaccharides from ascidian (Halocynthia roretzi) tunic. J Korean Fish Soc 35: 671-675.
Lee KH, Choi BD, Hong BI, Jung BC, Ruck JH, Jung WJ. 1998. Functional properties of sulfated polysaccharides in ascidian (Halocynthia roretzi) tunic. J Korean Fish Soc 31: 447-451.
Jeong SH. 2003. Characterization of glycosaminoglycans from the ascidian tunic. MS Thesis. Gyeongsang National University, Jinju, Korea. p 1-46.
Park SH, Jeong SB, Choi BD. 2013. Immuno- and anti-cancer activities of Halocynthia roretzi tunic extracts on cells. J Agric Life Sci 47: 163-170.
Saha AK, Brewer CF. 1994. Determination of the concentrations of oligosaccharides, complex type carbohydrates, and glycoproteins using the phenol-sulfuric acid method. Carbohydr Res 254: 157-167.

상세보기
Cesaretti M, Luppi E, Maccari F, Volpi N. 2003. A 96-well assay for uronic acid carbazole reaction. Carbohydr Polym 54: 59-61.

상세보기
Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193: 265-275.
Blix G. 1948. The determination of hexosamines according to Elson and Morgan. Acta Chem Scand 2: 467-473.
Pavao MS, Mourao PA, Mulloy B, Tollefsen DM. 1995. A unique dermatan sulfate-like glycosaminoglycan from ascidian: Its structure and the effect of its unusual sulfation pattern on anticoagulant activity. J Biol Chem 270: 31027-31036.

상세보기
Baginski T, Hirohashi N, Hoshi M. 1999. Sulfated O-linked glycans of the vitelline coat as ligands in gamete interaction in the ascidian, Halocynthia roretzi. Dev Growth Differ 41: 357-364.

상세보기
Yu KW, Kim YS, Shin KS, Kim JM, Suh HJ. 2005. Macrophage-stimulating activity of exo-biopolymer from cultured rice bran with Monascus pilosus. Appl Biochem Biotechnol 126: 35-48.

상세보기
Koo JG, Jo KS, Do JR, Park JH, Yang CB. 1995. Chemical properties of fucoidans from Hizikia fusiformis and Sargassum fulvellum. J Korean Fish Soc 28: 659-666.
Kumar V, Nagar S, Tripathi YC. 2014. Do assorted approaches aid in estimation of uronic acids? Case studies on Tinospora sinensis polysaccharides. Int J Biol Macromol 70: 360-363.

상세보기
Albano RM, Mourao PA. 1986. Isolation, fractionation, and preliminary characterization of a novel class of sulfated glycans from the tunic of Styela plicata (Chordata Tunicata). J Biol Chem 261: 758-765.
Ryu HS, Kim HS. 2006. Effect of Zingiber officinale and Hizikia fusiforme water extracts on NO production in macrophage of mice. Korean J Food & Nutr 19: 327-331.
Jung SH, Park KU, Kim JY, Park CK, Choi KS, Seo KI. 2009. Biological activities of crude polysaccharides and crude saponins from Salicornia herbacea. Korean J Food Preserv 1: 109-114.
Seo SY, Pang J, Li R, Kwon J, Ahn MS, Eun JS. 2009. Effects of the combined extracts of Glycine max Merr. and Glycyrrhiza uralensis on the activity of murine splenocytes and macrophages. Korean J Oriental Physiology & Pathology 23: 1385-1391.
Starr R, Willson TA, Viney EM, Murray LJ, Rayner JR, Jenkins BJ, Gonda TJ, Alexander WS, Metcalf D, Nicola NA, Hilton DJ. 1997. A family of cytokine-inducible inhibitors of signalling. Nature 387: 917-921.

상세보기
Hong Y, Park S, Yoon BY, Choi BD, Choi YJ. 2011. Screen of functional activity of polysaccharide and glycosaminoglycan from sea hare (Aplysia kurodai) by cell line. J Korean Soc Food Sci Nutr 40: 14-19.

원문보기 상세보기
Jeong HJ, Chung HS, An HJ, Seo SW, Kim TG, Won JH, Shin JY, Ahn KS, Kim HM. 2004. The immune-enhancing effect of the herbal combination Bouum-Myunyuk-Dan. Biol Pharm Bull 27: 29-33.

상세보기
Ohta Y, Lee JB, Hayashi K, Fujita A, Park DK, Hayashi T. 2007. In vivo anti-influenza virus activity of an immunomodulatory acidic polysaccharide isolated from Cordyceps militaris grown on germinated soybeans. J Agric Food Chem 55: 10194-10199.

상세보기
Na YS, Kim WJ, Kim SM, Park JK, Lee SM, Kim SO, Synytsya A, Park YI. 2010. Purification, characterization and immunostimulating activity of water-soluble polysaccharide isolated from Capsosiphon fulvescens. Int Immunopharmacol 10: 364-370.

상세보기
Chae SY, Kim MJ, Kim DS, Park JE, Jo SK, Yee ST. 2007. Effect of Asterina pectinifera extracts on the activation of immune cells. J Korean Soc Food Sci Nutr 36: 269-275.

원문보기 상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증