본 연구에서는 까마귀쪽나무 잎과 열매 추출물의 항염증 활성을 비교하고자 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 cell에서 LPS에 의해 유도된 COX-2/PGE2와 iNOS/NO 및 염증성 cytokine 인 TNF-${\alpha}$, IL-$1{\beta}$, IL-6의 생성 억제 정도를 확인하였다. 그 결과, 동일한 농도 조건($10{\mu}g/ml$)에서 까마귀쪽나무의 열매 추출물이 잎 추출물에 비해 NO, $PGE_2$, iNOS, 염증성 cytokine인 TNF-${\alpha}$, IL-$1{\beta}$, IL-6의 생성량 모두에서 억제 효능이 우수하게 나타났다. 따라서 까마귀쪽나무가 보여주는 항염증 효과적 측면과 안전성의 두가지 측면을 고려할 때, 까마귀쪽나무의 열매 추출물이 저농도에서 잎 추출물보다 항염증 효과가 우수하거나 동등하며, 그 안전성이 크다고 판단됨으로 까마귀쪽나무의 열매추출물이 항염증 효능을 가진 기능성 식품 소재로써 개발 가능성이 있음을 제시한다.
본 연구에서는 까마귀쪽나무 잎과 열매 추출물의 항염증 활성을 비교하고자 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 cell에서 LPS에 의해 유도된 COX-2/PGE2와 iNOS/NO 및 염증성 cytokine 인 TNF-${\alpha}$, IL-$1{\beta}$, IL-6의 생성 억제 정도를 확인하였다. 그 결과, 동일한 농도 조건($10{\mu}g/ml$)에서 까마귀쪽나무의 열매 추출물이 잎 추출물에 비해 NO, $PGE_2$, iNOS, 염증성 cytokine인 TNF-${\alpha}$, IL-$1{\beta}$, IL-6의 생성량 모두에서 억제 효능이 우수하게 나타났다. 따라서 까마귀쪽나무가 보여주는 항염증 효과적 측면과 안전성의 두가지 측면을 고려할 때, 까마귀쪽나무의 열매 추출물이 저농도에서 잎 추출물보다 항염증 효과가 우수하거나 동등하며, 그 안전성이 크다고 판단됨으로 까마귀쪽나무의 열매추출물이 항염증 효능을 가진 기능성 식품 소재로써 개발 가능성이 있음을 제시한다.
The present study aimed to investigate comparative anti-inflammatory effects of Litsea japonica fruit and leaf extract considering the balance of safety and efficacy. Dose response studies were performed to determine the inhibitory effects of 70% EtOH extract of leaf (L70%) on the pro-inflammatory e...
The present study aimed to investigate comparative anti-inflammatory effects of Litsea japonica fruit and leaf extract considering the balance of safety and efficacy. Dose response studies were performed to determine the inhibitory effects of 70% EtOH extract of leaf (L70%) on the pro-inflammatory enzymes expression, COX-2/PGE2 and NO/iNOS, and pro-inflammatory cytokines production, IL-$1{\beta}$, IL-6, and TNF-$\alpha$ in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 cells. We also examined comparative effects of 30 and 70% EtOH extract of fruits (F30% and F70%) at low concentration ($10{\mu}g/ml$ ) in the same conditions. L70% at 50 and $100{\mu}g/ml$ showed inhibitory effects on almost all the inflammatory mediators we examined except for COX-2 regulation, but there were no effects at $10{\mu}g/ml$. Since $100{\mu}g/ml$ of L70% have 18.2% cytotoxicity, we compared the effects of fruit extract, F30% and F70% at $10{\mu}g/ml$ on the regulation of NO/iNOS, PGE2, IL-$1{\beta}$, IL-6, and TNF-$\alpha$ and obtained that fruit extacts are more efficacious and safe than leaf. This study suggests that the 30% EtOH fraction of L. japonica fruit could be a good candidate for development as a functional food supplement in the prevention of inflammatory disorders.
The present study aimed to investigate comparative anti-inflammatory effects of Litsea japonica fruit and leaf extract considering the balance of safety and efficacy. Dose response studies were performed to determine the inhibitory effects of 70% EtOH extract of leaf (L70%) on the pro-inflammatory enzymes expression, COX-2/PGE2 and NO/iNOS, and pro-inflammatory cytokines production, IL-$1{\beta}$, IL-6, and TNF-$\alpha$ in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 cells. We also examined comparative effects of 30 and 70% EtOH extract of fruits (F30% and F70%) at low concentration ($10{\mu}g/ml$ ) in the same conditions. L70% at 50 and $100{\mu}g/ml$ showed inhibitory effects on almost all the inflammatory mediators we examined except for COX-2 regulation, but there were no effects at $10{\mu}g/ml$. Since $100{\mu}g/ml$ of L70% have 18.2% cytotoxicity, we compared the effects of fruit extract, F30% and F70% at $10{\mu}g/ml$ on the regulation of NO/iNOS, PGE2, IL-$1{\beta}$, IL-6, and TNF-$\alpha$ and obtained that fruit extacts are more efficacious and safe than leaf. This study suggests that the 30% EtOH fraction of L. japonica fruit could be a good candidate for development as a functional food supplement in the prevention of inflammatory disorders.
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문제 정의
본 연구는 까마귀쪽나무를 식이용으로 쓸 수 있도록 하기 위하여 열매를 이용한 저농도 범위에서의 항염증 효과를 찾기 위하여 진행되었다. 기존 선행 연구 내용을 바탕으로 항산화 및 항 염증 효능을 보였던 까마귀쪽 나무의 잎부위를 70% EtOH로 추 출하여 10, 50, 100 ㎍/㎖의 실험 농도를 정하고, 열매의 70% EtOH 추출물과 30% EtOH 추출물의 10 ㎍/㎖ 저농도에서의 항 염증 효과를 비교하였다.
본 연구에서는 까마귀쪽나무 잎과 열매 추출물의 항염증 활 성을 비교하고자 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 cell에서 LPS에 의해 유도된 COX-2/PGE2와 iNOS/NO 및 염증성 cytokine 인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성 억제 정도를 확인하였다. 그 결 과, 동일한 농도 조건(10 ㎍/㎖)에서 까마귀쪽나무의 열매 추출 물이 잎 추출물에 비해 NO, PGE2, iNOS, 염증성 cytokine인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성량 모두에서 억제 효능이 우수하게 나타났다.
, 2007). 이에 까마귀쪽나무 잎과 열매 추출물에 대하여 LPS에 의해 유도 증가된 PGE2 생성에 대한 억제 효능을 확 인하였다. 마우스 대식세포주인 RAW 264.
2%의 세포독성을 나타내었다. 이에 본 연구에서는 까마귀쪽 나무를 이용하여 좀 더 부작용을 최소화시킨 소재를 탐색하기 위하여 실제 민간에서도 식용으로 사용하고 있는 안전성이 보 고된 열매부분을 이용하여 저농도 범위에서의 항염증 효과를 확인하고자 잎 추출물과의 효능을 비교함으로써, 인체 안전한 항염증 조절 작용을 가진 새로운 기능성 소재를 개발하는데 기 여하고자 하였다.
제안 방법
2 ㎛ nitrocellulose membrane으로 옮겨 Primary antibody 및 secondary antibody 에 배양하였다. ECL 기질(American Pharmacia Biotech, NY, USA)과 반응시킨 다음 필름에 노출시켜 확인하였다.
7 cell을 5 × 105 cells/㎖이 되도록 96-well plate에 깔고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에 배양한 다음, L70% 10, 50, 100 ㎍/㎖와 F30%, F70% 각 10 ㎍/㎖를 LPS 1 ㎍/㎖와 함께 18시간 동안 처리하였다. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kit (R&D system, USA)를 이 용하여 상층액의 TNF-α, IL-1β, IL-6를 450 ㎚의 흡광도에서 측정하였다.
7 cell을 5 × 105 cells/㎖이 되도록 96-well plate 에 깔고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에 배양한 다음, L70% 10, 50, 100 ㎍/㎖와 F30%, F70% 각 10 ㎍/㎖를 LPS 1 ㎍/ ㎖와 함께 24시간 동안 처리하였다. In vitro Toxicology Assay Kit (Tox-7; Sigma Chemicals, Saint Louis, MO, U.S.A.)를 이용하여 세포가 용해될 때 세포질에서 유리되어 나오는 LDH 양을 490 ㎚의 흡광도에서 측정하였다.
100 ul의 상층액을 취하여 96-well plate에 옮긴 후 각각의 well에 100 ul의 Griess 시약을 가하여 5분간 반응시킨 후 540 ㎚의 흡광도에서 측정하였다.NaNO2의 농도별 표준곡선을 이용하여 상층액 내의 NO 농도를 계산하였다.
RAW 264.7 cell을 5 × 105 cells/㎖이 되도록 96-well plate 에 깔고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에 배양한 다음, L70% 10, 50, 100 ㎍/㎖와 F30%, F70% 각 10 ㎍/㎖를 LPS 1 ㎍/ ㎖와 함께 24시간 동안 처리하였다. In vitro Toxicology Assay Kit (Tox-7; Sigma Chemicals, Saint Louis, MO, U.
RAW 264.7 cell을 5 × 105 cells/㎖이 되도록 96-well plate 에 깔고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에 배양한 다음, L70% 10, 50, 100 ㎍/㎖와 F30%, F70% 각 10 ㎍/㎖를 LPS 1 ㎍/ ㎖와 함께 24시간 동안 처리하였다. In vitro Toxicology Assay Kit (Tox-7; Sigma Chemicals, Saint Louis, MO, U.
RAW 264.7 cell을 5 × 105 cells/㎖이 되도록 96-well plate에 깔고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에 배양한 다음, L70% 10, 50, 100 ㎍/㎖와 F30%, F70% 각 10 ㎍/㎖를 LPS 1 ㎍/㎖와 함께 18시간 동안 처리하였다. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kit (R&D system, USA)를 이 용하여 상층액의 TNF-α, IL-1β, IL-6를 450 ㎚의 흡광도에서 측정하였다.
RAW 264.7 cell을 5 × 105 cells/㎖이 되도록 96-well plate 에 깔고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에 배양한 다음, L70% 10, 50, 100 ㎍/㎖와 F30%, F70% 각 10 ㎍/㎖를 LPS 1 ㎍/ ㎖와 함께 24시간 동안 처리하였다. In vitro Toxicology Assay Kit (Tox-7; Sigma Chemicals, Saint Louis, MO, U.
본 연구는 까마귀쪽나무를 식이용으로 쓸 수 있도록 하기 위하여 열매를 이용한 저농도 범위에서의 항염증 효과를 찾기 위하여 진행되었다. 기존 선행 연구 내용을 바탕으로 항산화 및 항 염증 효능을 보였던 까마귀쪽 나무의 잎부위를 70% EtOH로 추 출하여 10, 50, 100 ㎍/㎖의 실험 농도를 정하고, 열매의 70% EtOH 추출물과 30% EtOH 추출물의 10 ㎍/㎖ 저농도에서의 항 염증 효과를 비교하였다.
이에 까마귀쪽나무 잎과 열매 추출물에 대하여 LPS에 의해 유도 증가된 PGE2 생성에 대한 억제 효능을 확 인하였다. 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 cell에 LPS를 처리 하여 염증반응을 유도하고 까마귀쪽나무 열매 추출물 F30% 및F70% 각 10 ㎍/㎖와 잎 추출물 L70%를 각각 10, 50 ㎍/㎖ 농도 로 처리하여 세포배양액으로부터 PGE2 생성량을 측정하였다. 그 결과, L70%는 처리 농도 50 ㎍/㎖에서 유의적으로 LPS에 의 해 증가된 PGE2 생성을 억제하였다.
세포에 LPS를 처리하여 염증반응을 유도하고, 우선 까마귀 쪽나무 잎부위의 70% EtOH 추출물(L70%)을 각각 10, 50, 100 ㎍/㎖의 농도별로 처리하여 NO 분비 억제효과와 세포독성효과 를 동시에 측정하고, 상호 효능을 비교하기 위하여 10 ㎍/㎖ 낮 은 농도의 까마귀쪽나무 열매부위의 30% EtOH 추출물(F30%) 과 70% EtOH 추출물(F70%)을 처리하였다.
우선, 까마귀쪽나무의 열매와 잎추출물의 항염증 효과를 비 교하기 위하여 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 cell에서 LPS 에 의해 유도된 NO 및 세포독성 효과를 확인하였다.
이에 본 연구에서는 까마귀쪽나무 잎 및 열매 추출물이 LPS 에 의해 증가되는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 분비 억제 조절 양상 을 측정하였다. 그 결과, Fig.
대상 데이터
까마귀쪽나무 잎과 열매는 제주도 서귀포시 남원읍 태흥리 에서 2005년 11월경에 채집하였고, 30% 또는 70% EtOH을 이용하여 잎(185 g)과 열매(100 g)를 상온에서 24시간 동안 추출하였다. 감압농축하고 동결건조 한 다음 제주하이테크산업진흥원 제주생물종다양성연구소(No.
마우스 대식세포주인 RAW 264.7 (mouse leukaemic monocyte macrophage cell line)은 한국세포주은행에서 분양받아 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (GIBCO Inc, Grand lsland, NY)에 10% Fetal Bovine Serum (GIBCO Inc, Grand Island, NY, USA) 과 100 units/㎖의 penicillin-streptomycin (GIBCO Inc, Grand Island, NY, USA)을 첨가하여 사용하였고, 37℃, 5% CO2 incubator에 배양하였다.
데이터처리
모든 실험결과의 측정치는 3회 이상 반복 실시한 결과를 평균 ± 표준편차로 나타내었고, 각 평균치간 차이에 대한 유의성은 Student’s t-test와 one way analysis of variance (ANOVA) test를 실시한 후 p < 0.05, p < 0.01의 유의수준에서 Ducan's multiple range test로 유의적 차이를 검증하였다.
이론/모형
Japonica leaf and fruit extract. Cell viability was determined using the LDH method. Values are the mean ± SEM of triplicate experiments.
성능/효과
LPS를 처리하여 배양하였을 때 염증반응 유도에 의하여 증 가된 NO 생성이 잎 추출물 L70%의 50 및 100 ㎍/㎖ 처리군에서 유의적이며 농도 의존적으로 억제되었다. 그러나 L70%의 10 ㎍/㎖ 저농도에서는 NO 생성 억제효과가 나타나지 않았다.
7 cell에서 LPS에 의해 유도된 COX-2/PGE2와 iNOS/NO 및 염증성 cytokine 인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성 억제 정도를 확인하였다. 그 결 과, 동일한 농도 조건(10 ㎍/㎖)에서 까마귀쪽나무의 열매 추출 물이 잎 추출물에 비해 NO, PGE2, iNOS, 염증성 cytokine인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성량 모두에서 억제 효능이 우수하게 나타났다. 따라서 까마귀쪽나무가 보여주는 항염증 효과적 측 면과 안전성의 두 가지 측면을 고려할 때, 까마귀쪽나무의 열매 추출물이 저농도에서 잎 추출물보다 항염증 효과가 우수하거나 동등하며, 그 안전성이 크다고 판단됨으로 까마귀쪽나무의 열 매추출물이 항염증 효능을 가진 기능성 식품 소재로써 개발 가능성이 있음을 제시한다.
을 측정하였다. 그 결과, Fig. 4에서 보여주는 바와 같이, 잎 추 출물 L70%에서는 50 ㎍/㎖ 처리군에서 IL-1β와 IL-6에서 분비 억제가 나타났다(Fig. 4). 그러나 L70%의 저농도 10 ㎍/㎖ 처리 군에서는 모두 효과를 나타내지 않았다.
7 cell에 LPS를 처리 하여 염증반응을 유도하고 까마귀쪽나무 열매 추출물 F30% 및F70% 각 10 ㎍/㎖와 잎 추출물 L70%를 각각 10, 50 ㎍/㎖ 농도 로 처리하여 세포배양액으로부터 PGE2 생성량을 측정하였다. 그 결과, L70%는 처리 농도 50 ㎍/㎖에서 유의적으로 LPS에 의 해 증가된 PGE2 생성을 억제하였다. 단, L70% 저농도인 10 ㎍/㎖ 처리군에서는 LPS에 의해 증가된 PGE2를 억제하지 못했다.
1). 또한, 같은 처리 조건에서 세포독성효과를 알 수 있는 LDH 활성 을 동시에 측정한 결과, LPS와 L70% 고농도 100 ㎍/㎖를 함께 처리한 군에서 29.8%의 세포독성이 관찰되었다. 이에 반하여 열매 추출물 F30% 및 F70%에 의한 세포독성효과는 나타나지 않았다(Fig.
써 항염증 효과를 나타내는 것으로 생각되며, 열매 추출물이 저 농도에서도 비교적 우수한 효과를 나타내는 것으로 생각된다. 또한, 열매의 30%와 70% EtOH 추출물을 비교하였을 때도 LPS 에 의한 NO억제, PGE2 억제, iNOS 발현억제 및 IL-1β 분비 억 제작용에서 30% EtOH 추출물이 더 우수한 효과를 나타내었다.
단, L70% 저농도인 10 ㎍/㎖ 처리군에서는 LPS에 의해 증가된 PGE2를 억제하지 못했다. 반면, F30% 및 F70%는 저농도 10 ㎍/㎖ 처리군에서 모두 LPS에 의해 증가된 PGE2 생성을 각각 48 및 62%로 매우 효과적으로 억제함 을 보여주었다(Fig. 2). 이러한 결과는 까마귀쪽나무 잎과 열매 추출물이 모두 PGE2의 생성 조절을 통해 항염증 효과를 나타낼 수 있다는 것을 보여주며, 특히 열매추출물이 잎추출물에 비하여 저농도에서도 효능이 우수하게 나타낼 수 있음을 보여준다.
따라서, 본 연구 결과에서 나타난 까마귀쪽나무 잎과 열매 추출물 의 LPS에 의해 증가된 NO 및 PGE2 생성에 대한 억제조절 효과가 iNOS 및 COX-2 효소의 발현 조절에 의한 것인지 확인할 필 요가 있었다. 실험결과, L70%는 저농도인 10 ㎍/㎖에서 효과가 나타나지 않았으며, 50 ㎍/ ㎍/㎖에서는 iNOS 발현을 유의적으 로 감소시켰다. 반면에 F30% 및 F70%는 저농도인 10 ㎍/㎖에서 LPS에 의해 유도된 iNOS 발현을 감소시켰다(Fig.
3). 이는 Fig. 1에서 나타난 NO 분비 조절에 미치는 영향과 동일한 패턴의 결 과로, 까마귀쪽나무의 잎과 열매 추출물은 모두 iNOS-NO 조절 경로를 거치며, 특히 열매 추출물이 잎 추출물보다는 저농도에 서도 우수한 iNOS-NO 억제 조절효과가 있음을 보여준다.
이러한 결과는 까마귀쪽나무 잎과 열매 추출물이 inflamma- tory cytokine인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 분비를 저해함으로 써 항염증 효과를 나타내는 것으로 생각되며, 열매 추출물이 저 농도에서도 비교적 우수한 효과를 나타내는 것으로 생각된다. 또한, 열매의 30%와 70% EtOH 추출물을 비교하였을 때도 LPS 에 의한 NO억제, PGE2 억제, iNOS 발현억제 및 IL-1β 분비 억 제작용에서 30% EtOH 추출물이 더 우수한 효과를 나타내었다.
2). 이러한 결과는 까마귀쪽나무 잎과 열매 추출물이 모두 PGE2의 생성 조절을 통해 항염증 효과를 나타낼 수 있다는 것을 보여주며, 특히 열매추출물이 잎추출물에 비하여 저농도에서도 효능이 우수하게 나타낼 수 있음을 보여준다.
그러나 L70%의 저농도 10 ㎍/㎖ 처리 군에서는 모두 효과를 나타내지 않았다. 이와 반면에, 열매 추 출물은 같은 농도 10 ㎍/㎖의 F30%와 F70%에서 유의성에 다소 차이를 나타내었지만, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 모두에서 억제조 절 효과를 나타내었다.
종합적으로, 까마귀쪽나무의 부위별 잎과 열매를 동일한 처리 농도 조건에서 효능적 측면과 안전성 측면을 비교해 보았을 때, 까마귀쪽나무 열매 추출물이 잎 추출물보다 염증반응에 유도 생성 증가된 NO의 억제 효능이 비교적 높았으며, 열매추출물 저 농도 10 ㎍/㎖에서는 LPS에 의하여 증가된 PGE2, TNF-α, IL-1 β 및 IL-6의 세포외 분비가 모두 억제되었다. 이는 까마귀쪽나 무 열매가 잎에 비해 저농도에서 우수하거나 동등한 항염증 활 성을 나타낼 가능성을 보여준다.
한편, RAW 264.7 cell에 LPS를 처리하였을 때 예상하는 바와 같이 염증반응, 즉 LPS 자극에 의한 COX-2의 발현이 크게 유도 되었으나, 열매 추출물 및 잎 추출물 처리농도에서 모두 LPS에 의해 증가된 COX-2의 발현을 억제 조절하지 않았다(Fig. 3). 이는 까마귀쪽나무의 잎과 열매추출물 모두 LPS에 의해 증가된 PGE2의 생성은 억제하지만, 이 반응은 COX-2의 발현 조절과는 상관없이 일어난다는 것을 의미한다.
후속연구
그 결 과, 동일한 농도 조건(10 ㎍/㎖)에서 까마귀쪽나무의 열매 추출 물이 잎 추출물에 비해 NO, PGE2, iNOS, 염증성 cytokine인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성량 모두에서 억제 효능이 우수하게 나타났다. 따라서 까마귀쪽나무가 보여주는 항염증 효과적 측 면과 안전성의 두 가지 측면을 고려할 때, 까마귀쪽나무의 열매 추출물이 저농도에서 잎 추출물보다 항염증 효과가 우수하거나 동등하며, 그 안전성이 크다고 판단됨으로 까마귀쪽나무의 열 매추출물이 항염증 효능을 가진 기능성 식품 소재로써 개발 가능성이 있음을 제시한다.
또한, COX-2는 arachidonic acid로 부터 PGE2를 생성하는데 관여하는 효소로서, 염증반응을 조절 하는 중요한 단계로 작용 한다(Markworth and Cameron-Smith, 2013), 현재 임상적으로 상용되고 있는 NSAID (non-steroidal inflammatory drug) 항염증 치료제들은 COX-2의 발현을 억제 조절함으로써 항염증 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 연구 결과에서 나타난 까마귀쪽나무 잎과 열매 추출물 의 LPS에 의해 증가된 NO 및 PGE2 생성에 대한 억제조절 효과가 iNOS 및 COX-2 효소의 발현 조절에 의한 것인지 확인할 필 요가 있었다. 실험결과, L70%는 저농도인 10 ㎍/㎖에서 효과가 나타나지 않았으며, 50 ㎍/ ㎍/㎖에서는 iNOS 발현을 유의적으 로 감소시켰다.
이는 까마귀쪽나 무 열매가 잎에 비해 저농도에서 우수하거나 동등한 항염증 활 성을 나타낼 가능성을 보여준다. 전통적으로도 열매가 잎에 비하여 안전성이 우수하다고 알려져 식용으로 사용되고 있었다는 점 을 고려할 때, 까마귀쪽나무의 열매 추출물이 항염증 효과와 안 전성 두 가지 측면이 다소 우수함을 나타내고 있으므로, 항염증 소재 개발에 있어서 까마귀쪽나무의 열매추출물이나 그 유효성 분에 대한 항염증 활성 기전 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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