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문제 정의
- 그리고 항산화 기능이 좋고 폴리 페놀량이 많은 식물 8종에 대하여 유기용매 분획을 이용하여 추출 분리하고 각 분획별로 항산화 활성을 조사하여, 새로운 천연물 유래 생리 활성 물질의 개발 가능성을 검토하고자 하였다.
제안 방법
- Crude methanol extracts 11종에 대해 폴리페놀 함량과 DPPH free radical 소거 활성 측정, nitric oxide 소거 활성 측정, xanthine oxidase 활성 억제 및 superoxide 소거 활성 측정과 hydroxy radical 소거 활성을 측정 실험을 수행하여 기능이 좋은 8종(구실잣밤나무, 애기달맞이, 밤나무, 산국, 약모밀, 산딸나무, 곰취, 떡쑥)의 식물종에 대해 유기 용매 분획을 실시하여 추출 분리하였다. 획득한 각각의 methanol (MeOH) 추출물을 일정량의 물에 현탁시킨 후, n-hexane, ethyl acetate (EtOAc), butanol (BuOH)을 순차적으로 이용하여 용매분획 하였다.
- 양성 대조군으로 L-ascorbic acid, quercetin, butylated hydroxy anisole (BHA)를 농도별로 조제하여 흡광도를 측정하고 시료와 비교하였다. DPPH free radical 소거활성은 다음 식 1로부터 산출하여 전자공여능(EDA%)에 의한 환원력으로 항산화능을 표시하였고(Inkeda and Fukuzume, 1977), 항산화능을 비교 검토하기 위해서 DPPH의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC50)를 구하여 계산하였다.
- , 2004) 질소산화물(NO)은 세포독성이 강하며 다량의 NO가 생성되면 nitrozation, nitration과 같은 간접적 효과 및 산화반응을 야기하여 유해한 효과를 나타낸다. 본 연구에서 각 시료 추출물의 nitric oxide 생성 저해 활성은, nitric oxide를 생성하는 물질인 sodium nitroprusside (SNP)를 사용하여 NO를 과량 발현시키고, Griess 시약을 사용하여 존재하는 NO2-, 아질산염의 양을 측정하는 방법으로 산출하였다(Ko, 2005). Quercetin을 대조군로 하여 각 시료에 대한 저해 활성 측정 결과는 Table 3과 같다.
- 폴리페놀 화합물의 함량은 Folin-Denis법을 약간 변형하여 실시하였다(Gutfinger, 1981). 먼저 tannic acid 표준용액을 사용하여 폴리페놀 화합물의 정량을 위한 표준곡선으로 이용하였다.
대상 데이터
- 구실잣밤나무는 5월에 제주대학교 근처에서 채집하였으며 수피를 이용하여 실험하였고, 5월 제주대학교 근처에서 채집한 자주괴불주머니의 전초를 실험하였다. 애기달맞이는 8월에 함덕 해수욕장 근처에서 채집한 것의 지상부, 5월에 조천읍 선흘리 근처에서 채집한 큰천남성의 지상부, 광대나물은 3월 제주대학교 근처에서 채집한 전초, 11월 제주대학교 근처에서 채집한 밤나무의 잎, 5월에 오라동 근처에서 채집한 산국의 꽃을 실험에 사용하였다.
- 구실잣밤나무는 5월에 제주대학교 근처에서 채집하였으며 수피를 이용하여 실험하였고, 5월 제주대학교 근처에서 채집한 자주괴불주머니의 전초를 실험하였다. 애기달맞이는 8월에 함덕 해수욕장 근처에서 채집한 것의 지상부, 5월에 조천읍 선흘리 근처에서 채집한 큰천남성의 지상부, 광대나물은 3월 제주대학교 근처에서 채집한 전초, 11월 제주대학교 근처에서 채집한 밤나무의 잎, 5월에 오라동 근처에서 채집한 산국의 꽃을 실험에 사용하였다. 약모밀의 전초를 6월에 제주대학교 근처에서 채집하여 사용하였고, 6월 제주대학교 근처에서 채집한 산딸나무의 잎, 6월에 제주대학교 근처에서 채집한 곰취의 전초, 5월에 제주대학교 근처에서 채집한 떡쑥의 전초를 실험에 사용하였다.
- 애기달맞이는 8월에 함덕 해수욕장 근처에서 채집한 것의 지상부, 5월에 조천읍 선흘리 근처에서 채집한 큰천남성의 지상부, 광대나물은 3월 제주대학교 근처에서 채집한 전초, 11월 제주대학교 근처에서 채집한 밤나무의 잎, 5월에 오라동 근처에서 채집한 산국의 꽃을 실험에 사용하였다. 약모밀의 전초를 6월에 제주대학교 근처에서 채집하여 사용하였고, 6월 제주대학교 근처에서 채집한 산딸나무의 잎, 6월에 제주대학교 근처에서 채집한 곰취의 전초, 5월에 제주대학교 근처에서 채집한 떡쑥의 전초를 실험에 사용하였다.
- 채취한 제주 자생식물 11종을 음지에서 통풍건조 하였다. 건조된 시료를 잘게 파쇄하여 미세 분말로 만든 후, 추출용매인 80% methanol에 한 달 동안 침지하여 추출하여 농축 및 동결 건조하여 분말 시료를 얻었다.
이론/모형
- Hydroxyl radical은 불안정하기 때문에 Chung et al. (1997)의 방법을 이용하여 Hydroxyl radical에 의해 deoxyribose의 분해산물인 TBARS (thiobarbituric acid reactive substances)의 양을 측정하였다. 각 시료 추출물 200 ㎕에 10 mM FeSO4· 7H2O용액 200 ㎕와 10 mM EDTA 용액 200 ㎕, 10 mM 2-deoxyribose 용액 200 ㎕를 첨가하여 잘 혼합한 후, 0.
- Hypoxanthine을 분해하여 uric acid와 superoxide를 생성시키는 xanthine/xanthine oxidase 반응에서 uric acid의 생성은 290 ㎚에서 증가된 흡광도에 의해 측정하였고, superoxide의 양은 nitroblue tetrazolium (NBT) 환원방법에 의해 측정하였다(Cheng et al., 1998). 200 mM sodium phosphate buffer (pH7.
- 각 시료 추출물의 전자공여능(electron donating ability, EDA%) 측정은 Blois 방법에 의한 DPPH free radical 소거법에 따라 측정하였다(Blois, 1958). 각 시료 추출물을 methanol에 녹여 여러 농도로 준비한 뒤, 96 well plate에 100 ㎕씩 분주하고, ethanol에 녹인 0.
- Hydroxyl radical은 활성산소 중에서도 강력한 것으로서, hydroxyl radical을 소거하는 효과는 항산화제로서 그 의의가 크다고 할 수 있다. 따라서 제주도에서 자생하고 있는 식물 11종의 methanol 추출물과 추출물로부터 분리한 분획물들의 hydroxyl radical에 대한 포착효과를 측정하기 위해 Fenton 반응으로 hydroxyl radical을 생성시키고, 생성된 hydroxyl radical에 의해 핵산의 구성당인 deoxyribose가 분해라는 정도를 TBA 발색법을 이용해 측정하였다(Bu et al., 2004). 결과는 Table 3에 나타내었으며, 시료농도 100 ㎍/㎖에서 비교한 결과 밤나무 methanol 추출물에서 74%로 Vitamin C 77%와 BHA 73%의 소거 활성과 비교하였을 때 비슷한 활성 효과를 확인할 수 있었다.
성능/효과
- 측정 결과 quercetin은 500 ㎍/㎖ 농도에서 77%의 nitric oxide 생성 저해 활성을 보인데 반해 제주도에서 자생하고 있는 식물 11종의 경우 nitric oxide 생성 저해 활성이 그다지 높지 않은 것으로 측정되었다. Methanol 추출물 중에서 밤나무 추출물의 nitric oxide 생성 저해율이 55%로 가장 높은 저해율을 보였으며, 분획물인 경우는 대부분 EtOAc 층에서 우수한 저해 활성을 나타내었다. 특히 밤나무의 EtOAc 층이 85%의 저해율을 보여 대조군인 quercetin (77%)보다 높은 저해 효과를 보였고, 산국의 EtOAc 층에서 62%, 애기달맞이의 EtOAc 층에서 56%, 떡쑥의 EtOAc 층에서 54%, 산딸나무의 EtOAc 층에서 54%, 약모밀의 EtOAc 층에서 51%의 Nitric oxide 생성 저해율을 확인 할 수 있었다(Table 5).
- Xanthine oxidase의 억제 효과는 allopurinol을 대조군로 이용하여 측정하였으며 결과는 Table 3에 나타내었다. Xanthine oxidase의 억제 효과를 측정한 결과 IC50값은 산딸나무의 추출물에서 59 ㎍/㎖로 가장 높은 억제 효과를 보였으며, 메탄올 추출물에서는 억제 효과가 그다지 크지 않은 것으로 조사되었다. 동일한 방법으로 시료 분획물의 억제 효과 측정 결과 IC50값은 밤나무의 분획물중 EtOAc 층에서 16 ㎍/㎖, 산국의 EtOAc 층에서 17 ㎍/㎖로 대조군 allopurinol의 IC50값인 7 ㎍/㎖와 비교하였을 때 비교적 우수한 xanthine oxidase 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
- 제주도 자생식물 methanol 추출물들과 합성항산화제인 BHA 및 Vitamin C에 의한 DPPH free radical 소거 활성을 측정하여 비교한 결과는 Table 3과 같다. 결과에서 볼 수 있듯이 각 추출물의 IC50값은 곰취가 8.6 ㎍/㎖로 비교적 높은 radical 소거 활성을 보이는 것으로 나타났으며 시료 분획물에서 위와 동일한 방법으로 DPPH radical 소거 활성을 측정한 결과 IC50은 구실잣밤나무의 분획물 중 EtOAC 층의 1.6 ㎍/㎖, 애기달맞이의 분획물은 BuOH 층에서 IC50이 2.4 ㎍/㎖로 가장 높은 소거 활성을 나타내어 대조군 Vitamin C (2.7 ㎍/㎖)보다 더 좋은 활성을 나타내었다. 다른 시료들과 달리 EtOAc 층보다 H2O층에서 좋은 활성을 나타내었는데, IC50값은 각각 H2O층에서 2.
- 제주도 자생식물 11종의 superoxide radical 소거 효과를 평가하여 측정결과를 Table 3, 용매 추출물 8종에 대한 용매 분획물의 superoxide 소거 활성은 측정한 결과를 Table 6에 나타내었다. 구실잣밤나무의 메탄올 추출물에서는 활성이 매우 좋지 않으나 놀랍게도 에틸아세테이트 분획층은 IC50값이 7 ㎍/㎖ (Table 6)으로 가장 우수한 소거 효과를 나타내어, 대조군인 allopurinol의 IC50값 16 ㎍/㎖ 보다 높은 소거 활성을 보였다. 밤나무는 EtOAc 층에서 9 ㎍/㎖, 산국의 EtOAc층에서 9 ㎍/㎖, 애기달맞이의 BuOH 층에서 13 ㎍/㎖, 곰취의 EtOAc층에서 16 ㎍/㎖로 나타나 allopurinol의 IC50값 16 ㎍/㎖와 비교했을 때, 매우 우수한 활성을 확인할 수 있었으며, 떡쑥의 EtOAc 층에서 19 ㎍/㎖, 산딸나무의 EtOAc 층에서 21 ㎍/㎖, 약모밀의 EtOAc 층에서 79 ㎍/㎖로 조사되어 비교적 좋은 소거 활성을 보였다.
- 산딸나무의 분획물은 EtOAc 층에서 57 ㎍/㎖, 애기달맞이의 EtOAc 층에서 74 ㎍/㎖, 떡쑥의 EtOAc 층에서 74 ㎍/㎖, 구실잣밤나무의 EtOAc 층에서 87 ㎍/㎖로 분획물의 EtOAc 층에서 활성을 확인할 수 있었다. 그러나 약모밀과 곰취의 분획물은 Hexane 층, EtOAc 층, BuOH 층, H2O층에서 모두 IC50값이 500 ㎍/㎖ 이상으로 조사되어 활성 억제 효과가 크지 않은 것으로 나타났다(Table 6).
- 7 ㎍/㎖)보다 더 좋은 활성을 나타내었다. 다른 시료들과 달리 EtOAc 층보다 H2O층에서 좋은 활성을 나타내었는데, IC50값은 각각 H2O층에서 2.5 ㎍/㎖, EtOAc 층에서 3.3 ㎍/㎖로 대조군인 Vitamin C (2.7 ㎍/㎖) 및 BHA (3.4 ㎍/㎖)와 유사한 소거 활성을 나타내어 매우 우수한 free radical 소거 활성을 가짐을 알 수 있었다. 밤나무의 분획물도 BuOH 층에서 IC50이 3.
- Xanthine oxidase의 억제 효과를 측정한 결과 IC50값은 산딸나무의 추출물에서 59 ㎍/㎖로 가장 높은 억제 효과를 보였으며, 메탄올 추출물에서는 억제 효과가 그다지 크지 않은 것으로 조사되었다. 동일한 방법으로 시료 분획물의 억제 효과 측정 결과 IC50값은 밤나무의 분획물중 EtOAc 층에서 16 ㎍/㎖, 산국의 EtOAc 층에서 17 ㎍/㎖로 대조군 allopurinol의 IC50값인 7 ㎍/㎖와 비교하였을 때 비교적 우수한 xanthine oxidase 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 산딸나무의 분획물은 EtOAc 층에서 57 ㎍/㎖, 애기달맞이의 EtOAc 층에서 74 ㎍/㎖, 떡쑥의 EtOAc 층에서 74 ㎍/㎖, 구실잣밤나무의 EtOAc 층에서 87 ㎍/㎖로 분획물의 EtOAc 층에서 활성을 확인할 수 있었다.
- 구실잣밤나무의 메탄올 추출물에서는 활성이 매우 좋지 않으나 놀랍게도 에틸아세테이트 분획층은 IC50값이 7 ㎍/㎖ (Table 6)으로 가장 우수한 소거 효과를 나타내어, 대조군인 allopurinol의 IC50값 16 ㎍/㎖ 보다 높은 소거 활성을 보였다. 밤나무는 EtOAc 층에서 9 ㎍/㎖, 산국의 EtOAc층에서 9 ㎍/㎖, 애기달맞이의 BuOH 층에서 13 ㎍/㎖, 곰취의 EtOAc층에서 16 ㎍/㎖로 나타나 allopurinol의 IC50값 16 ㎍/㎖와 비교했을 때, 매우 우수한 활성을 확인할 수 있었으며, 떡쑥의 EtOAc 층에서 19 ㎍/㎖, 산딸나무의 EtOAc 층에서 21 ㎍/㎖, 약모밀의 EtOAc 층에서 79 ㎍/㎖로 조사되어 비교적 좋은 소거 활성을 보였다. 용매분획실험에서 제외되었던 광대나물은 메탄올 추출물에서 중간 정도의 활성을 보였으나, 이보다 활성이 저조했던 구실잣밤나무, 산국, 밤나무 등의 용매 분획층에서는 매우 좋은 활성을 가진 것으로 보아, 광대나물도 용매 분획을 진행하면 더 강력한 superoxide 소거 활성을 가진 물질을 발굴할 수 있다고 판단된다.
- 4 ㎍/㎖)와 유사한 소거 활성을 나타내어 매우 우수한 free radical 소거 활성을 가짐을 알 수 있었다. 밤나무의 분획물도 BuOH 층에서 IC50이 3.1 ㎍/㎖로 가장 좋은 소거 활성을 보여 BHA (3.4 ㎍/㎖)보다 좋은 활성을 나타내었고, 약모밀의 분획물의 소거 활성은 EtOAc 층에서 12.2 ㎍/㎖, 산딸나무 분획물은 특이하게 H2O층에서 4.7 ㎍/㎖로 가장 높은 활성이 측정되었고, 곰취 분획물은 EtOAc 층에서 3.7 ㎍/㎖로 대조군 BHA (3.4 ㎍/㎖)와 유사한 활성을 확인할 수 있었으며, 떡쑥 분획물은 BuOH 층에서 4.5 ㎍/㎖의 소거활성을 나타내었다(Table 4).
- 결과는 Table 3에 나타내었으며, 시료농도 100 ㎍/㎖에서 비교한 결과 밤나무 methanol 추출물에서 74%로 Vitamin C 77%와 BHA 73%의 소거 활성과 비교하였을 때 비슷한 활성 효과를 확인할 수 있었다. 분획물인 경우 구실잣밤나무는 BuOH 층에서 76%로 가장 우수한 hydroxyl radical 소거 활성을 보여, 대조군인 Vitamin C (77%)의 소거 활성보다 낮았으나, BHA (73%)보다 좋은 소거 활성을 확인할 수 있었고, 애기달맞이의 H2O층에서 71%, 떡쑥은 EtOAc 층에서 70%, 산딸나무의 H2O층에서 71%, 약모밀은 BuOH 층에서 68%, 곰취는 H2O층에서 71%, 밤나무는 H2O층에서 71%, 산국의 H2O층에서 68%의 소거 활성을 보였다(Table 7).
- 폴리페놀 함량과 5가지 항산화 실험을 수행한 결과 기능이 좋은 식물 8종에 대해 유기 용매 분획을 실시하여 추출 분리하여 분획물을 얻었으며, 시료 분획물의 총 폴리페놀 함량을 분석한 결과는 Table 2와 같다. 시료 분획물의 총 폴리페놀 함량 분석 결과 EtOAc 층과 BuOH 층에서 높은 함량을 보이고 그 중 밤나무의 의 BuOH 층에서 712 ㎍/㎎으로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 산국의 EtOAc 층과 밤나무의 EtOAc 층, 애기달맞이의 BuOH 층이 각각 573 ㎍/㎎, 558 ㎍/㎎, 506 ㎍/㎎ 순으로 나타났다. 항산화 활성 결과와 총 폴리페놀 화합물의 함량을 비교한 결과, 총 폴리페놀 화합물의 함량이 높은 분획물이 비교적 높은 항산화 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
- 밤나무는 EtOAc 층에서 9 ㎍/㎖, 산국의 EtOAc층에서 9 ㎍/㎖, 애기달맞이의 BuOH 층에서 13 ㎍/㎖, 곰취의 EtOAc층에서 16 ㎍/㎖로 나타나 allopurinol의 IC50값 16 ㎍/㎖와 비교했을 때, 매우 우수한 활성을 확인할 수 있었으며, 떡쑥의 EtOAc 층에서 19 ㎍/㎖, 산딸나무의 EtOAc 층에서 21 ㎍/㎖, 약모밀의 EtOAc 층에서 79 ㎍/㎖로 조사되어 비교적 좋은 소거 활성을 보였다. 용매분획실험에서 제외되었던 광대나물은 메탄올 추출물에서 중간 정도의 활성을 보였으나, 이보다 활성이 저조했던 구실잣밤나무, 산국, 밤나무 등의 용매 분획층에서는 매우 좋은 활성을 가진 것으로 보아, 광대나물도 용매 분획을 진행하면 더 강력한 superoxide 소거 활성을 가진 물질을 발굴할 수 있다고 판단된다.
- 이처럼 총 폴리페놀 화합물의 함량과 항산화 활성을 비교한 결과, 대체적으로 총 폴리페놀 화합물의 함량이 높은 분획물이 비교적 높은 항산화 활성을 나타내는 경향을 확인할 수 있었다. 현재 국내외적으로 천연물에 대한 항산화 활성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있어 제주지역에서 자생하는 천연물의 항산화 효과에 대한 연구는 그 효용가치가 높다고 여겨진다.
- 측정 결과 quercetin은 500 ㎍/㎖ 농도에서 77%의 nitric oxide 생성 저해 활성을 보인데 반해 제주도에서 자생하고 있는 식물 11종의 경우 nitric oxide 생성 저해 활성이 그다지 높지 않은 것으로 측정되었다. Methanol 추출물 중에서 밤나무 추출물의 nitric oxide 생성 저해율이 55%로 가장 높은 저해율을 보였으며, 분획물인 경우는 대부분 EtOAc 층에서 우수한 저해 활성을 나타내었다.
- Methanol 추출물 중에서 밤나무 추출물의 nitric oxide 생성 저해율이 55%로 가장 높은 저해율을 보였으며, 분획물인 경우는 대부분 EtOAc 층에서 우수한 저해 활성을 나타내었다. 특히 밤나무의 EtOAc 층이 85%의 저해율을 보여 대조군인 quercetin (77%)보다 높은 저해 효과를 보였고, 산국의 EtOAc 층에서 62%, 애기달맞이의 EtOAc 층에서 56%, 떡쑥의 EtOAc 층에서 54%, 산딸나무의 EtOAc 층에서 54%, 약모밀의 EtOAc 층에서 51%의 Nitric oxide 생성 저해율을 확인 할 수 있었다(Table 5).
- 시료 분획물의 총 폴리페놀 함량 분석 결과 EtOAc 층과 BuOH 층에서 높은 함량을 보이고 그 중 밤나무의 의 BuOH 층에서 712 ㎍/㎎으로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 산국의 EtOAc 층과 밤나무의 EtOAc 층, 애기달맞이의 BuOH 층이 각각 573 ㎍/㎎, 558 ㎍/㎎, 506 ㎍/㎎ 순으로 나타났다. 항산화 활성 결과와 총 폴리페놀 화합물의 함량을 비교한 결과, 총 폴리페놀 화합물의 함량이 높은 분획물이 비교적 높은 항산화 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
후속연구
- 현재 국내외적으로 천연물에 대한 항산화 활성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있어 제주지역에서 자생하는 천연물의 항산화 효과에 대한 연구는 그 효용가치가 높다고 여겨진다. 따라서 본 실험 연구의 결과를 토대로 항산화 효과가 우수한 식물종에 대해 단일 물질에 대한 분리 작업과 함께 항염증이나 항염, 항노화 등의 실험이 더 깊이 있게 진행된다면 새로운 천연물 유래 생리 활성 물질로서 활용이 가능할 것으로 기대된다.
- 이처럼 총 폴리페놀 화합물의 함량과 항산화 활성을 비교한 결과, 대체적으로 총 폴리페놀 화합물의 함량이 높은 분획물이 비교적 높은 항산화 활성을 나타내는 경향을 확인할 수 있었다. 현재 국내외적으로 천연물에 대한 항산화 활성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있어 제주지역에서 자생하는 천연물의 항산화 효과에 대한 연구는 그 효용가치가 높다고 여겨진다. 따라서 본 실험 연구의 결과를 토대로 항산화 효과가 우수한 식물종에 대해 단일 물질에 대한 분리 작업과 함께 항염증이나 항염, 항노화 등의 실험이 더 깊이 있게 진행된다면 새로운 천연물 유래 생리 활성 물질로서 활용이 가능할 것으로 기대된다.
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