[논문]왕호장 열매의 항염증 효과

박성하; 정현정; 박병준; 정태화

doi:10.15230/scsk.2015.41.3.237

초록
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본 연구에서는 왕호장 열매 추출물(FSR)의 항염증 효과를 측정하였다. 왕호장 열매 추출물은 RAW 264.7 macrophage 세포에서 염증 사이토카인($1L-1{\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$)의 발현을 억제하였으며, 농도 의존적으로 NO 생성을 억제하고, 그 효과는 $100{\mu}g/mL$ 농도에서 51%로 나타났다. 뿐만 아니라, iNOS와 COX-2의 mRNA와 단백질 발현을 모두 억제함을 확인하였다. 따라서 왕호장 열매 추출물은 항염증 효능을 갖는 화장품 소재로서의 개발 가능성이 클 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

To develop a new anti-inflammation agent for cosmetics, we investigated the anti-inflammatory activity of Fallopia sachalinensis RonseDecr. fruit extracts (FSR). FSR inhibited the pre-inflammatory cytokines ($1L-1{\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$) and reduced NO production of RAW ...

To develop a new anti-inflammation agent for cosmetics, we investigated the anti-inflammatory activity of Fallopia sachalinensis RonseDecr. fruit extracts (FSR). FSR inhibited the pre-inflammatory cytokines ($1L-1{\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$) and reduced NO production of RAW 264.7 macrophage cells in a dose-dependent manner and decreased the activity to about 51% at a concentration of $100{\mu}g/mL$. FSR suppressed not only the mRNA expression of iNOS and COX-2, but also the protein expression of iNOS and COX-2 in macrophage. The results suggested that FSR has considerable potential as a cosmetics ingredient with an anti-inflammatory effect.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

7 세포를 이용하여 NO생성 억제 효과를 측정하였다. 대식세포를 이용한 NO생성 정도를 통해 염증 억제 작용을 확인할 수 있으며,대식세포의 NOS는 항상 존재하는 것이 아니라, 여러 사이토카인이나 내독소의 영향을 받아 생성되는 것이므로 이를 확인하고자 하였다. 왕호장 열매 추출물을25, 50, 100 µg/mL 농도로 각각 처리한 실험구의 세포배양액을 가지고 NO 생성량을 측정한 결과 농도 의존적으로 NO 생성이 저해됨을 확인하였다(Figure 3).
따라서, 본 실험에서는 국내에 자생하는 왕호장 열매 추출물을 이용하여 기존에 밝혀지지 않은 항염증효과를 확인하고 항염 및 화장품 소재로의 이용 가능성을 확인하기 위해 실험을 진행하였다.
본 실험에서 RAW 264.7 세포에 대한 시료의 유효농도를 결정하기 위해 세포독성측정(MTT assay)을 진행하였다. RAW 264.
본 연구에서는 왕호장 열매 추출물을 화장품의 항염증 소재로 이용하고자 항염증 효과를 측정하고, 그 작용기전에 대해 확인하였다. 왕호장 열매 추출물을 RAW 264.

제안 방법

합성된 cDNA를 사용하여, 94 ℃에서 3 min 반응시킨 후, 94 ℃에서 30 s 동안 denaturation 시키고, 50 ~ 63 ℃에서 1 min annealing 시킨 다음,72 ℃에서 1 min 동안 extension시키는 cycle을 30회 반복한 뒤, 마지막 extension은 72 ℃에서 1 min 동안 PCR machine에서 수행하였다. 각 PCR 생성물은 2% 아가로즈 겔에 로딩하여 100 V 조건에서 30 min 동안 전기영동을 통하여 분석하였다. 각각의 프라이머의 염기서열은 Table 1과 같다.
7 세포를 5 × 10⁵ cells/well로 60 mm cellculture dish에 분주하여 24 h 배양한 후에 시료와 10µg/mL LPS를 처리하여 16 h 배양하였다. 세포를 RNeasy mini kit (Qiagen, USA)를 이용하여 RNA 추출한 후, Prime Scrpit RT-PCR kit (Takara, Japan) 이용하여cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 사용하여, 94 ℃에서 3 min 반응시킨 후, 94 ℃에서 30 s 동안 denaturation 시키고, 50 ~ 63 ℃에서 1 min annealing 시킨 다음,72 ℃에서 1 min 동안 extension시키는 cycle을 30회 반복한 뒤, 마지막 extension은 72 ℃에서 1 min 동안 PCR machine에서 수행하였다.
왕호장 열매 추출물의 NO 생성 억제에 미치는 영향을 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포를 이용하여 NO생성 억제 효과를 측정하였다. 대식세포를 이용한 NO생성 정도를 통해 염증 억제 작용을 확인할 수 있으며,대식세포의 NOS는 항상 존재하는 것이 아니라, 여러 사이토카인이나 내독소의 영향을 받아 생성되는 것이므로 이를 확인하고자 하였다.
왕호장 열매 추출물의 세포 독성측정과 실험에 사용될 농도 범위 결정을 위해 MTT assay를 시행하였다.RAW 264.

대상 데이터

ATCC에서 구매한 RAW 264.7 (mouse macrophage)세포를 10% FBS, 5% antibiotic-antimyotic을 첨가한 DMEM으로 배양기에서 37 ℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다.
COX-2, iNOS, β-actin 항체는 Abcam (USA)에서 구입하여 사용하였으며, COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β,IL-6 primer는 제노텍(Korea)에서 제작하여 사용하였다.
MTT는 Sigma (USA), Dulbeco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Thermoscientific (USA), fetal bovine serum (FBS)과 Antibiotic Antimyotic (100X)는 Gibco (USA) 제품을 사용하였다.
COX-2, iNOS, β-actin 항체는 Abcam (USA)에서 구입하여 사용하였으며, COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β,IL-6 primer는 제노텍(Korea)에서 제작하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 기기는 microplate reader와 PCR은 Bio-rad (USA) 제품을 사용하였으며, Chemi-Doc은 Atto(AE-9300, Japan) 제품을 사용하였다.
본 실험에 사용된 왕호장 열매 추출물은 한국생명공학연구원에서 구매하였다. MTT는 Sigma (USA), Dulbeco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Thermoscientific (USA), fetal bovine serum (FBS)과 Antibiotic Antimyotic (100X)는 Gibco (USA) 제품을 사용하였다.

데이터처리

본 실험의 통계처리는 Minitab 17을 사용하였다. 각 실험군의 결과는 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 각 실험군의 간의 결과는 2-표본 t 검정을 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다. 실험군 간의 차이는 95% 수준(p < 0.
본 실험의 통계처리는 Minitab 17을 사용하였다. 각 실험군의 결과는 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 각 실험군의 간의 결과는 2-표본 t 검정을 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다.

이론/모형

LPS 처리 시 대식세포 표면에 있는 TLR-4 (Toll likereceptor-4)에 의해 활성화되어 발현되는 염증성 효소인 iNOS와 COX-2의 발현억제를 통한 항염증 효능을 확인하기 위해 western blotting을 수행하였다.

성능/효과

RAW 264.7 세포에 대한 세포독성을 측정한 결과, 100µg/mL 이하의 농도에서 세포생존율이 90% 이상으로 나타났다(Figure 1).
RAW264.7 세포에서 염증 매개 cytokine의 생산과 그 유전자의 발현에 미치는 영향을 측정한 결과, LPS로 자극한 세포에서 IL-1β, IL-6, TNF-α mRNA 발현량이 현저하게 증가하였으며, 왕호장 열매 추출물을 처리한 실험군에서 유전자의 발현이 감소하는 것으로 나타났다(Figure 2).
먼저, 왕호장 열매 추출물에 대한 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현을 확인한 결과, 농도 의존적으로 발현을 억제하는 것으로 확인하였으며(Figure 2), iNOS와 COX-2의 단백질 발현 역시 모두 왕호장 열매 추출물에 의해 농도 의존적으로 저해됨을 확인하였다(Figure 4).
왕호장 열매 추출물을 RAW 264.7 세포를 이용하여 항염증 효과를 측정한 결과, 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현을 억제하였으며 iNOS 발현 억제를 통해, NO 생성능이 저하되어 염증 반응을 억제하였다.
왕호장 열매 추출물을25, 50, 100 µg/mL 농도로 각각 처리한 실험구의 세포배양액을 가지고 NO 생성량을 측정한 결과 농도 의존적으로 NO 생성이 저해됨을 확인하였다(Figure 3).
최고 농도인 100 µg/mL의 농도에서 약 51% NO 생성이 저해되는 것으로 확인되었다.

후속연구

이상의 결과 보아 왕호장 열매 추출물은 화장품에서항염증 및 피부 진정 소재로의 활용가치가 있는 것으로 판단되며, 앞으로 임상 수준에서 안정성 및 효능 연구를 진행할 예정이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	면역작용은 무엇인가?	인체는 외부 병원체 등의 각종 외부 물질의 침입을 식별하고 이를 제거함으로써 몸을 보호하며 항상성을 유지하는 자기방어체계인 면역작용을 한다[1]. 이러한 면역작용은 면역을 억제 조절하는 면역 관용과 면역을 증진하는 면역반응으로 나눌 수 있다.
	대식 세포는 염증 반응에서 어떤 역할을 하는가?	대식 세포는 혈액 단핵세포로부터 분화한 조직 세포로 염증 반응에서 방어적 역할을 담당한다[2]. 내독소로 잘 알려진 lipopolysaccharide (LPS)는 그람-음성세균의 세포외막에 존재하며, 대식세포 표면의 TLR4를 자극하여, 다양한 염증 발병 인자로 알려진 TNF-α, IL-6,IL-1β와 같은 염증성 사이토카인을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
	Cyclooxygenase의 종류인 COX-1, COX-2는 어떤 작용을 하는가?	Cyclooxygenase (COX)는 arachidonic acid를 PGs으로 전환시키는 효소로써 COX-1, COX-2로 분류된다.COX-1은 체내에서 혈소판의 형성, 위벽보호, 신장기능의 유지 등 정상적인 생체기능에 작용하지만, COX-2는 염증매개물질인 prostaglandin E2 (PGE2)를 형성시킨다. PGE2와 같은 물질은 염증반응, 면역반응 등에 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다[3,7,8].

참고문헌 (8)

K. A. Hogquist, T. A. Baldwin, and S. C. Jameson, Central tolence: learning self-control in the thymus, Nat. Rev. Immunol., 5(10), 772 (2005).

상세보기
B. H. Kim, Y. T. Lee, and K. H. Kang, Codonopsis Lanceolata inhibits inflammation through regulation of MAPK in LPS-stimulated RAW 264.7 cells, Korean J. Oriental Physiology and Pathology, 24(1), 80 (2010).
T. H. Oh, Ph. D. Dissertation, Jeju National Univ., Jeju, Korea (2011).
W. S. Choi, H. S. Kwon, R. H. No, G. P. Choi, and H. Y. Lee, Enhancement of anti-inflammatory activities of fermented scutellaria baicalensis extracts using Lactobacillus rhamnosus, J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, 39(4), 303 (2013).

원문보기 상세보기
M. J. Park and J. H. Jeong, Cedrela sinensis leaves suppress oxidative stress and expressions of iNOS and COX-2 via MAPK signaling pathways in RAW 264.7 cells, J. FOOD Sci. Nutr., 14, 269 (2009).

원문보기 상세보기
D. Hwang, B. C. Jang, G. Yu, and B. Mary, Expression of mitogen-inducible cyclooxygenase induced by lipopolysaccharide, Biochem. Pharmacol., 54(1), 87 (1997).

상세보기
Y. H. Seo, O. H. Kang, D. Y. Kwon, J. S. Lee, and J. H. Han, Study on the anti-inflammatory effect of Jakyak-tang water extract, Korean J. Oriental & Pathology, 25(3), 503 (2011).
M. E. Assar and J. Angulo, Oxidative stress and vascular inflammation in aging, Free Radic. Biol. Med., 65, 380 (2013).

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