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문제 정의
- 따라서 본 연구는 천연항산화 생리활성 소재를 함유한 가시오갈피를 사료첨가제로서 사용 가능성을 조사하기 위해 육계에게 0.5 및 1.0% 수준으로 급여하여 생산성, 면역장기 무게, 혈액 생화학적 성상 및 면역 사이토카인 발현 양상을 조사하였다.
제안 방법
- 실험용 기초사료는 상업용 육계사료를 이용하였으며, 가시오갈피(Acanthopanax senticosus) 경남 산청지역에서 생산된 것으로 푸른 잎 부분을 수거하여 50℃에서 건조시킨 후, 가는 입자로 분쇄(Perten 3600, Sweden; 20 mesh)한 후 사용하였다. 가시오갈피의 첨가수준(w/w)은 0.5%(AS1) 및 1.0%(AS2)로서 일반사료에 완전히 혼합하여 시험에 이용하였다. 실험사료의 조성과 화학적 성분은 옥수수, 밀, 대두박 위주로 배합하고, 화학적 조성으로 육계 전기사료는 조단백질 21.
- 공시동물(n=5)의 백혈구 RNA 분리를 위해 혈액 3 mL를0.9% NaCl과 혼합하고, Lymphocyte Separation Medium(LSM, Mediatech, Inc. VA, USA)을 넣어 원심분리(400 g, 20분)하였다. 이어서 백혈구 층과 LSM 층 50% 정도를 흡입하여 동량의 0.
- 5 mL를 첨가하고, 10분간 반응시켰다. 다시 반응물을 12,000 g(4℃, 10분)에서 원심분리한 후 RNA을 획득하고, 분광광도계(Nanodrop tech. Inc. USA)를 이용하여 농도를 측정하였다
- 먼저 cDNA 1 μL, primer(5 pmole)는 각각 0.5 μL, SYBR Green 10 μL, DEPC H2O 8 μL 반응물을 94℃, 5분간 최초 변성을 시키고, 94℃, 15초간 두 번째 변성, 각각 유전자에 맞는 접합 온도를 30초간 접합과 확장과정을 72℃, 30초간 실시하였다.
- 반응과정은 RNA 1.5μg, buffer 4 μL, MgCl2(25 mM) 3 μL, dNTP(2.5 mM) 1 μL, reverse transcriptase 1 μL, primer 0.5 μL를 혼합하여 전체 용량을 DEPC로 20 μL로 조정하여 25℃에서 5분간 접합과정과 42℃에서 60분간 확장과정을 통하여 cDNA를 합성하고, 70℃에서 15분간 열처리를 하여 역전사 효소를 불활성화하였다.
- 체중 측정은 시험 개시(4일령), 21일령 및 시험 종료(35일령)에 정해진 시간에 체중을 측정하였다. 본 사양시험동안 사료섭취량을 조사하여 사료요구율을 계산하였다.
- 본 시험에 사용된 면역 cytokines 염기서열 정보는 Table 1에 제시한 바와 같고, Real-time PCR은 MyiQ(BIO-RAD, USA)을 사용하였다. 먼저 cDNA 1 μL, primer(5 pmole)는 각각 0.
- 본 연구는 천연항산화 생리활성 소재로서 가시오갈피를 육계에게 0(CON), 0.5(AS1) 및 1.0%(AS2) 수준으로 급여하여 생산성, 면역장기 무게, 혈액 생화학적 성상 및 친염증 사이토카인 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 전 사육기간에서 가시오갈피 급여에 따른 체중, 증체 및 사료섭취량은 유의적 차이를 보이지 않았으나, AS2구에서 사료요구율이 유의적으로(p<0.
- 9%가 함유되도록 배합하였다. 사양관리에서 점등은 전 사양기간 동안 24시간 종일 점등을 실시하고, 계사온도는 일령별로 32℃에서 22℃까지 본 대학교의 사육실 온도관리 프로그램에 따라 조절하였다.
- 0%(AS2)로서 일반사료에 완전히 혼합하여 시험에 이용하였다. 실험사료의 조성과 화학적 성분은 옥수수, 밀, 대두박 위주로 배합하고, 화학적 조성으로 육계 전기사료는 조단백질 21.0%, 대사 에너지 3.10 Mcal/kg, 조지방 4.80%, 조섬유 4.30%, 조회분 5.0%로 구성되었으며, 후기 사료는 조단백질 19.0%, 대사에너지 3.20 Mcal/kg, 조지방 5.2% 조섬유 3.9%, 조회분 4.9%가 함유되도록 배합하였다. 사양관리에서 점등은 전 사양기간 동안 24시간 종일 점등을 실시하고, 계사온도는 일령별로 32℃에서 22℃까지 본 대학교의 사육실 온도관리 프로그램에 따라 조절하였다.
- VA, USA)을 넣어 원심분리(400 g, 20분)하였다. 이어서 백혈구 층과 LSM 층 50% 정도를 흡입하여 동량의 0.9% NaCl을 첨가 후 원심(200 g, 20분)하고 생리식염수로서 세척하여 pellet(백혈구)를 분리하였다. 백혈구 total RNA는 QIAamp RNA Blood Mini Kit(QIAGEN Inc.
- 사양시험 종료 후 각 처리구 당 평균체중에 가까운 8수 모두 24수에서 선별하여 경정맥을 절개하여 sodium heparin이 함유된 진공 시험관에 혈액을 채취하였다. 일부 전혈은 즉시 백혈구 분리에 사용하였고, 혈액 생화학 성분 분석을 위한 혈청은 전혈을 1,500 g에서 20분간 원심분리하여 획득한 후 -70℃에 냉동 보관한 후 분석에 이용하였다. 장기의 무게와 샘플 채취는 복강을 절개하여 간, 비장, 흉선 및 F-낭 등의 무게를 측정하고, 액체질소에 냉동하여 -70℃에 보관 후 분석에 사용하였다.
- 일부 전혈은 즉시 백혈구 분리에 사용하였고, 혈액 생화학 성분 분석을 위한 혈청은 전혈을 1,500 g에서 20분간 원심분리하여 획득한 후 -70℃에 냉동 보관한 후 분석에 이용하였다. 장기의 무게와 샘플 채취는 복강을 절개하여 간, 비장, 흉선 및 F-낭 등의 무게를 측정하고, 액체질소에 냉동하여 -70℃에 보관 후 분석에 사용하였다.
- 체중 측정은 시험 개시(4일령), 21일령 및 시험 종료(35일령)에 정해진 시간에 체중을 측정하였다. 본 사양시험동안 사료섭취량을 조사하여 사료요구율을 계산하였다.
- 그 후 94℃ 1분간 재 접합과정과 55℃에서 1분간 재 확장과정을 실시하였다. 최종적으로 유전자간 설정한 접합온도에서 94℃까지 0.5℃씩 상승하면서 94℃에 이를 때까지의 형광 접합물질인 SYBR Green 분리과정을 수행하였다. 유전자 발현의 상대적 발현량은 Livak and Schmittgen(2001)의 방법에 따라 ΔCt와 2-∆∆Ct를 계산하였다.
- 혈장 albumin, total protein, triglyceride, cholesterol, glucose, AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransferase) 분석은 자동혈액생화학분석기(Hitachi 747, Japan)로서 실시하였다.
대상 데이터
- Reverse transcription system(Promega, USA)을 이용하였으며, primer는 oligo(dT)를 이용하였다. 반응과정은 RNA 1.
- 9% NaCl을 첨가 후 원심(200 g, 20분)하고 생리식염수로서 세척하여 pellet(백혈구)를 분리하였다. 백혈구 total RNA는 QIAamp RNA Blood Mini Kit(QIAGEN Inc. CA, USA)를 사용하여 분리하였다. 먼저 EL buffer에 백혈구를 혼합하여 10분간 원심하고, 상청액을 제거 후 RLT buffer를 넣은 뒤 잘 혼합하여 spin column에서 원심(10,000 g, 2분)하였다.
- 본 시험에 공시된 실험동물은 (주)올품에서 구입한 육계 수컷(Ross 308)로서 4일령에 3개 처리구에 케이지 당 4수씩(n=10, 각 처리구당 40수) 모두 120수를 배치하였다. 실험용 기초사료는 상업용 육계사료를 이용하였으며, 가시오갈피(Acanthopanax senticosus) 경남 산청지역에서 생산된 것으로 푸른 잎 부분을 수거하여 50℃에서 건조시킨 후, 가는 입자로 분쇄(Perten 3600, Sweden; 20 mesh)한 후 사용하였다.
- 사양시험 종료 후 각 처리구 당 평균체중에 가까운 8수 모두 24수에서 선별하여 경정맥을 절개하여 sodium heparin이 함유된 진공 시험관에 혈액을 채취하였다. 일부 전혈은 즉시 백혈구 분리에 사용하였고, 혈액 생화학 성분 분석을 위한 혈청은 전혈을 1,500 g에서 20분간 원심분리하여 획득한 후 -70℃에 냉동 보관한 후 분석에 이용하였다.
- 본 시험에 공시된 실험동물은 (주)올품에서 구입한 육계 수컷(Ross 308)로서 4일령에 3개 처리구에 케이지 당 4수씩(n=10, 각 처리구당 40수) 모두 120수를 배치하였다. 실험용 기초사료는 상업용 육계사료를 이용하였으며, 가시오갈피(Acanthopanax senticosus) 경남 산청지역에서 생산된 것으로 푸른 잎 부분을 수거하여 50℃에서 건조시킨 후, 가는 입자로 분쇄(Perten 3600, Sweden; 20 mesh)한 후 사용하였다. 가시오갈피의 첨가수준(w/w)은 0.
데이터처리
- 가시오갈피 급여에 따른 모든 결과는 Proc-GLM(SAS, 1996)에 의해 분산분석을 실시하였으며, 처리 간 비교는 Tukey 방법에 의해 95% 수준에서 유의성 검정을 하였다
이론/모형
- 유전자 발현의 상대적 발현량은 Livak and Schmittgen(2001)의 방법에 따라 ΔCt와 2-∆∆Ct를 계산하였다.
성능/효과
- 가시오갈피 급여에 따른 육계의 면역장기 무게를 조사한 결과(Table 3), 간, 비장 및 흉선 무게는 모든 구에서 유사한 결과를 나타내어 가시오갈피 급여가 면역관련 장기의 무게에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 가시오갈피 첨가급여에 따른 육계의 사양성적 결과(Table 2)를 보면 육계전기(4∼21일령)에서는 모든 구에서 비슷한 수준의 체중 및 증체율을 나타내었으나, 사료요구율은 AS2에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 저하되었다.
- 가시오갈피 첨가에 따른 육계의 혈액 생화학적 성분에 대한 결과를 보면(Table 4), albumin, total protein, cholesterol, AST 및 ALT 등과 같은 생화학 성분은 대조구와 처리구(AS1 및 AS2) 모두 비슷한 값을 보였다. 그러나 triglycerides는 대조구에 비해 AS2구에서 현저히(p<0.
- 간 조직에서는 0.5% 가시오갈피 급여에 따라 iNOS mRNA 발현이 유의적으로(p<0.05) 감소하였고, 대부분의 친염증 사이토카인 발현이 가시오갈피 급여에 따라 유의적 차이 없이 감소되는 경향을 보였다.
- 그러나 triglycerides는 대조구에 비해 AS2구에서 현저히(p<0.05) 높았고, glucose 수준 역시 대조구에 비해 가시오갈피 급여구에서 현저히(p<0.05) 증가되었다.
- 그러나 triglycerides는 대조구에 비해 AS2구에서 현저히(p<0.05) 높았고, glucose 수준은 대조구에 비해 가시오갈피 급여구에서 현저히(p<0.05) 증가되었다.
- , 2009). 따라서 식물생리활성 사료 첨가제는 육계 생산성과 면역장기에 미치는 영향은 시험에 사용한 식물의 종류 및 첨가 수준 등에 따라 결과가 상이한 것으로 보이며, 본 연구에서 0.5% 수준의 가시오갈피 급여는 생산성과 장기무게에 영향을 미치지 않았다.
- 05) 감소하였지만, 다른 친염증 사이토카인 발현은 유의적 차이는 없었다. 따라서 육계 생산성 및 친염증 사이토카인 발현에 미치는 영향 등을 고려할 경우, 0.5% 수준의 가시오갈피 급여가 가장 바람직한 것으로 판단된다.
- 05) 저하되었다. 면역장기 무게를 관찰한 결과, 간, 비장, F-낭 및 흉선 무게는 가시오갈피 급여에 따른 영향이 없었다. 혈액 생화학적 성분에서 albumin, total protein, cholesterol, AST, ALT 등과 같은 대부분의 성분은 대조구와 처리구간 차이는 없었다.
- 백혈구에서 IFN-γ mRNA 발현이 가시오갈피 급여에 따라 현저히(p<0.05) 감소되었으며, IL1-β, IL-6, TNF-α, iNOS 등은 유의적 차이는 없었지만, 발현이 감소되는 경향을 보였다.
- 본 시험결과, 가시오갈피 급여 시 육계의 백혈구 및 간 조직에서 IFN-γ 또는 iNOS 등과 같은 일부 친염증 사이토카인 mRNA 발현이 감소되었다.
- 5%를 급여 시 glucose 농도가 변화가 없거나 오히려 감소되었다는 보고 등 서로 다른 결과를 보이고 있다. 본 시험에서 가시오갈피 급여구에서 혈중 glucose 또는 triglycerides 수준이 증가된 명확한 이유는 설명하기 어렵지만 가시오갈피 급여 시 일부 친염증 사이토카인의 발현이 감소되어 백혈구 면역작용에 요구되는 에너지 소모가 감소한 것이 원인 중의 하나로 추론할 수 있다.
- 이러한 결과로 종합하면 천연생리활성 사료첨가제로서 0.5% 수준의 가시오갈피 급여는 생산성에 부정적인 영향 없이 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 05) 저하되었다. 이상의 결과로 보아 저 수준(0.5%)의 가시오갈피 첨가사료는 생산성에 부정적인 영향 없이 생리활성 소재로 사용될 수 있을 것으로 보인다.
- 전 사육기간에서 가시오갈피 급여에 따른 체중, 증체 및 사료섭취량은 유의적 차이를 보이지 않았으나, AS2구에서 사료요구율이 유의적으로(p<0.05) 저하되었다.
- 친염증 사이토카인 mRNA 발현을 조사한 결과, 가시오갈피 급여에 따라 백혈구의 IFN-γ mRNA 발현이 현저히(p<0.05) 감소되었으며, IL1-β, IL-6, TNF-α, iNOS 등은 유의적 차이는 없었지만, 감소되는 경향이 있었다.
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