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문제 정의
- 이와 같이 표고버섯의 항산화 및 항균 활성에 대한 연구는 일부 보고되었으나 다양한 유기용매 추출물에서의 다재내성 관련 항균 및 항산화 활성 보고는 아직까지 수행되지 못한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 아세톤, 에탄올, 에틸아세테이트 등을 이용한 표고버섯 추출물에 대하여 총 폴리페놀, 플라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거능 및 ABTS 라디칼 소거능 등의 항산화 활성 그리고 그람 양성과 그람 음성균에 대한 항균 활성을 측정하여 보고하고자 한다.
가설 설정
- 1)Values are expressed as mg gallic acid equivalent (GAE) per g of extract.
제안 방법
- 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)(ABTS, Sigma-Aldrich Co.) 라디칼 소거능 측정은 Re 등(18)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다.
- 전자공여능은 표고버섯 추출물의 첨가구과 무첨가구의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다. 각 3회 반복실험을 실시하여 평균값을 구하였으며, 1 mM ascorbic acid를 대조구로 사용하였다.
- DPPH 라디칼은 추출물의 항산화 물질의 라디칼과 반응하여 짙은 보라색이 탈색되어 흡광도가 감소되는 원리를 이용하여 표고버섯 추출물의 전자공여능을 측정하였다(24, 25). 여러 용매를 이용한 표고버섯 추출물의 DPPH 라디칼소거능 측정 결과는 Fig.
- 전자공여능은 표고버섯 추출물의 첨가구과 무첨가구의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다. 각 3회 반복실험을 실시하여 평균값을 구하였으며, 1 mM ascorbic acid를 대조구로 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 분쇄한 표고버섯 가루 50 g에 acetone, ethyl acetate 그리고 ethanol을 각각 400 mL씩 넣고 72시간 동안 교반하여 추출하였으며, 이를 여과하고 rotary evaporator(EYELA A1000S, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 감압 농축하였다. 각 농축물을 dimethyl sulfoxide(Sigma-Aldrich Co.
- 식용 표고버섯을 acetone, ethyl acetate 및 ethanol 등 여러 용매로 추출하여 각 추출용매에 따른 표고버섯 추출물의 항산화 및 항균 활성을 측정하였다. 추출물은 최소 농도인 98 mg/mL에 맞추어 모든 실험을 진행하였다.
- 표고버섯의 항산화 활성에 관한 연구는 열수 추출물과 에탄올 추출물을 이용해 총 폴리페놀 함량과 전자공여능 관련 항산화 활성을 비교하여 에탄올이 표고버섯의 추출용매로 적합하다고 보고되었으며(12), 메탄올 추출물에서 총 폴리페놀, 플라보노이드 함량 및 전자공여능 등을 이용한 항산화 활성 등이 일부 보고되었다(13). 용매 추출에 따른 활성 비교뿐만 아니라 표고버섯의 건조 방법에 따라서도 추출물의 총 폴리페놀 함량과 전자공여능 등을 조사하여 그들의 항산화 활성을 비교하였다(14). 또한 표고버섯의 항균 활성에 관한 연구로는 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 그람 양성 및 그람 음성균에 대한 높은 항균 활성을 나타내는 것으로 보고되었다(15).
- 표고버섯 추출물 30 μL를 흡수･건조시킨 paper disc(ø 6 mm, Whatman AA discs, Whatman International, St. Louis, MO, USA)를 도말한 평판배지 위에 밀착시키고 37°C incubator에서 24시간 배양한 다음, disc의 주위에 생성된 clear zone의 크기를 측정하여 항균 활성을 비교하였다.
- 표고버섯 추출물 30 μL와 ABTS 용액 970 μL를 혼합한 후 암소에서 30분 방치하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 표고버섯 추출물 45 μL와 1 N FolinCiocalteu reagent(Sigma-Aldrich Co.) 45 μL를 혼합하여 상온에서 3분간 정치시킨 후, 2% Na2CO3 910 μL를 첨가하였다.
- 표고버섯 추출물과 2% AlCl3을 각각 500 μL씩 혼합하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 표고버섯으로부터 얻은 모든 용매 추출물의 플라보노이드 함량을 조사하기 위해 Lee 등(11)의 방법을 일부 변경하여 측정하였다. 표고버섯 추출물과 2% AlCl3을 각각 500 μL씩 혼합하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 표고버섯의 용매 추출물이 포함하고 있는 폴리페놀의 함량을 조사하기 위해 Folin-Denis의 방법을 일부 변형하여 측정하였다(16). 표고버섯 추출물 45 μL와 1 N FolinCiocalteu reagent(Sigma-Aldrich Co.
대상 데이터
- 실험에 사용된 식용 표고버섯은 충남 홍성군에 위치한 왕지마을 표고농장에서 2014년 10월에 구입한 후 자연 건조하고 분쇄하여 사용하였다. 사용된 모든 용매와 시약은 SigmaAldrich Co.
- 표고버섯 추출물의 항균 활성 측정에 사용한 균주는 그람 양성균인 Bacillus subtilis(KCTC1918), Staphylococcus aureus(KCTC1928), Micrococcus luteus(KCTC1915) 그리고 그람 음성균인 Escherichia coli(KCTC2441), Pseudomonas aeruginosa(KCTC1637), Enterobacter cloacae(KCTC1685) 등이며, 모두 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC, Daejeon, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 분양받은 각 균주에 대한 표고버섯추출물의 항균 활성은 disc diffusion method(19)로 측정하였다.
데이터처리
- 표준물질로 gallic acid를 이용한 검량선을 작성하여 총 폴리페놀 함량을 mg gallic acid equivalent(GAE)/g extract로 표시하였다. 각 3회 반복실험을 실시하여 평균값을 구하였다.
- 모든 실험은 3회 반복 실시하여 평균±표준편차로 나타내었으며, 자료의 통계분석은 PASW Statistics 18.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 ANOVA test와 Duncan's multiple range test 등으로 P<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 2,2-Diphenyl-l-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma-Aldrich Co.)로 시료의 라디칼 소거 활성을 측정하는 Blois(17)의 방법을 활용하여 표고버섯 추출물의 DPPH에 대한 환원력인 전자공여능을 측정하였다. 표고버섯 추출물 30 μL에 0.
- 표고버섯 추출물의 항균 활성 측정에 사용한 균주는 그람 양성균인 Bacillus subtilis(KCTC1918), Staphylococcus aureus(KCTC1928), Micrococcus luteus(KCTC1915) 그리고 그람 음성균인 Escherichia coli(KCTC2441), Pseudomonas aeruginosa(KCTC1637), Enterobacter cloacae(KCTC1685) 등이며, 모두 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC, Daejeon, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 분양받은 각 균주에 대한 표고버섯추출물의 항균 활성은 disc diffusion method(19)로 측정하였다. 각 시험 균주는 LB 액체배지에 접종하여 37°C에서 24시간 배양한 후 흡광도를 0.
성능/효과
- 알려진 바와 같이 반응속도가 빠른 ABTS 라디칼 소거 활성은 극성 및 비극성 물질 모두와 반응하여 소거될 뿐만 아니라 일부 항산화 물질들과 잘 반응하여 DPPH 라디칼 소거 활성보다 높은 활성을 보인다는 보고와 같이(31), 본 연구 결과에서도 DPPH 라디칼보다 ABTS 라디칼에서 더 높은 소거 활성을 확인할 수 있었다. ABTS 라디칼 소거 활성은 플라보노이드 함량 및 DPPH라디칼 소거 활성에서 음의 상관관계(각각 r=-0.66, r=-0.68)를 나타낸 반면, ABTS 라디칼 소거 활성과 폴리페놀 함량은 0.90의 양의 상관관계를 나타내었다. 이러한 결과는 Jin(32)이 보고한 바와 같이 DPPH와 ABTS의 라디칼 종류가 다르고, 위에서 언급한 여러 항산화 물질이 2종류의 라디칼에 결합하는 정도가 다르기 때문에 DPPH와 ABTS의 라디칼 소거능에서 차이가 발생하는 것으로 사료된다.
- 1과 같다. DPPH 라디칼 소거능은 ethyl acetate 추출물에서 49.9%로 가장 높게 나타났고, acetone과 ethanol에서 각각 46.5%, 25.0%로 확인되었다. 대조구로 사용된 ascorbic acid의 71.
- 폴리페놀 화합물의 일종인 플라보노이드 함량은 Table 1에 나타내었다. Ethyl acetate 추출물에서 1.18 mg QE/g extract, acetone 추출물과 ethanol 추출물에서는 각각 1.08 mg QE/g extract, 0.35 mg QE/g extract를 확인할 수 있었다. 이러한 연구의 결과는 Qi 등(13)이 보고한 표고버섯의 methanol 추출물에 대한 플라보노이드 함량이 0.
- ABTS 라디칼 소거능은 ABTS와 potassium persulfate의 반응으로 생성되는 ABTS+ free 라디칼이 추출물 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 라디칼의 짙은 청록색이 무색으로 탈색되는 원리를 이용한 항산화 활성 측정법이다(18). Fig. 2는 용매에 따른 표고버섯 추출물의 ABTS 라디칼 소거능 측정 결과로 ethanol 추출물에서 98.5%, acetone 추출물에서 97.2%의 소거 활성을 보여 대조구로 사용된 ascorbic acid의 95.7%보다 전체적으로 높은 라디칼 소거능을 확인하였다. Hong 등(30)의 보고에 의한 표고버섯의 80% methanol 추출물(10 mg/mL)에서 70.
- subtilis의 경우 가장 큰 항균 활성(+++, 11 mm)을 나타내었다. P. aeruginosa 균의 경우 acetone 추출물, ethyl acetate 추출물 및 ethanol 추출물 모두 다소 약한 활성을 보였으며, E. coli 균에 대한 acetone 추출물을 제외한 나머지 모든 추출물에서는 항균 활성을 확인하였다. M.
- luteus, Ent. cloacae 및 B. subtilis 등의 균에서는 모든 추출물에서 활성을 보였으며, S. aureus 균에 대해서는 ethanol 추출물을 제외한 나머지 모든 추출물에서도 항균 활성을 나타내는 것으로 미루어 보아 전반적으로 표고버섯은 대부분의 항균 테스트 균주에 대해서 항균 효과를 가지고 있는 것으로 확인되었다.
- luteus, Ent. cloacae 및 B. subtilis에서는 acetone, ethyl acetate 및 ethanol 추출물 모두에서 항균 활성을 확인할 수 있었다.
- luteus(8 mm), Ent. cloacae(8 mm) 및 B. subtilis(7 mm)에 대하여 전체적으로 약한 항균 활성을 나타내었다. 결과적으로 표고버섯의 ethyl acetate 추출물은 6균주 모두에 대해 전체적으로 좋은 항균 활성을 보였으며, 그중에서도 B.
- coli(9 mm), Ent. cloacae(9 mm), S. aureus(10 mm) 및 B. subtilis(11 mm)에 강한 활성을 보였으며 P. aeruginosa(8 mm)와 M. luteus(8 mm)에 다소 약한 활성을 확인하였다. 표고버섯 acetone 추출물의 경우 E.
- subtilis(7 mm)에 대하여 전체적으로 약한 항균 활성을 나타내었다. 결과적으로 표고버섯의 ethyl acetate 추출물은 6균주 모두에 대해 전체적으로 좋은 항균 활성을 보였으며, 그중에서도 B. subtilis의 경우 가장 큰 항균 활성(+++, 11 mm)을 나타내었다. P.
- 95의 양의 상관관계를 보였다. 결과적으로 표고버섯의 경우 폴리페놀 화합물 중 플라보노이드 함량이 증가할수록 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보이는 본 연구의 결과에서도 알 수 있듯이 플라보노이드 화합물이 DPPH 라디칼 소거 활성에서 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 생각되며, 또한 항산화 활성은 phenolics, peptides, organic acids 및 다른 항산화 물질의 복합적인 활성이라고 보고된 바와 같이(27-29) 표고버섯 추출물은 용매에 따라 페놀성 화합물 외에 함유된 다른 항산화 물질의 추출 정도가 다르게 나타나는 것으로 사료된다.
- 표고버섯의 폴리페놀 함량은 유의적 차이는 보이지 않았으나 극성이 큰 ethanol 추출물이 acetone 추출물과 ethyl acetate 추출물보다 다소 높게 조사되었으며, ABTS 라디칼 소거능에서도 유사한 경향을 확인하였다. 반면에 플라보노이드 함량과 DPPH 라디칼 소거능은 ethyl acetate와 acetone 추출물이 ethanol 추출물보다 다소 높게 조사되었다. 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 낮았지만 DPPH 라디칼 소거능에서 항산화 활성을 확인할 수 있었으며, 특히 ABTS 라디칼 소거능은 86.
- coli와 Salmonella Typhimurium 등에서 높은 항균 활성이 보고되었다(35). 위에서 설명한 바와같이 천연물의 항균 활성 검색에 있어 추출에 적합한 용매를 선정하는 것이 매우 중요한데, 표고버섯의 ethyl acetate 추출물이 다양한 균주에서 높은 항균 활성을 나타내는 본 연구의 결과처럼, 특히 표고버섯의 경우에는 ethanol보다 ethyl acetate가 항균 활성 물질 추출에 적합한 용매로 생각된다.
- 용매에 따른 표고버섯 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정 결과는 Table 1과 같다. 폴리페놀 함량은 ethanol 추출물에서 2.12 mg GAE/g extract로 가장 높았으며, acetone 추출물과 ethyl acetate 추출물에서 각각 1.81 mg GAE/g extract, 1.53 mg GAE/g extract의 함량을 나타내었다. 이 같은 결과는 유의적 차이는 없었으나 Cheung 등(22)에 의해 보고된 바와 같이 극성 용매를 이용한 표고버섯 추출물에서 더 많은 폴리페놀 성분이 함유되어 있음을 보여주는 유사한 결과이다.
- 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 낮았지만 DPPH 라디칼 소거능에서 항산화 활성을 확인할 수 있었으며, 특히 ABTS 라디칼 소거능은 86.8∼98.5%로 표준물질 항산화제인 ascorbic acid보다 좀 더 높은 항산화 활성을 확인하였다.
- 표고버섯의 ethanol 추출물에서 항균 효과가 높다고 조사되어 ethanol이 표고버섯의 항균성 물질 추출용매로 적절하다는 보고가 있었으나(15), 본 연구에서 ethanol, acetone, ethyl acetate 추출물의 항균 효과를 비교한 결과 ethyl acetate의 항균 활성이 가장 높다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 다른 버섯에서도 보고되었는데, 먼저 Lee 등(33)은 구름버섯 균사체 배양액의 ethyl acetate 추출물이 P.
- 5%로 표준물질 항산화제인 ascorbic acid보다 좀 더 높은 항산화 활성을 확인하였다. 표고버섯의 다재내성 관련 항균 활성은 ethyl acetate 추출물이 6종의 다제내성 균주인 3종의 그람 양성균 Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus 및 Micrococcus luteus와 3종의 그람 음성균 Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa 및 Enterobacter cloacae 등 모두에서 항균 활성을 가지고 있는 것을 확인하였다. 특히 B.
- 추출물은 최소 농도인 98 mg/mL에 맞추어 모든 실험을 진행하였다. 표고버섯의 폴리페놀 함량은 유의적 차이는 보이지 않았으나 극성이 큰 ethanol 추출물이 acetone 추출물과 ethyl acetate 추출물보다 다소 높게 조사되었으며, ABTS 라디칼 소거능에서도 유사한 경향을 확인하였다. 반면에 플라보노이드 함량과 DPPH 라디칼 소거능은 ethyl acetate와 acetone 추출물이 ethanol 추출물보다 다소 높게 조사되었다.
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