선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 3B)로 apoptosis가 현저하게 증가된 양상을보였으며, 서서히 농도의존적으로 apoptosis가 유발되는 A549 에 비하여 HepG2의 경우 저농도에서 early apoptosis가 매우활발히 유도되다가 고농도에서 상당히 많은 세포가 late apop- tosis로 전환되는 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 MEEA가 농도의존적으로 apoptosis의 유도를 증가시키는 효과를 보유하고 있음을 제시한다.
- anomala가 항암효과까지 보유할 수 있다는 가능성을제시한다[26]. 이에 본 연구에서는 E. anomala 메탄올 추출물의항암 활성을 확인하기 위하여 인체 폐암세포주인 A549 세포와 간암세포주인 HepG2 세포를 사용하여 세포독성 효과, 세포의 형태 관찰, 세포주기와 apoptosis의 변화 및 관련 단백질의 발현 경향을 분석하여 E. anomala 추출물이 암세포의 증식을 억제하고 apoptosis를 유도하는 현상을 확인하였다.
제안 방법
- A549 세포를 8-well의 cell culture chamber slide (SPL LIFE SCIENCES, Korea)에 2×104 cell로 분주하여 24시간 동안부착시키고 MEEA를 적정 농도별로 처리 후 48시간 동안 배양하였다. 각 well에 fixing solution (4% formaldehyde, 4% su- crose)을 분주 후 20분간 고정하고, permeabilizing solution (0.
- anomala 추출물은 해외 생물 소재 허브센터 (한국생명공학연구원)에서 구입(분양번호 FBM117-033) 하였다. E. anomala에 메탄올 용매를 가하여 45℃에서 15분간 초음파 분쇄 과정을 10회 반복하여 3일간 추출 후 여과, 농축, 건조과정을 거친 추출물로써(Methanol extracts of E. anomala, 이하 MEEA) 100 mg/ml의 농도로 dimethylsulfoxide (DMSO; Sigma, USA)에 용해시켜 4℃에 보관하고 세포에 처리 전 배지에 희석하여 사용하였다.
- MEEA 처리에 의한 A549와 HepG2의 형태학적 분석을 위하여 6-well plate에 1~2×105 cell을 각각 분주하고 24시간 뒤 MEEA를 적정 농도로 처리 후 48시간 동안 배양하였다. 그후 도립현미경(Axiovert 40C; Carl ZEISS, Germany)을 사용하여 200배의 배율로 관찰하였으며, Axio Vision program을 사용하여 촬영하였다.
- MEEA 처리에 의한 인체 폐암세포와 간암세포의 증식 억제효과가 세포주기의 변화에 따른 것인지 apoptosis 유도에 의한 것인지를 확인하기 위하여 flow cytometry를 이용한 세포주기 분석을 실시하였다. A549와 HepG2에 MEEA를 적정 농도로 48시간 처리 후 DNA에 결합하는 형광물질인 PI로 염색하여 확인한 결과, 항암활성과 관련된 G1, G2/M의 구간에서는 뚜렷한 변화가 관찰되지 않았으나 SubG1의 fluorescence peak가 고농도로 처리할수록 대조군과 비교하여 높아지는 현상을 관찰하였다.
- MEEA가 A549와 HepG2의 세포주기에 미치는 영향을 확인하기 위하여 CycleTEST™ PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, USA)로 세포주기를 분석하였다. 각 세포는 6-well plate에 1~2×105 cell로 분주하여 농도별로 48시간 처리 후 회수하였다.
- MEEA가 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여인체 폐섬유모세포주인 IMR-90, 폐암세포주인 A549 및 간암세포주인 HepG2에 다양한 농도의 MEEA를 처리하여 WST assay로 세포의 독성을 확인하였다. 그 결과, 정상세포에서는최대 19.
- MEEA가 인체 폐암세포와 간암세포의 apoptosis 유도과정을 확인하기 위하여 MEEA를 처리한 각 세포를 AnnexinV & Dead Cell Reagent로 염색 후 Cell Analyzer로 분석하였다. Apoptosis가 유발된 세포는 external membrane에서 phos- phatidylserine을 인지하므로 AnnexinV로 염색하고, mem- brane이 손상된 세포는 dead cell marker인 7-AAD로 염색하였다.
- MEEA의 처리로 세포의 apoptosis가 유발되었을 경우 특이적으로 생성되는 사멸체 및 핵의 응축 반응을 시각화하기 위하여 DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) 핵 염색을 수행하였다. A549 세포를 8-well의 cell culture chamber slide (SPL LIFE SCIENCES, Korea)에 2×104 cell로 분주하여 24시간 동안부착시키고 MEEA를 적정 농도별로 처리 후 48시간 동안 배양하였다.
- 5% agarose gel에 전기영동 하였다. genomic DNA 는 EtBr로 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.
- 각 세포에 농도별로 MEEA를 처리하고 48시간 배양하였으며 1X PBS로 세척 후 lysis buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1mM EGTA, 1% Triton X-100, 1 μg/ml leupeptin, 1 mM PMSF]를 첨가하여 세포를회수하였다. 회수된 세포는 4℃에서 20분 동안 반응 후 14, 000× g, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취하였다.
- 그후 도립현미경(Axiovert 40C; Carl ZEISS, Germany)을 사용하여 200배의 배율로 관찰하였으며, Axio Vision program을 사용하여 촬영하였다.
- 각 세포를 6-well plate에 1~2×105 cell로 분주 후 적절한 농도로 48시간 처리한 다음 1% FBS가 첨가된 1X PBS로 회수하였다. 농도별로 회수된 각세포에 Muse™ AnnexinV & Dead Cell Reagent를 1:1로 분주후 상온에서 어두운 조건으로 20분간 반응시키고 Muse™ Cell Analyzer (Millipore, USA)로 apoptosis가 유발된 세포비율을측정 및 분석하였다.
- 그 후 apoptosis와관련된 단백질을 인지하는 일차항체를 4℃에서 overnight 처리하였으며, 이차항체는 상온에서 30분간 반응시켰다. 반응이끝난 후 Enhanced Chemiluminoesence (ECL) Solution (Amersham Life Science Co., USA)를 membrane에 도포하고 Chemiluminescence Detection System (FluoChem® FC2, AlphaInnotech, USA)을 사용하여 분석하였다. 일차항체인 p53, Bax, caspase9, PARP, acitin과 이차항체 HRP-conjugated anti-rabbit, anti-goat, anti-mouse는 Santa Cruz Biotechnology (USA)에서 구입하였으며, p21, Bcl-2, caspase3, caspase8은 Cell Signaling Technology (USA)에서 구입하여사용하였다.
- 세포에서 apoptosis가 유발되는 경우 세포의 수축, 염색질응축, DNA 분절과 같은 전형적인 형태 변화와 생화학적인특징이 나타난다는 점을 착안하여, 우선 MEEA를 A549에 적정 농도로 48시간 처리 후 핵산에 특이적으로 결합하는 DAPI 염색을 통해 세포핵의 형태 변화를 관찰하였다[5, 13]. 그 결과, Fig.
- 세포의 apoptosis가 유도된 경우 DNA가 단편화 되는 현상을 관찰하기 위하여 MEEA가 48시간 처리된 A549에 lysis buffer [10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.5% SDS]를 처리하여 4℃에서 20분간 용해시켰다. 용해시킨 세포를 13, 000× g, 4℃에서 15분간 원심분리(Micro- fuge® 22R Centifuge; Beckman Coulter, USA) 후 상층액만취하여 0.
- 5% BSA)을 10분간 처리 후 2 μg/ml의 DAPI (Santa Cruz Biotechnology, USA) 용액을 첨가하여 암실에서 10분간 염색하였다. 염색을 위한 모든 단계는 상온에서 진행하였으며, 시약을 처리하고 반응시킨 후에는 각 단계마다 1X PBS로 3회의 세척 과정을 거쳤다. 염색이 끝난 후 slide holder를 제거하고 Fluoro-Gel with Anti-Fading Agent (Electron Microscopy Sciences, USA)로 mouting 후 형광현미경(Axio Scope.
- 염색을 위한 모든 단계는 상온에서 진행하였으며, 시약을 처리하고 반응시킨 후에는 각 단계마다 1X PBS로 3회의 세척 과정을 거쳤다. 염색이 끝난 후 slide holder를 제거하고 Fluoro-Gel with Anti-Fading Agent (Electron Microscopy Sciences, USA)로 mouting 후 형광현미경(Axio Scope. A1; Carl ZEISS, Germany)의 200배율로 관찰하였고, Axio Vision program을 사용하여 촬영하였다.
- 인체 폐암세포와 간암세포에 MEEA를 처리할 경우 농도 의존적으로 apoptosis가 유발되는 현상의 분자적 기전 분석을 위하여 apoptosis와 관련된 단백질의 발현 변화를 Western blot으로 확인하였다. 종양 억제 유전자로 알려진 p53이 활성화되면 p21 발현 증가를 통한 cell cycle arrest와 FAS, Bax 등 다양한 apoptosis와 관련된 단백질 발현의 촉진 및 caspase 의 활성을 유도하여 apoptotic cell death를 유발시킨다[25].
대상 데이터
- 모든 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC®, USA)으로부터 구입하였으며, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS)와 penicillin/streptomycin을 첨가하여 37℃ 배양기에서 5%의 CO2를 유지하면서 배양하였다.
- 본 실험에서 사용한 E. anomala 추출물은 해외 생물 소재 허브센터 (한국생명공학연구원)에서 구입(분양번호 FBM117-033) 하였다. E.
- 실험에 사용된 정상세포주로는 인체에서 유래한 폐섬유모세포인 IMR-90 (CCL-186™)이며, 암세포주로는 인체 폐암세포주인 A549 (CCL-185™)와 간암세포주인 HepG2 (HB-8065™)를사용하였다. 모든 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC®, USA)으로부터 구입하였으며, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS)와 penicillin/streptomycin을 첨가하여 37℃ 배양기에서 5%의 CO2를 유지하면서 배양하였다.
- , USA)를 membrane에 도포하고 Chemiluminescence Detection System (FluoChem® FC2, AlphaInnotech, USA)을 사용하여 분석하였다. 일차항체인 p53, Bax, caspase9, PARP, acitin과 이차항체 HRP-conjugated anti-rabbit, anti-goat, anti-mouse는 Santa Cruz Biotechnology (USA)에서 구입하였으며, p21, Bcl-2, caspase3, caspase8은 Cell Signaling Technology (USA)에서 구입하여사용하였다.
데이터처리
- 실험의 측정결과는 mean ± SD로 나타내었으며, 각 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 student's t test를 통해 p값이 0.05 미만(p-value<0.05)인 경우 유의성이 있는 것으로 평가하였다.
- 1X PBS로 세척한 후 RNase A를 실온에서 10분간 처리한 다음 propidium iodide (PI) 용액을 첨가하여 4℃에서 10분간 염색하였다. 염색된 세포는 Flow cytometry (Cell Lab Quanta SC; Beckman Coulter, USA)로 측정하였으며 결과는 WinMDI2.9를 사용하여 분석하였다.
- 48시간 뒤 WST 시약(Daeillab, Korea)이 포함된 배지로 교체 후 30분간 37℃ 배양기에서 반응시키고 microplate reader (Molecular Devices, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험을 하여 평균(mean)±표준편차(standard devia- tion, SD)로 나타내었으며, 본 결과를 바탕으로 이후 실험의 적정한 처리 농도를 결정하였다.
이론/모형
- MEEA가 암세포의 성장억제에 미치는 영향을 확인하기 위하여 WST (Water Soluble Tetrazolium salt) assay를 수행하였다. 세포를 24-well plate에 1~3×104 cell로 분주하여 24시간 동안 부착시킨 후 MEEA를 다양한 농도로 처리하였다.
- MEEA를 처리한 A549와 HepG2의 apoptosis에 관련된 단백질의 발현 양상을 확인하기 위하여 Western blot을 수행하였다. 각 세포에 농도별로 MEEA를 처리하고 48시간 배양하였으며 1X PBS로 세척 후 lysis buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.
- MEEA의 처리로 A549와 HepG2에서 유발되는 apoptosis 의 정량적인 분석을 위하여 Muse™ AnnexinV & Dead Cell Kit (Millipore, USA)를 사용하였으며, 실험은 Millipore에서제시한 방법에 따라 수행하였다. 각 세포를 6-well plate에 1~2×105 cell로 분주 후 적절한 농도로 48시간 처리한 다음 1% FBS가 첨가된 1X PBS로 회수하였다.
성능/효과
- 분석을 실시하였다. A549와 HepG2에 MEEA를 적정 농도로 48시간 처리 후 DNA에 결합하는 형광물질인 PI로 염색하여 확인한 결과, 항암활성과 관련된 G1, G2/M의 구간에서는 뚜렷한 변화가 관찰되지 않았으나 SubG1의 fluorescence peak가 고농도로 처리할수록 대조군과 비교하여 높아지는 현상을 관찰하였다. A549는 100 μg/ml의 농도를 처리한 시료에서 26.
- 통해 세포핵의 형태 변화를 관찰하였다[5, 13]. 그 결과, Fig. 4A에 표시된 바와 같이 MEEA 처리시 농도 의존적으로염색질이 응축되는 현상과 사멸체의 형성이 증가하였으며, 동시에 세포의 밀도가 감소하는 현상을 확인할 수 있었다. 또한농도별로 MEEA가 처리된 각 세포의 genomic DNA를 추출하여 분절현상의 발생 유무를 관찰한 결과, Fig.
- 세포의 독성을 확인하였다. 그 결과, 정상세포에서는최대 19.31%의 독성을 보였으나 폐암과 간암세포에서는 Fig. 1A에 제시한 바와 같이 상당한 독성을 띄며 농도의존적으로세포의 증식이 억제되는 양상을 보였다. 특히 200 μg/ml의최고농도에서 MEEA에 대한 감수성이 가장 높아 폐암세포에서는 80.
- 이 결과는 MEEA가 A549와 HepG2에서 p53의 발현과 Bcl-2 family의변화를 유도하여 caspase-3와 관련된 경로를 경유하는 in- trinsic apoptosis를 유발시킨다는 사실을 시사한다. 따라서 이러한 결과를 통하여 MEEA가 농도의존적으로 apoptosis의 유도를 증가시키는 효과를 보유하고 있고, 이것으로 인하여 인체 폐암세포와 간암세포의 증식을 억제시킬 수 있을 것이라판단된다.
- 4A에 표시된 바와 같이 MEEA 처리시 농도 의존적으로염색질이 응축되는 현상과 사멸체의 형성이 증가하였으며, 동시에 세포의 밀도가 감소하는 현상을 확인할 수 있었다. 또한농도별로 MEEA가 처리된 각 세포의 genomic DNA를 추출하여 분절현상의 발생 유무를 관찰한 결과, Fig. 4B와 같이 MEEA를 100 μg/ml의 농도로 처리한 세포에서 DNA 손상에의한 끌림현상이 발생하였다. 이상의 결과는 인체 폐암세포에서 MEEA 처리에 의한 세포증식의 억제 및 형태의 변화가 apoptosis의 유발과 밀접한 관계가 있음을 의미한다.
- 5A, B에서와 같이 pro-apoptotic 단백질인 Bax의 발현이 두 세포에서 모두 MEEA 처리에 의해 증가하였다. 반면에 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현량은 A549에서 약간 감소하였지만 HepG2에서는 큰 변화가 관찰되지 않았으며, 각 세포에서 procaspase-3, 8, 9와 PARP의 발현은 농도의존적으로 감소하였으나 cleaved caspase-3, 8, 9와 cleaved PARP에서는 발현이 증가하는 상반된 경향을 보였다. 이 결과는 MEEA가 A549와 HepG2에서 p53의 발현과 Bcl-2 family의변화를 유도하여 caspase-3와 관련된 경로를 경유하는 in- trinsic apoptosis를 유발시킨다는 사실을 시사한다.
- Apoptosis가 유발된 세포는 external membrane에서 phos- phatidylserine을 인지하므로 AnnexinV로 염색하고, mem- brane이 손상된 세포는 dead cell marker인 7-AAD로 염색하였다. 분석 결과, A549는 100 μg/ml의 농도로 처리한 시료에서 45.9%(Fig. 3A), HepG2는 50 μg/ml의 농도로 처리한 시료에서 53.86%(Fig. 3B)로 apoptosis가 현저하게 증가된 양상을보였으며, 서서히 농도의존적으로 apoptosis가 유발되는 A549 에 비하여 HepG2의 경우 저농도에서 early apoptosis가 매우활발히 유도되다가 고농도에서 상당히 많은 세포가 late apop- tosis로 전환되는 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 MEEA가 농도의존적으로 apoptosis의 유도를 증가시키는 효과를 보유하고 있음을 제시한다.
- 이러한 caspase cascade의 활성은 여러 종류의 기질 단백질들을 분해하여 apoptosis를 일으키게 되는데, 세포의 핵 내에 존재하는효소인 PARP는 활성화된 caspase-3에 의해 분해되어 apopto- sis를 유도한다[16]. 상기 근거를 바탕으로 MEEA를 처리한 A549와 HepG2에서 apoptosis 관련 단백질들의 발현 양상을확인한 결과, Fig. 5A, B에서와 같이 pro-apoptotic 단백질인 Bax의 발현이 두 세포에서 모두 MEEA 처리에 의해 증가하였다. 반면에 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현량은 A549에서 약간 감소하였지만 HepG2에서는 큰 변화가 관찰되지 않았으며, 각 세포에서 procaspase-3, 8, 9와 PARP의 발현은 농도의존적으로 감소하였으나 cleaved caspase-3, 8, 9와 cleaved PARP에서는 발현이 증가하는 상반된 경향을 보였다.
- 85%의 세포가 증식이 억제되었다. 아울러 MEEA 처리에 의한 각 세포의 형태가 어떻게 변하는지 확인하기 위하여 WST assay를 통하여 지정된 농도로 48시간 동안 처리하여 도립현미경으로 관찰한 결과, Fig. 1B에서와 같이 MEEA의 농도가 증가할수록 바닥에 고착된 세포가 떨어져 나가면서 전체적인 밀도가 감소하였고, 원래의 세포 형태와는 다르게 불규칙한 모양으로 변하였다. 이러한 결과를 통하여 폐암세포와 간암세포에서 MEEA는 농도 의존적으로 세포의 증식을 억제시킬 수 있음을 확인하였다.
- 반면에 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현량은 A549에서 약간 감소하였지만 HepG2에서는 큰 변화가 관찰되지 않았으며, 각 세포에서 procaspase-3, 8, 9와 PARP의 발현은 농도의존적으로 감소하였으나 cleaved caspase-3, 8, 9와 cleaved PARP에서는 발현이 증가하는 상반된 경향을 보였다. 이 결과는 MEEA가 A549와 HepG2에서 p53의 발현과 Bcl-2 family의변화를 유도하여 caspase-3와 관련된 경로를 경유하는 in- trinsic apoptosis를 유발시킨다는 사실을 시사한다. 따라서 이러한 결과를 통하여 MEEA가 농도의존적으로 apoptosis의 유도를 증가시키는 효과를 보유하고 있고, 이것으로 인하여 인체 폐암세포와 간암세포의 증식을 억제시킬 수 있을 것이라판단된다.
- 2B)로 SubG1의 비율이 상당히 증가하였다. 이 결과를 통하여 MEEA는 인체 폐암세포와 간암세포의 apoptosis를 유도하여 세포의 증식을 억제시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
- 1B에서와 같이 MEEA의 농도가 증가할수록 바닥에 고착된 세포가 떨어져 나가면서 전체적인 밀도가 감소하였고, 원래의 세포 형태와는 다르게 불규칙한 모양으로 변하였다. 이러한 결과를 통하여 폐암세포와 간암세포에서 MEEA는 농도 의존적으로 세포의 증식을 억제시킬 수 있음을 확인하였다.
- 4B와 같이 MEEA를 100 μg/ml의 농도로 처리한 세포에서 DNA 손상에의한 끌림현상이 발생하였다. 이상의 결과는 인체 폐암세포에서 MEEA 처리에 의한 세포증식의 억제 및 형태의 변화가 apoptosis의 유발과 밀접한 관계가 있음을 의미한다.
- 종양 억제 유전자로 알려진 p53이 활성화되면 p21 발현 증가를 통한 cell cycle arrest와 FAS, Bax 등 다양한 apoptosis와 관련된 단백질 발현의 촉진 및 caspase 의 활성을 유도하여 apoptotic cell death를 유발시킨다[25]. 이에 따라 MEEA를 농도별로 처리한 A549와 HepG2에서 p53 및 p21의 발현 경향을 분석한 결과, Fig. 5A, B와 같이 p53과 p21의 발현이 모두 농도의존적으로 증가하는 흥미로운 결과를 관찰할 수 있었다. 이는 최근 보고된 p21 upregulation이 intrinsic apoptotic pathway를 촉진시킨다는 내용과 일치하며, apoptosis를 유발할 경우 p53과 p21 단백질의 발현이 동시에 증가할 수 있다는 가능성을 제시한다[1].
- 1A에 제시한 바와 같이 상당한 독성을 띄며 농도의존적으로세포의 증식이 억제되는 양상을 보였다. 특히 200 μg/ml의최고농도에서 MEEA에 대한 감수성이 가장 높아 폐암세포에서는 80.04%, 간암세포에서는 61.85%의 세포가 증식이 억제되었다. 아울러 MEEA 처리에 의한 각 세포의 형태가 어떻게 변하는지 확인하기 위하여 WST assay를 통하여 지정된 농도로 48시간 동안 처리하여 도립현미경으로 관찰한 결과, Fig.
후속연구
- 이는 기존의 항암제인 pyrimidine-purine antimetabolites, DNA top- oisomerase, alkylating agent 등에서 정상세포까지 손상되는부작용을 줄이기 위한 새로운 방안이 될 수 있다는 점에서주목 받고 있다[16, 17]. 따라서 E. anomala 메탄올 추출물이암세포의 apoptosis를 유발하는 과정을 확인한 본 연구결과는 E. anomala의 생리활성인 항암작용의 기전을 해석하였을 뿐아니라, 나아가 새로운 천연물 유래 항암제 후보 물질을 연구하는 데에 있어 귀중한 자료로 사용될 것이라 사료된다. 또한이러한 기전 연구를 바탕으로 실질적인 폐암과 간암의 치료제로서의 사용 가능성을 확인하기 위해서는 활성성분 분석 및 in vivo에서 추가 실험등이 다양하게 수행되어야 할 것이다.
- anomala의 생리활성인 항암작용의 기전을 해석하였을 뿐아니라, 나아가 새로운 천연물 유래 항암제 후보 물질을 연구하는 데에 있어 귀중한 자료로 사용될 것이라 사료된다. 또한이러한 기전 연구를 바탕으로 실질적인 폐암과 간암의 치료제로서의 사용 가능성을 확인하기 위해서는 활성성분 분석 및 in vivo에서 추가 실험등이 다양하게 수행되어야 할 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.