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문제 정의
- 이러한 만성적인 염증상태는 세포 내 ROS 과다 생성과 미토콘드리아의 기능 이상을 유발하여 에너지대사 장애를 일으키고 인슐린저항성을 유도한다. 그러므로 지방세포의 만성적인 염증상태의 조절은 에너지 대사 및 인슐린저항성과 관련된 기능장애를 회복하는데 중요한 목표가 될 것으로 생각된다.
- 본 연구는 지방세포의 대사이상에 미치는 白朮의 효능을 알아보기 위하여 TNF-α로 3T3-L1 지방세포의 염증 상태를 유도하고 염증성 아디포카인과 ROS의 생성, 염증와 인슐린저항성 조절을 위한 신호전달 경로에 미치는 영향을 조사하였다.
- 본 연구에서 AMK가 TNF-α로 유도된 지방세포의 염증과 인슐린저항성 회복에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- 100% confluent 해졌을 때 0.5 mM isobutylmethylxanthine(IBMX), 1 μM dexamethasone(DEX)와 1 μg/ml insulin의 분화유도물질(MDI)이 포함된 DMEM(10% FBS, 100 unit/ml of penicillin G sodium, 100 μg/ml of streptomycin sulfate)으로 교환하여 2∼3일 동안 분화를 유도하였으며, 그 후 매 2 일 마다 1 μg/ml insulin 이 포함된 DMEM(10% FBS, 100 unit/ml of penicillin G sodium, 100 μg/ml of streptomycin sulfate)으로 교환하였다.
- 3T3-L1전구지방세포는 분화유도 8-12일 후 성숙지방세포(MA)를 확인한 후 TNF-α, TNF-α와 AMK(100 μg/ml)과 AMK(100 μg/ml)을 처리하고 분석하였다.
- AMK의 지방분해에 미치는 영향을 조사하기 위하여 광학현미경 하에서 지방세포의 형태를 관찰하였다. 그 결과 비처리군은 분화 10일째에 지방세포의 비대와 지방세포내 지방구의 생성이 관찰되었다.
- AMK의 지방세포 내 염증성 아디포카인의 신호전달 경로를 규명하기 위하여 TNF-α의 세포 내 신호전달 분자인 ERK1/2, JNK1/2 및 IκBα의 활성 정도를 단백질 발현과 인산화 발현을 통해 관찰하였다.
- AMK의 지방세포에서 인슐린저항성 개선과 관련된 신호전달 경로를 규명하기 위하여 PPAR\(\gamma\)와 C/EBPα의 활성 정도를 단백질 발현을 통해 관찰하였다.
- TBST buffer로 3회 세척한 후 2차 antibody를 1:5,000으로 희석하여 1시간 이상 반응시켰다. TBST buffer로 3회 세척 후 Enhanced chemiluminescent detection kit(Pierce ECL Western Blotting Substrate; Pierce Biotechnology, Rockford, USA)를 이용하여 X-ray film에 노출시켜 현상하였다. 실험에 사용된 antibody에 대한 정보는 Table 1에 나타내었다.
- TNF-α로 유도된 지방세포의 만성적 염증에 대한 AMK의 억제 효과를 확인하기 위하여 지방세포에서 지방세포비대에 따라 생산이 증가하는 염증성 아디포카인인 MCP-1과 IL-6의 양을 조사하였다.
- 그 후 PBS로 배지에 남아 있는 CM-H2DCF-DA를 제거한 후 TNF-α를 처리하여 1시간동안 자극하였다.
- 분화 유도된 후 10일째 3T3-L1 지방세포에 AMK를 농도별(0, 100 and 200 μg/ml)로 24시간 처리한 후 TNF-α(5 ng/ml)를 24시간 처리하여 지방세포의 기능이상을 유발하고 지방세포의 형태를 Axiovert 40 CFL 현미경(Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.
- 지방세포에 AMK(100 μg/ml)를 24시간 동안 전처리한 후 TNF-α(5 ng/ml)을 15분(ERK, JNK, IκBα) 또는 24시간(PPAR γ, C/EBPα)동안 처리하였다. 세포 배양이 끝난 후 cold PBS로 세척하여 수거한 세포에 lysis buffer(20 mmol/L Tris-HCl [pH 8.0], 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L ethylene diamine tetra acetic acid(EDTA), 1 mmol/L NaF, 1% Igepal CA-630, 1 mmol/L PMSF, 1 mmol/L Na3VO4, and protease inhibitor cocktail)를 첨가하여 매 5 분간 vortex하여 얼음에 30 분간 방치하였다. 그 후 12,000 rpm, 4°C에서 20 분간 원심분리하여 상청액을 회수하여 단백질 양을 정량하였다.
- 세포배양이 끝난 후 상층액을 회수하여 5,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 분리된 상층액을 −70°C에 보관하였다가 ELISA kit(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA)를 사용하여 microplate reader(SPECTRAMAX M2, Molecular Devices Co. Ltd. USA) 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 표준곡선을 이용하여 cytokine의 양을 계산하였다.
- 그 후 PBS로 배지에 남아 있는 CM-H2DCF-DA를 제거한 후 TNF-α를 처리하여 1시간동안 자극하였다. 얼음 위에서 반응을 정지시킨 후 490 nm(excitation)과 530 nm(emission)에서 fluorometer(SPECTRAMAX M2, Molecular Devices Co. Ltd. USA)를 사용하여 ROS에 의해 산화된 CM-H2DCF의 양을 측정하였다.
- 지방세포 내 ROS의 분비를 측정하기 위하여 5-(and-6)-chloromethyl-2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein-diacetate, acetyl ester(CM-H2DCF-DA)를 사용하였다.
- 지방세포에 AMK(100 μg/ml)를 24시간 동안 전처리한 후 TNF-α(5 ng/ml)을 15분(ERK, JNK, IκBα) 또는 24시간(PPAR γ, C/EBPα)동안 처리하였다.
- 지방세포에 AMK(100 μg/ml)를 24시간 동안 전처리한 후 TNF-α(5 ng/ml)을 24시간동안 처리하였다.
- 지방세포에 AMK를 농도별(100 and 200 μg/ml)로 전처리한 후 TNF-α의 처리에 의해 지방세포의 염증상태를 유도하였다.
- 지방세포의 ROS 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해 AMK를 농도별(100, 200 and 300 μg/ml)로 전처리한 후 TNF-α의 처리에 의해 지방세포 내 ROS 생산증가를 유도하였다.
- 지방세포의 분화를 위해 3T3-L1 전구지방세포는 5% CO2, 37°C 배양기에서 DMEM(10% BCS, 100 unit/ml of penicillin G sodium, 100 μg/ml of streptomycin sulfate)으로 배양하였다.
- 추출된 용액을 원심분리하여 상청액을 획득하고, 0.2 μm 여과지에서 여과하여 rotary evaporator(Rotavapor R-100, BÜCHI Labortechnik AG, Switzerland)로 200 mL가 되도록 감압농축하였다.
대상 데이터
- 3T3-L1 mouse preadipocytes는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)에서 분양받아 사용하였고, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM), bovine calf serum(BCS), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin mixture 및 dimethylsulfoxide(DMSO)는 GibcoBRL(USA)로부터 구입하였다.
- 3T3-L1 mouse preadipocytes는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)에서 분양받아 사용하였고, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM), bovine calf serum(BCS), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin mixture 및 dimethylsulfoxide(DMSO)는 GibcoBRL(USA)로부터 구입하였다. Insulin, isobutylmethylxanthine(IBMX), dexamethasone(DEX), tetrazolium bromide salt(MTT), dimethylsulfoxide(DMSO), bovine serum albumin(BSA)는 Sigma(USA)로부터 구입하였다.
- 白朮(Atractylodes macrocephala Koidzumi)은 (주)옴니허브(Daegu, Korea)에서 규격품을 구입 후 본초감별도감15)에 근거하여 시료의 본초학적 형태와 특징을 확인하고 실험에 사용하였다. 白朮100 g을 1.
- 실온에서 냉각시킨 뒤 감압필터를 사용, 냉동 건조(Freeze Dryer FD-1, EYELA, JAPAN)하여 29 g의 白朮추출물(AMK)을 획득하였고, 냉동보관(−20°C)하였다가 실험직전 PBS에 희석하여 syringe 필터 후 사용하였고, 白朮추출물의 샘플(DKMP-201507- AMK)은 동의대학교 생리학실험실에 보관되어 있다.
데이터처리
- 각 실험군 간의 통계학적 분석은 One way-ANOVA와 Dunnett’s Multiple Comparison Test 검정을 실시하였다.
- 통계분석은 GraphPad PrismⓇ5 package(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 평균치±표준편차로 나타내었고 유의수준은 p＜0.05로 하였다.
이론/모형
- MCP-1과 IL-6의 농도는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법을 이용하여 측정하였다. 지방세포에 AMK(100 μg/ml)를 24시간 동안 전처리한 후 TNF-α(5 ng/ml)을 24시간동안 처리하였다.
성능/효과
- AMK는 TNF-α로 유도된 지방세포의 지방분해, 염증성 아디포카인의 분비, ROS 생성을 억제하였다.
- ERK1/2, JNK1/2 및 IκBα의 단백질 발현에는 차이가 없었으나, ERK1/2, JNK1/2 및 IκBα의 인산화는 TNF-α 처리에 의해 증가하였고, AMK 처리에 의해 ERK1/2, JNK1/2 및 IκBα의 인산화를 억제하였다(Fig. 4).
- 그 결과 MCP-1과 IL-6의 농도는 TNF-α의 처리에 의해 현저한 증가를 보였고, AMK군에서 유의한 억제효과를 보였다.
- AMK의 지방분해에 미치는 영향을 조사하기 위하여 광학현미경 하에서 지방세포의 형태를 관찰하였다. 그 결과 비처리군은 분화 10일째에 지방세포의 비대와 지방세포내 지방구의 생성이 관찰되었다. 반면, TNF-α 처리군은 비처리군에 비해 비대한 지방세포내 지방구의 현저한 소실이 관찰되었으며, AMK 처리군은 농도의존적으로 지방세포 내 지방구 소실 억제가 관찰되었다(Fig.
- 그 결과, ROS 생산량은 TNF-α의 처리에 의해 현저한 증가를 보였고, AMK군에서 농도의존적으로 유의한 억제효과를 보였다 (Fig. 3).
- 그러나, TNF-α 비처리군과 AMK 농도별 단독 처리군은 MCP-1과 IL-6의 농도에 유의한 차이를 보이지 않아 AMK의 단독 처리가 지방세포의 항염증 효과에 어떠한 영향도 미치지 않음을 확인하였다(p＜ 0.05, Fig. 2).
- 반면, TNF-α 처리군은 비처리군에 비해 비대한 지방세포내 지방구의 현저한 소실이 관찰되었으며, AMK 처리군은 농도의존적으로 지방세포 내 지방구 소실 억제가 관찰되었다(Fig. 1).
- 본 연구에서 AMK의 ROS 억제효과를 확인한 결과 AMK가 TNF-α처리한 군에 비해 농도의존적으로 ROS 생성을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다(Fig. 3).
- 본 연구에서 AMK의 TNF-α에 의해 활성화되는 전구 염증성 신호전달 경로 억제효과를 조사한 결과, AMK는 ERK, JNK, IκBα의 활성화를 억제하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- 본 연구에서 AMK의 염증 억제 효과를 확인하기 위하여 TNF-α로 지방세포의 만성적 염증을 유도하고 MCP-1과 IL-6의 양을 조사한 결과, AMK가 염증성 아디포카인의 생산을 유의하게 억제하여 지방세포의 염증반응을 억제하는 작용이 있음을 알 수 있었다(Fig. 2).
- 본 연구에서 AMK의 지방분해에 미치는 영향을 조사하기 위하여 TNF-α 처리에 의한 비대한 지방세포 내 지방분해가 관찰되었고, AMK가 지방세포 내 지방분해를 억제하는 작용이 있음을 알 수 있었다(Fig. 1).
- 본 연구에서 AMK의 지방세포 필수전사인자인 PPARγ와 C/EBPα의 활성화 효과를 조사한 결과, AMK는 TNF-α 에 의해 억제된 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
- AMK는 TNF-α로 유도된 지방세포의 지방분해, 염증성 아디포카인의 분비, ROS 생성을 억제하였다. 이러한 항 염증과 항산화스트레스 효과는 ERK, JNK, IκBα 신호전달 단백질의 활성억제를 통한 PPARγ와 C/EBPα 지방세포 핵심 전자조절자의 활성을 통해 나타나는 것을 확인하였다. 이러한 AMK의 효과는 지방세포 대사이상의 조절에 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
후속연구
- 白朮에 대한 실험적 연구로는 비만세포의 전구염증 사이토카인 생성 억제 효능8), 대장암세포에 대한 억제 효능 등에 관한 연구가 진행되었고9), 특히 비만 및 지방대사와 관련하여 비만 동물모델과 지방세포모델을 통한 지방세포 생성 억제 효능10)과 지방세포분화 촉진 효능11)에 대한 연구 결과가 보고되어 지방세포에 대한 白朮의 효능과 작용기전에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
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