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문제 정의
- 혈청 중 AST 및 ALT의 수치 증가는 간손상으로 인하여 증가하게 되며, 간 조직의 괴사와 간 세포의 파괴가 진행됨에 따라 transaminase가 혈중으로 유출되어 높은 수치를 나타내는 것으로 간세포의 변성 및 괴사의 지표로 이용되고 있다(Park과 Kim, 2010). 간질환은 당뇨병의 합병증으로 많이 나타나며 이에 따라 AST와 ALT가 증가하므로(Bhatt와 Smith, 2015), 본 실험에서는 여주추출물이 당뇨로 인한 간기능 저하의 개선에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈중 AST 및 ALT를 조사하였다. 대조군인 AC군을 제외한 모든 그룹들이 NC군과 비슷한 정도의 수준으로 나타났는데 그 중 BMB 투여군이 유의적으로 AST와 ALT를 감소시킴을 알 수 있었다(Fig.
- 또한 본 실험에서 우리는 여주발효추출물의 혈당강하 효능을 당뇨유발 마우스모델을 이용하여 검증하고자 하였다. 여주발효 열수추출물(BMB)을 투여한 군들에서는 급격한 혈당 증가를 억제하거나 감소시켜 혈당 농도를 정상 수준으로 유지하는데 긍정적인 영향을 주었다.
- 민간에서 전통적으로 사용된 여주의 효능은 최근에 과학적인 보고에 의해 증명이 되고 있으며, 현재 당뇨병 예방과 치료를 위해 연구되어야 할 가장 기대 되는 기능성 식물 중 하나이다. 본 연구에서는 여주를 유산균으로 발효하여 추출하고 이것이 혈당을 감소시켜 당뇨병을 조절할 수 있는 지를 조사하였다. 발효한 여주를 열수 또는 에탄올로 추출한 후, 마우스 모델을 사용하여 고혈당 조절 등 여러 가지 생물학적 활성을 테스트를 하였다.
- 그러나 현재까지 여주는 여주추출물과 과즙을 이용한 연구만 보고 되었을 뿐, 발효시킨 여주의 기능성 증진 효과에 관한 연구는 아직 보고된 바가 없다. 이에 본 논문에서는 여주의 항당뇨 효능 증진을 위해 유산균(Lactobacillus plantarium)을 이용해 발효하고 열수와 에탄올로 추출한 후 당뇨 마우스 모델에 여주 발효추출물을 투여하여 혈당 강하 효능, 간기능 개선 여부와 지질의 변화 등을 분석하여 여주 발효추출물의 기능성식품 소재개발에 대한 가능성 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 유산균의 최적 발효 조건을 확립하기 위해 접종한 유산균이 잘자라고 있는 지를 24시간 간격으로 유산균의 수를 비교 분석하였을 때 96시간까지 유산균의 수가 급격히 증가하고 있음을 확인할 수 있었다. 96시간 이후로는 유산균 수는 감소하는 경향을 보였고 따라서 충분한 발효를 위해 96시간 배양한 여주발효추출물을 이용하여 실험을 진행하였다. 또한 본 실험에서는 유산균의 최적 배양온도로 30oC를 사용하였는데 이는 실험에 사용한 L.
-
AST 및 ALT 측정.
- Alloxan (120 mg/kg body weight)을 복강 투여하고 약 3−7일에 한번씩 혈당을 측정하여 혈당수치가 200−600 mg/dL의 범위로 상승한 마우스를 당뇨가 유발되었다고 판단하여 실험에 사용하였으며(Fig. 1), 각 군의 혈당 평균치가 비슷하도록 실험동물을 나누었다.
- Glucose 수치는 측정하기 8−12시간 전에 사료를 빼주어 8−12시간 정도 공복 상태 후 측정하였으며, 혈당수치가 160−180 mg/dL인 것을 정상으로 보았고, 혈당수치가 200−600 mg/dL까지 증가한 것을 당뇨가 유발된 것으로 간주하고 실험에 사용하였다.
- 간의 지질분석을 위해 혈청 채취는 4주 동안의 경구투여가 끝난 마우스를 ethyl ether로 마취 후 흉부를 열어 심장에서 혈액을 채취하여 13,000 rpm으로 원심 분리한 후 혈청을 분리하여 −80oC에 냉동 보관하여 분석에 사용하였다.
- 건여주를 믹서기로 분쇄하여 분말화한 후 여주 100 g 당 유산균(Lactobacillus plantarium) 약 1×107개를혼합하고 3배수의 물을 첨가하였다.
- 5 g/mL)하여 여주발효열수추출물(bitter melon fermented and boiled water extracts, BMB)과 여주발효에탄올추출물(bitter melon fermented and ethanol extracts, BME)을 제조하였다. 대조군인 여주열수추출물(bitter melon boiled water control, BMBC)과 여주에탄올추출물(bitter melon ethanol control, BMEC)은 유산균을 첨가하지 않고 동일한 방법으로 제조하였다.
- 2, 3). 또한 실험 기간 동안대조군과 실험군의 음수량과 식이량의 변화를 측정하였다 (Fig. 4).
- 마우스 실험의 실험군은 여주열수추출물(BMBC), 여주발효열수추출물 (BMB), 여주에탄올추출물(BMEC), 여주발효 에탄올추출물(BME) 투여군으로 하였고 대조군은 정상 마우스군(normal control, NC)과 alloxan monohydrate 투여 마우스군 (alloxan control, AC)으로 하였다. 추출물의 투여는 oral zonde를 이용하여 0.
- 본 연구에서는 여주를 유산균으로 발효하여 추출하고 이것이 혈당을 감소시켜 당뇨병을 조절할 수 있는 지를 조사하였다. 발효한 여주를 열수 또는 에탄올로 추출한 후, 마우스 모델을 사용하여 고혈당 조절 등 여러 가지 생물학적 활성을 테스트를 하였다. 여주발효추출물은 알록산으로 유도한 당뇨 마우스모델의 혈당을 유의적 수준에서 저하시켰고, 또한 알록산 처리에 의한 간 손상을 보호하였으며 중성지방은 낮게 그리고 HDL 콜레스테롤은 높은 수준으로 유지하고 있는 것을 발견하였다.
- 생후 6주령의 마우스를 alloxan monohydrate (Sigma Aldrich, USA) 120 mg/kg을 복강 투여하여 당뇨를 유발시킨 후, 72시간 후 쥐의 꼬리에서 혈액을 채취하여 개인용 혈당측정 시스템(Infopia Co., Korea)을 이용하여 glucose 수치를 측정하였다. Glucose 수치는 측정하기 8−12시간 전에 사료를 빼주어 8−12시간 정도 공복 상태 후 측정하였으며, 혈당수치가 160−180 mg/dL인 것을 정상으로 보았고, 혈당수치가 200−600 mg/dL까지 증가한 것을 당뇨가 유발된 것으로 간주하고 실험에 사용하였다.
- 여주열수추출물(bitter melon boiled water control, BMBC), 여주발효열수추출물(bitter melon fermented and boiled water extracts, BMB), 여주에탄올추출물 (bitter melon ethanol control, BMEC)과 여주발효에탄올추출물(bitter melon fermented and ethanol extracts, BME)을 당뇨를 유발한 마우스에게 4주 동안 경구투여를 수행하였고, 동시에 일주일에 한번씩 8−12시간 동안 절식시킨 상태에서 혈당수치와 몸무게의 변화를 측정하였다(Fig. 2, 3).
- 건여주를 믹서기로 분쇄하여 분말화한 후 여주 100 g 당 유산균(Lactobacillus plantarium) 약 1×107개를혼합하고 3배수의 물을 첨가하였다. 이 혼합물을 96시간 동안 30o C에서 발효한 후, 열수 또는 에탄올(30%)을 이용하여 교반 추출하고 추출물을 여과 및 감압농축(0.5 g/mL)하여 여주발효열수추출물(bitter melon fermented and boiled water extracts, BMB)과 여주발효에탄올추출물(bitter melon fermented and ethanol extracts, BME)을 제조하였다. 대조군인 여주열수추출물(bitter melon boiled water control, BMBC)과 여주에탄올추출물(bitter melon ethanol control, BMEC)은 유산균을 첨가하지 않고 동일한 방법으로 제조하였다.
- 추출물의 투여는 oral zonde를 이용하여 0.5 g/mL 농도의 추출물을 200 µL씩 4주 동안 매일 한번씩 경구투여를 하였고, 1주일에 한번씩 혈당과 몸무게를 측정하였다.
- C에 냉동 보관하여 분석에 사용하였다. 혈중 중성지방(TG) 함량 측정은 중성지방 측정용 키트(Asan pharmaceutical co Ltd.)를 이용하여 enzymatic method로 분석후 550 nm에서 흡광도를 측정하였고, total cholesterol (T-CHO) 함량 측정은 전체 콜레스테롤 측정용 키트(Asan pharmaceutical co Ltd.)를 이용해 enzymatic method로 분석 후 500 nm에서 흡광도를 측정하였고, HDL-cholesterol (HDL) 함량 측정도 키트(Asan pharmaceutical Co., Ltd.)를 이용하여 enzymatic method으로 분석 후 500 nm로 흡광도를 측정하여 분석하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 우리는 여주발효추출물의 제조를 위해 분쇄한 여주를 유산균과 배합한 후 30o C에서 96시간 동안 배양하였다. 유산균의 최적 발효 조건을 확립하기 위해 접종한 유산균이 잘자라고 있는 지를 24시간 간격으로 유산균의 수를 비교 분석하였을 때 96시간까지 유산균의 수가 급격히 증가하고 있음을 확인할 수 있었다.
- 생후 5주령의 imprinting control region mouse를 (주) 대한바이오링크로 부터 구입한 후, 온도 18±2oC, 상대습도 50±10%, 환기회수 10-20회/시간, 조명시간 12시간(점등 08:00−소등 20:00)으로 설정된 동물실에서 환경적응을 위해 1주일간 예비 사육 후 평균 체중 30−40 g의 마우스를 사용하였다.
- 여주는 국내에서 재배된 것을 경동시장에서 구매하여 사용하였다. 건여주를 믹서기로 분쇄하여 분말화한 후 여주 100 g 당 유산균(Lactobacillus plantarium) 약 1×107개를혼합하고 3배수의 물을 첨가하였다.
데이터처리
- 결과의 통계학적 분석은 graph pad prism 5.0 프로그램을 이용하여 실시하였다. 모든 측정 항목의 결과는 평균 (mean)표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였고 대조군과 실험군간의 평균 차이는 one-way ANOVA로 유의성을 확인한 후 p <0.
- 모든 측정 항목의 결과는 평균 (mean)표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였고 대조군과 실험군간의 평균 차이는 one-way ANOVA로 유의성을 확인한 후 p <0.05 수준에서 유의성 검증을 하였다.
이론/모형
- C에 냉동 보관하여 분석에 사용하였다. 혈장 AST/ ALT 측정용 키트(ASAN pharmaceutical co Ltd., Korea)를 사용하여 Reitman-Frankel 법을 이용하여 분석한 후 505 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- The degree of liver injury was demonstrated by the serum AST (A) and ALT (B) levels. Result showed a significant difference between the groups provided with the extracts of fermented bitter melon (BMB and BME) and alloxan control (AC) in the reduction of serum AST and ALT levels. BMB and BME were shown to offer liver protection against alloxan-induced liver injury in mice (**p <0.
- T-CHO은 AC군과 비교하여 BMB 투여군이 p <0.01 수준의 유의성으로 T-CHO 함량을 감소시킴을 알 수 있었다(Fig. 6B).
- 이는 당뇨병으로 인해 발생할 수 있는 심혈관계 합병증 발생을 완화할 수 있음을 나타내는 결과이다. 결론적으로 본 연구의 결과들은 여주에 유산균 발효를 결합한 새로운 추출물 제조방법이 여주의 효능을 극대화시킴으로써 혈당강하와 간 손상 억제 및 혈중 지질 조절 등 당뇨병의 증상 완화 및 합병증 발생 가능성을 낮추는 결과를 나타냈고, 이를 활용하여 여주발효추출물을 이용한 건강기능성식품으로의 개발 가능성이 충분히 있다고 사료된다. 추후 연구에서 대량 생산을 위한 최적의 여주 발효 조건 확립과 발효 후 기능 성분들의 변화, 효능 기전 등을 분석할 예정이다.
- 2A, 4A). 그러나 BMBC, BME, BMEC 투여군 및 AC군들은 NC군과 비교하여 약 3배 정도 음수량이 많았고 BMB 투여군과는 다르게 음수량이 감소하는 경향을 보이지 않았다. 이러한 결과는 당뇨가 유발 되면서 모델동물의 음수량이 증가하는 양상을 보이다가 혈당이 감소하면서 음수량도 줄어드는 기존의 결과와 유사한 양상을 보였다(Lee 등, 2010; Tian 등, 2010).
- 간질환은 당뇨병의 합병증으로 많이 나타나며 이에 따라 AST와 ALT가 증가하므로(Bhatt와 Smith, 2015), 본 실험에서는 여주추출물이 당뇨로 인한 간기능 저하의 개선에 미치는 영향을 알아보기 위해 혈중 AST 및 ALT를 조사하였다. 대조군인 AC군을 제외한 모든 그룹들이 NC군과 비슷한 정도의 수준으로 나타났는데 그 중 BMB 투여군이 유의적으로 AST와 ALT를 감소시킴을 알 수 있었다(Fig. 5). 즉, AST 테스트에서 AC군(236.
- 더불어 대조군(NC군과 AC군)과 실험군(BMBC, BMB, BMEC과 BME 투여군) 사이의 음수량의 변화를 관찰한 결과, BMB 투여군에서 혈당강하 효과가 나타나기 시작하는 2주째가 되는 시기부터 음수량도 또한 감소하는 경향을 보였고 4주가 되는 시기에는 정상 대조군인 NC군의 수준으로 감소하는 경향을 보였다(Fig. 2A, 4A). 그러나 BMBC, BME, BMEC 투여군 및 AC군들은 NC군과 비교하여 약 3배 정도 음수량이 많았고 BMB 투여군과는 다르게 음수량이 감소하는 경향을 보이지 않았다.
- 여주발효추출물은 알록산으로 유도한 당뇨 마우스모델의 혈당을 유의적 수준에서 저하시켰고, 또한 알록산 처리에 의한 간 손상을 보호하였으며 중성지방은 낮게 그리고 HDL 콜레스테롤은 높은 수준으로 유지하고 있는 것을 발견하였다. 따라서 이러한 결과들은 여주와 유산균을 결합한 새로운 방법이 여주의 효능을 극대화시킴으로써 혈당 강하와 간 손상 억제 및 혈중 지질 조절 등 건강기능식품으로서의 개발 가능성이 충분히 있다고 사료된다.
- 한국인 당뇨환자의 약 80%가 이상지질혈증을 가지고 있다는 보고가 있으므로, 혈당 수준과 함께 이상지질혈증의 개선이 당뇨 환자의 합병증을 줄이는 데 큰 도움을 줄 것으로 보인다. 따라서, 본 실험에서 여주추출물 투여로 인한 이상지질대사의 개선효과를 조사한 결과, 여주추출물과 여주발효추출물을 섭취한 군의 HDL 함량이 높게 나타남을 보여주고 있다(Fig. 6). 이 중에서도 대조군인 AC군(15.
- 발효한 여주를 열수 또는 에탄올로 추출한 후, 마우스 모델을 사용하여 고혈당 조절 등 여러 가지 생물학적 활성을 테스트를 하였다. 여주발효추출물은 알록산으로 유도한 당뇨 마우스모델의 혈당을 유의적 수준에서 저하시켰고, 또한 알록산 처리에 의한 간 손상을 보호하였으며 중성지방은 낮게 그리고 HDL 콜레스테롤은 높은 수준으로 유지하고 있는 것을 발견하였다. 따라서 이러한 결과들은 여주와 유산균을 결합한 새로운 방법이 여주의 효능을 극대화시킴으로써 혈당 강하와 간 손상 억제 및 혈중 지질 조절 등 건강기능식품으로서의 개발 가능성이 충분히 있다고 사료된다.
- 본 실험에서 우리는 여주발효추출물의 제조를 위해 분쇄한 여주를 유산균과 배합한 후 30o C에서 96시간 동안 배양하였다. 유산균의 최적 발효 조건을 확립하기 위해 접종한 유산균이 잘자라고 있는 지를 24시간 간격으로 유산균의 수를 비교 분석하였을 때 96시간까지 유산균의 수가 급격히 증가하고 있음을 확인할 수 있었다. 96시간 이후로는 유산균 수는 감소하는 경향을 보였고 따라서 충분한 발효를 위해 96시간 배양한 여주발효추출물을 이용하여 실험을 진행하였다.
- 5 mg/dL)를 투여한 군에서만 뚜렷한 혈당 강하 효과가 보였다. 이 결과는 여주발효열수추출물이 혈당 상승을 억제하거나 정상치를 유지하는데 탁월한 효능이 있음을 의미한다. 반면에 그 외의 BMBC (339±4 mg/dL), BMEC (329.
- 이 중에서도 대조군인 AC군(15.6±9.4 mg/dL)에 비해 BMBC 투여군(46.6±17.6 mg/dL)과 BMEC 투여군(42.3±14.9 mg/dL)에서 p <0.01 수준의 유의성이 보여 가장 효과가 좋은 것으로 나타났으며, BMB 투여군 (36.3±18.1 mg/dL)에서도 p <0.05 수준의 유의성으로 HDL 수치가 높게 나타남을 확인하였다(Fig. 6A).
- 5B). 이러한 결과는 다른 추출물 투여군과 비교 했을 때 BMB와 BME 투여군이 당뇨로 인한 간 손상을 보다 효과적으로 억제할 수 있는 효능을 가지고 있음을 의미한다고 사료된다.
- 6C). 이러한 결과들은 여주추출물들이 전반적으로 T-CHO과 중성지방(TG)의 함량은 낮추고 HDL의 함량은 증가시켜 당뇨병에서 일반적으로 나타나는 이상지질혈증에 대한 조절 및 완화 기능이 있음을 의미한다고 사료된다. 당뇨병에 수반되는 합병증인 심장질환, 고지혈증, 동맥경화증은 당뇨 환자의 주요 사망원인으로도 알려져 있는데, 본 실험결과로 미루어볼 때 여주발효추출물의 지속적인 투여는 당뇨환자들의 혈당증가를 조절하는 기능 외에도 당뇨로 인한 혈중 지질함량의 이상에 의한 여러 합병증에 예방 효과가 있을 것으로 사료된다 (Kim 등, 2013).
- 즉, AST 테스트에서 AC군(236.0±108.6 mg/dL)에 비해 BMB 투여군(53.4±12.1 mg/dL)에서 p <0.01 수준에서 유의적인 차이를 보였고, BME 투여군(61.4±7.2 mg/dL)에서도 p <0.05 수준에서 유의적인 차이를 보였다(Fig. 5A).
- 따라서, 추후 연구에서 유산균 발효로 인한 여주 유효 성분의 변화에 관한 연구가 필요할 것으로 보인다. 한편 당뇨로 인한 체중감소가 나타나는 지를 확인한 결과, 체중의 변화는 모든 군에서 눈에 띄는 변화가 나타나지 않았고, 이를 통해 alloxan에 의한 당뇨 또는 BMB에 의한 혈당 강하가 체중의 변화에는 크게 영향을 미치지 않는 것을 관찰하였다(Fig. 3). 이와 같은 결과는 본 실험이 4주 동안의 비교적 단기간으로 진행되었기 때문으로 생각되며, 당뇨병은 만성질환으로 장기적인 관리가 필요함을 감안할 때 추후 연구에서 여주추출물이 혈당 및 체중에 미치는 장기적인 영향이 연구 되어야 할 것으로 사료된다.
- 혈중 중성지방(TG) 함량은 AC군과 비교하여 BMB와 BME를 투여했을 때 상대적으로 NC군의 수준으로 중성지방 함량이 감소했음을 알 수 있었다(p <0.05)(Fig. 6C).
- 혈청 AST 및 ALT 측정테스트에서 AC 군을 제외한 모든 그룹들이 NC군과 비슷한 수준을 나타내므로 여주발효추출물에 의한 간 독성은 없을 뿐만 아니라, 당뇨 합병증으로 나타날 수 있는 간기능 저하를 정상 수준으로 회복시킬 수 있음을 알 수 있었다. 혈중지질 분석결과는 AC군에 비해 전체적으로 BMB 투여군에서 총 콜레스테롤과 중성지방 함량은 감소시키고 HDL 함량은 증진시키는 효과가 가장 유의성이 있게 나타났다. 이는 당뇨병으로 인해 발생할 수 있는 심혈관계 합병증 발생을 완화할 수 있음을 나타내는 결과이다.
- 여주발효 열수추출물(BMB)을 투여한 군들에서는 급격한 혈당 증가를 억제하거나 감소시켜 혈당 농도를 정상 수준으로 유지하는데 긍정적인 영향을 주었다. 혈청 AST 및 ALT 측정테스트에서 AC 군을 제외한 모든 그룹들이 NC군과 비슷한 수준을 나타내므로 여주발효추출물에 의한 간 독성은 없을 뿐만 아니라, 당뇨 합병증으로 나타날 수 있는 간기능 저하를 정상 수준으로 회복시킬 수 있음을 알 수 있었다. 혈중지질 분석결과는 AC군에 비해 전체적으로 BMB 투여군에서 총 콜레스테롤과 중성지방 함량은 감소시키고 HDL 함량은 증진시키는 효과가 가장 유의성이 있게 나타났다.
후속연구
- 이는 여주의 유산균 발효 과정에서 항당뇨 기능을 갖는 유효 성분의 활성이 증가한 형태이거나 흡수 또는 추출이용이한 형태로 전환된 결과로 사료된다. 따라서, 추후 연구에서 유산균 발효로 인한 여주 유효 성분의 변화에 관한 연구가 필요할 것으로 보인다. 한편 당뇨로 인한 체중감소가 나타나는 지를 확인한 결과, 체중의 변화는 모든 군에서 눈에 띄는 변화가 나타나지 않았고, 이를 통해 alloxan에 의한 당뇨 또는 BMB에 의한 혈당 강하가 체중의 변화에는 크게 영향을 미치지 않는 것을 관찰하였다(Fig.
- 96시간 이후로는 유산균 수는 감소하는 경향을 보였고 따라서 충분한 발효를 위해 96시간 배양한 여주발효추출물을 이용하여 실험을 진행하였다. 또한 본 실험에서는 유산균의 최적 배양온도로 30oC를 사용하였는데 이는 실험에 사용한 L. plantarium을 김치에서 분리할 때 사용한 온도가 30oC이었기 때문이며 추후 연구에서 다른 온도 조건이 여주의 유산균 발효에 미치는 영향도 연구 되어야 할 것으로 사료된다.
- 3). 이와 같은 결과는 본 실험이 4주 동안의 비교적 단기간으로 진행되었기 때문으로 생각되며, 당뇨병은 만성질환으로 장기적인 관리가 필요함을 감안할 때 추후 연구에서 여주추출물이 혈당 및 체중에 미치는 장기적인 영향이 연구 되어야 할 것으로 사료된다.
- 결론적으로 본 연구의 결과들은 여주에 유산균 발효를 결합한 새로운 추출물 제조방법이 여주의 효능을 극대화시킴으로써 혈당강하와 간 손상 억제 및 혈중 지질 조절 등 당뇨병의 증상 완화 및 합병증 발생 가능성을 낮추는 결과를 나타냈고, 이를 활용하여 여주발효추출물을 이용한 건강기능성식품으로의 개발 가능성이 충분히 있다고 사료된다. 추후 연구에서 대량 생산을 위한 최적의 여주 발효 조건 확립과 발효 후 기능 성분들의 변화, 효능 기전 등을 분석할 예정이다.
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