Objectives : The extract of Sagunja-tang has been traditionally used for restorative treatment of constitutional weakness, vascular and immune disorder, and nervous disease in Oriental country. This study investigated the regulatory effects of Sagunja-tang on the expression, production, and activity...
Objectives : The extract of Sagunja-tang has been traditionally used for restorative treatment of constitutional weakness, vascular and immune disorder, and nervous disease in Oriental country. This study investigated the regulatory effects of Sagunja-tang on the expression, production, and activity of immune mediators.Methods : In this study, the extract of Sagunja-tang was prepared by extracting with distilled water at 100$^{\circ}C$ for 2.5h. The extract was freeze-dried following filtration through 0.45${{\mu}m}$ filter. The extract was dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS) and filtered again through 0.45${{\mu}m}$ filter before use. The level of nitrite, an oxidative product of nitric oxide(NO) was measured in the culture medium by the Griess reaction. The levels of prostaglandin E2(PGE2), Th1 cytokines (IFN-${\gamma}$, IL-2) and Th2 cytokines(IL-4, IL-5, IL-13) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay and the protein levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression were determined by Western blot analysis. Also examined the effects of the extract on T-cell proliferation and cytotoxic activity of natural killer cells.Results : In this investigation, Production levels of Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-13) was inhibited in a dose dependent manner by treatment with the extract. I also found that the extract increased T-cell proliferation and cytotoxic activity of natural killer cells in a dose-dependent manner.Conculsions : These results suggest that the water extract of Sagunja-tang may be useful for a therapeutic drug against a sickly constitution and immune diseases, probably by regulating the production of immune mediators.
Objectives : The extract of Sagunja-tang has been traditionally used for restorative treatment of constitutional weakness, vascular and immune disorder, and nervous disease in Oriental country. This study investigated the regulatory effects of Sagunja-tang on the expression, production, and activity of immune mediators.Methods : In this study, the extract of Sagunja-tang was prepared by extracting with distilled water at 100$^{\circ}C$ for 2.5h. The extract was freeze-dried following filtration through 0.45${{\mu}m}$ filter. The extract was dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS) and filtered again through 0.45${{\mu}m}$ filter before use. The level of nitrite, an oxidative product of nitric oxide(NO) was measured in the culture medium by the Griess reaction. The levels of prostaglandin E2(PGE2), Th1 cytokines (IFN-${\gamma}$, IL-2) and Th2 cytokines(IL-4, IL-5, IL-13) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay and the protein levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression were determined by Western blot analysis. Also examined the effects of the extract on T-cell proliferation and cytotoxic activity of natural killer cells.Results : In this investigation, Production levels of Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-13) was inhibited in a dose dependent manner by treatment with the extract. I also found that the extract increased T-cell proliferation and cytotoxic activity of natural killer cells in a dose-dependent manner.Conculsions : These results suggest that the water extract of Sagunja-tang may be useful for a therapeutic drug against a sickly constitution and immune diseases, probably by regulating the production of immune mediators.
이러한 觀點에서 본다면 四君子湯이 免疫機能 調節에 밀접한 聯關性이 있음을 시사하는 바 본 實驗을 시행하였다. 지금까지의 四君子湯의 實驗的 硏究로는 항산화작용8,9), 고지혈증10), 악성종양에 대한 항암효과11,12), 기아회복13), 성장14), 근육피로회복15), 항혈전16), 항스트레스17), 血壓 및 體溫18), 진통, 소염과 항경련19) 등에 대한 효과가 보고되고 있으며, 免疫과 관련하여 生體活性20), prednisolone으로 유발된 免疫低下에 대한 면역증진21), 면역반응 및 자연살해세포(natural killercell, NK)의 활성22)에 대한 보고가 있었으나 구체적인 免疫調節作用에 대한 연구는 아직 이루어지지 않고 있는 실정이다.
이에 氣虛의 基本方인 四君子湯에 대한 免疫調節作用 效果를 검증하기 위하여 생쥐의 면역세포를 대상으로 nitric oxide(NO), prostaglandin E2(PGE2), cyclooxygenase-2(COX-2), Th1 cytokines(IFN-γ, IL-2)과 Th2 cytokines(IL-4, IL-5, IL-13) 등을 조사하였으며, 면역세포의 증식과 자연살해세포의 활성을 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
또한 탐식세포의 탐식능에 미치는 영향을 알아보기 위해서 복강내 대식세포를 LPS로 자극하여 NO와 PGE2의 생성과 이들을 조절하는 iNOS와 COX-2의 발현을 조사하였다. PHA로 자극된 비장세포에서 Th1과 Th2을 조사하였고, 비장세포의 증식능력을 조사한 후에 四君子湯 추출물을 생쥐에 1주일간 경구 투여하여 자연살해세포의 살해능을 측정하였다. 그 결과 유의한 결과를 도출할 수 있었다.
四君子湯 추출물이 LPS가 처리된 또는 처리되지 않은 복강대식세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보았다. 복강대식세포(5×105/㎖)를 RPMI 1640(1% P/S, 10% FBS) 배지를 사용하여 세포 부유액을 만든 다음 여러 가지 농도의 四君子湯 추출물을 주입하고 24시간 동안 배양한 후 세포 생존율을 조사한 결과 Fig.
四君子湯 추출물이 자연살해세포의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해서 7주령의 Balb/c계 생쥐를 대상으로 1주간 각각의 藥物을 100㎎/㎏ 농도로 투여하였다
藥物의 제조는 四君子湯 處方 藥材인 人蔘, 白朮, 白茯笭과 甘草를 각각 5g씩 정량하면 1첩에 20g이 되고, 총 20첩인 400g을 한약추출기(대웅약탕기, SK-1600))에 주입해서, 4,000㎖ 증류수를 첨가하여 100℃에서 2시간 30분 동안 煎湯하였다
건강한 수컷 생쥐를 대상으로 에테르에 마취시킨 다음 후경골탈추법으로 즉사시킨 후 비장세포를 분리하였다
건강한 수컷 생쥐에 Brewer's thioglycollate broth를 마리당 2㎖씩 복강 내로 주사기를 이용하여 주입하고 3일 후 생쥐를 후경골탈추법으로 즉사시킨 다음 heparin(5U/㎖)이 첨가된 HBSS 10㎖를 복강에 주입하고 복강을 장 마사지 하였다. 마사지 후 26게이지 10㎖용 주사기를 이용하여 복강으로 유입된 세포를 얻은 후 2회 원심세척 하였다.
따라서 본 硏究는 正氣를 補益하고 虛弱을 治療하는 補益藥 중 四君子湯의 효과를 조사하기 위해서 생쥐의 복강대식세포를 대상으로 먼저 이들 藥物이 세포독성에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 탐식세포의 탐식능에 미치는 영향을 알아보기 위해서 복강내 대식세포를 LPS로 자극하여 NO와 PGE2의 생성과 이들을 조절하는 iNOS와 COX-2의 발현을 조사하였다.
따라서 본 硏究는 正氣를 補益하고 虛弱을 治療하는 補益藥 중 四君子湯의 효과를 조사하기 위해서 생쥐의 복강대식세포를 대상으로 먼저 이들 藥物이 세포독성에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 탐식세포의 탐식능에 미치는 영향을 알아보기 위해서 복강내 대식세포를 LPS로 자극하여 NO와 PGE2의 생성과 이들을 조절하는 iNOS와 COX-2의 발현을 조사하였다. PHA로 자극된 비장세포에서 Th1과 Th2을 조사하였고, 비장세포의 증식능력을 조사한 후에 四君子湯 추출물을 생쥐에 1주일간 경구 투여하여 자연살해세포의 살해능을 측정하였다.
人蔘, 白朮, 白茯笭, 甘草로 配伍된 四君子湯은 傳統的으로 氣力의 衰弱에 따른 元氣回復, 循環器 疾患 및 免疫疾患 그리고 神經疾患에 활용되어 왔으나, 면역 매개물의 생성 및 발현에 미치는 영향에 대한 四君子湯의 구체적인 연구 조사가 없는 실정이다. 본 연구는 四君子湯의 免疫機能 調節과의 聯關性을 究明하기 위한 硏究의 일환으로 四君子湯에 대한 免疫調節作用 效果를 검증하기 위하여 생쥐의 면역세포를 대상으로 NO, PGE2, COX-2, IFN-γ와 IL-2 등 Th1과 IL-4, IL-5, IL-13 등 Th2을 조사하였으며, 면역세포의 증식과 자연살해세포의 활성을 조사하여 아래와 같은 결과를 얻었다.
COX는 arachidonic acid에서 prostanoid로 전환시키는 효소로 알려졌는데, COX-1과 COX-2에 의해 합성된 적은양의 prostanoid는 생체의 항상성 유지에 필요하지만, 과량의 prostanoid는 NO와 비슷하게 염증반응을 가속화시킨다고 알려졌다. 본 연구에서도 四君子湯 추출물이 PGE2 생성에 중요한 COX-2 활성에 미치는 효과를 Cayman (USA)사의 COX activity assay kit를 이용하여 조사하였다.
무균환경에서 사육된 6주령의 수컷 Balb/c계 생쥐를 중앙실험동물(주)(서울시 서초구)에서 구입하였고, 사료와 물을 무제한 공급하면서 1주일간 순화시킨 후 실험에 사용하였다
실험에 사용한 人蔘은 6년 근으로 충남 금산, 白朮은 경북 의성, 白茯笭은 충남 보령 그리고 甘草는 중국 양외1호로 광주의 한약사랑(주)에서 각각 구입하였으며, 圓光大學校 韓醫科大學 方劑學敎室에서 형태학적 및 화학적으로 동정하여 사용하였으며, 증거표본은 방제학 교실에 보관 중에 있다
데이터처리
결과는 평균값±표준편차로 표현했다
통계 분석은 Student's t-test를 이용했다.
이론/모형
LDH leakage 분석은 약물이 면역세포의 독성에 미치는 영향을 알아보기 위해서 수행하였다. 복강대식세포의 생존율은 여러 농도의 추출물처리 또는 추출물과 LPS(1㎍/㎖)을 동시에 처리하여 24시간 배양후 밀집세포의 붕괴에 따라 유리된 LDH의 활성을 측정하였다.
PGE2의 측정방법은 R&D system Inc.(Minneopolis, USA)가 제시한 방법에 준하여 ELISA법으로 정량하였고, COX의 정량은 세포를 용해한 다음 단백질을 블레드포드 방법에 따라 정량하고 COX activity assay kit (Cyman Chemical, USA)을 이용하여 Cyman사에서 제공하는 방법에 준하여 COX의 활성을 측정하였다.
복강대식세포의 생존율은 여러 농도의 추출물 처리 또는 추출물과 LPS(1㎍/㎖)을 동시에 처리하여 24시간 배양 후 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT 환원을 바탕으로 MTT 분석법으로 측정했다. 요약하면, RPMI 1640 배지에서 5×105/㎖의 밀도로 세포를 접종하여 3시간 후에 여러 가지 농도로 藥物을 처리하였다.
측정방법은 각각의 물에 대한 R&D system Inc.(Minneopolis, USA)가 제시한 방법에 준하여 ELISA법으로 정량하였다.
성능/효과
저농도(25㎍/㎖)에서 NO 생성을 증가시켰고, 50-200㎍/㎖ 농도에서는 LPS에 의한 NO 생성을 억제하였다. 25-100㎍/㎖ 농도의 추출물은 PGE2 생성과 COX-2 활성을 유도한 반면, 200㎍/㎖에서는 억제하는 효과가 있었으며, iNOS와 COX-2의 발현은 이들의 결과와 유사했다. PHA로 활성화된 비장세포에서 생성되는 Th1(IFN-γ와 IL-2)의 생성을 증가시키는 효과가 있었다.
2). LPS로 자극된 탐식세포의 활성을 조사한 결과 저농도의 四君子湯 추출물은 NO와 PGE2의 생성을 저농도에서는 증가시키고 고농도에서는 억제시키는 조절 효과가 있었다. 이들의 결과는 iNOS와 COX-2의 발현을 조절하는 四君子湯 추출물의 효과에 기인된다는 사실을 확인하였다(Fig.
MTT와 LDH 측정을 통하여 四君子湯은 대식세포에 독성이 없음을 확인하였고, LPS에 의해 유도된 대식세포 손상을 보호하는 효과가 있음을 확인하였다. 저농도(25㎍/㎖)에서 NO 생성을 증가시켰고, 50-200㎍/㎖ 농도에서는 LPS에 의한 NO 생성을 억제하였다.
MTT와 배지의 LDH 활성을 조사한 결과 본 연구에 사용된 四君子湯 추출물의 모든 농도(25-200㎍/㎖)에서 세포독성이 없었고, 오히려 LPS에 의한 세포독성을 억제하는 효과가 있었다(Fig. 2).
25-100㎍/㎖ 농도의 추출물은 PGE2 생성과 COX-2 활성을 유도한 반면, 200㎍/㎖에서는 억제하는 효과가 있었으며, iNOS와 COX-2의 발현은 이들의 결과와 유사했다. PHA로 활성화된 비장세포에서 생성되는 Th1(IFN-γ와 IL-2)의 생성을 증가시키는 효과가 있었다. 반면, Th2(IL-4, IL-5와 IL-13)의 생성은 추출물의 농도에 의존하여 억제하는 효과가 있었고, T세포의 증식과 자연살해세포의 살해능은 추출물의 농도에 의존해서 증가하는 효과가 있었다.
13). 따라서 四君子湯 추출물은 T세포 증식을 통한 면역 활성 조절뿐만 아니라 생체에서 자연살해세포의 살해능을 증강시키는 면역 강화 작용이 있음을 알 수 있었다.
이상의 결과에서 四君子湯 추출물은 면역세포의 活性을 調節할 수 있는 效果를 나타내었다. 따라서 四君子湯은 補氣藥으로 免疫調節機能이 低下된 각종 人體疾患에 활용할 수 있는 方劑라 思料된다.
2와 같이 어떠한 藥物이 처리되지 않은 대조군의 세포 LDH 유리량 0%로 나타냈을 때 LPS로 자극했을 경우 11%로 나타났으나, 四君子湯 추출물을 25-200㎍/㎖의 농도로 처리했을 때 농도에 의존적으로 LDH 유리량이 감소되었다. 따라서 본 연구에서 사용된 모든 농도의 四君子湯 추출물은 독성이 없었고, 오히려 LPS로부터 세포독성을 보호하는 효과가 있었다.
PHA로 활성화된 비장세포에서 생성되는 Th1(IFN-γ와 IL-2)의 생성을 증가시키는 효과가 있었다. 반면, Th2(IL-4, IL-5와 IL-13)의 생성은 추출물의 농도에 의존하여 억제하는 효과가 있었고, T세포의 증식과 자연살해세포의 살해능은 추출물의 농도에 의존해서 증가하는 효과가 있었다.
IL-4는 IL-5와 IL-13의 작용에 의해 IgE의 생산에 직접적인 영향을 주는 대표적인 Th2으로39), 이들 사이토카인이 생체 내에서 과량 생산되면, 아토피 피부염(atopic dermatitis), 천식(asthma)을 비롯한 알러지성 비염(allergic rhinitis)을 유발할 수 있는 주요 요인으로 알려져 있다40). 본 연구의 결과 四君子湯 추출물은 IL-4는 IL-5와 IL-13과 같은 Th2의 생성을 효과적으로 억제하였다(Fig. 9-11).
이상의 결과에서 四君子湯 추출물은 면역세포의 活性을 調節할 수 있는 效果를 나타내었다. 따라서 四君子湯은 補氣藥으로 免疫調節機能이 低下된 각종 人體疾患에 활용할 수 있는 方劑라 思料된다.
이상의 실험결과 四君子湯 추출물은 세포독성이 없고 오히려 손상된 세포를 보호할 수 있는 효과와 NO와 PGE2 등 염증 매개물을 조절할 수 있었다. 뿐만 아니라 Th1, Th2 생성을 조절할 수 있는 면역효과가 있음을 보여주었다.
MTT와 LDH 측정을 통하여 四君子湯은 대식세포에 독성이 없음을 확인하였고, LPS에 의해 유도된 대식세포 손상을 보호하는 효과가 있음을 확인하였다. 저농도(25㎍/㎖)에서 NO 생성을 증가시켰고, 50-200㎍/㎖ 농도에서는 LPS에 의한 NO 생성을 억제하였다. 25-100㎍/㎖ 농도의 추출물은 PGE2 생성과 COX-2 활성을 유도한 반면, 200㎍/㎖에서는 억제하는 효과가 있었으며, iNOS와 COX-2의 발현은 이들의 결과와 유사했다.
후속연구
뿐만 아니라 Th1, Th2 생성을 조절할 수 있는 면역효과가 있음을 보여주었다. 더욱이 T세포의 증식과 자연살해세포의 활성을 조절할 수 있는 효능이 확인되어 免疫調節機能이 低下된 각종 人體 疾患의 治療劑로 활용할 수 있는 方劑라고 생각되며 그 기전에 대한 연구가 더 필요할 것으로 사료된다. 따라서 이러한 결과를 韓醫學的인 관점으로 볼 때 人蔘, 白朮, 白茯笭, 甘草로 配伍된 四君子湯이 免疫調節 作用에 效果的임을 나타내고 있어, 方劑學的 君臣佐使 理論에 입각한 處方 構成이 매우 중요함을 입증하여 주고 있으며, 韓藥을 이용한 새로운 치료제 개발에 方劑學的 處方 構成理論 도입이 필요함을 시사하고 있다.
더욱이 T세포의 증식과 자연살해세포의 활성을 조절할 수 있는 효능이 확인되어 免疫調節機能이 低下된 각종 人體 疾患의 治療劑로 활용할 수 있는 方劑라고 생각되며 그 기전에 대한 연구가 더 필요할 것으로 사료된다. 따라서 이러한 결과를 韓醫學的인 관점으로 볼 때 人蔘, 白朮, 白茯笭, 甘草로 配伍된 四君子湯이 免疫調節 作用에 效果的임을 나타내고 있어, 方劑學的 君臣佐使 理論에 입각한 處方 構成이 매우 중요함을 입증하여 주고 있으며, 韓藥을 이용한 새로운 치료제 개발에 方劑學的 處方 構成理論 도입이 필요함을 시사하고 있다. 앞으로 in vitro뿐만 아니라 in vivo 실험에 方劑學的 개념을 이용한 處方 構成 理論인 君臣佐使論을 활용한다면 보다 效果的이고 副作用이 없으면서, 實用性이 높은 天然物을 이용한 治療劑 開發에 대한 많은 도움이 될 것으로 생각된다.
따라서 이러한 결과를 韓醫學的인 관점으로 볼 때 人蔘, 白朮, 白茯笭, 甘草로 配伍된 四君子湯이 免疫調節 作用에 效果的임을 나타내고 있어, 方劑學的 君臣佐使 理論에 입각한 處方 構成이 매우 중요함을 입증하여 주고 있으며, 韓藥을 이용한 새로운 치료제 개발에 方劑學的 處方 構成理論 도입이 필요함을 시사하고 있다. 앞으로 in vitro뿐만 아니라 in vivo 실험에 方劑學的 개념을 이용한 處方 構成 理論인 君臣佐使論을 활용한다면 보다 效果的이고 副作用이 없으면서, 實用性이 높은 天然物을 이용한 治療劑 開發에 대한 많은 도움이 될 것으로 생각된다.
특정 藥物을 이용한 면역 활성을 조사하기 위해서는 탐식세포의 탐식능과 관련되고 염증 매개물질로 알려진 NO 및 PGE2의 생성에 미치는 영향뿐만 아니라 T세포의 활성 및 탐식세포의 활성과 관련된 Th1과 Th2의 생성에 작용하는 효과 그리고 T세포의 증식능과 자연살해세포의 살해능력을 조사해야 한다.
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