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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 새로운 프로바이오틱스를 선발하고자 국내 된장 및 청국장으로부터 protease 활성이 우수하면서 GRAS(generally recognized as safety)균주로 안전성이 확보된 Bacillus 속 균주를 분리, 동정하였으며 protease 생산 특성 및 α-glucosidase 저해활성에 대해 조사하였다.
- 본 연구에서는 새로운 프로바이오틱스를 선발하고자 protease를 생산하는 GRAS균주를 된장 및 청국장으로부터 분리하고 그 특성을 조사하였다. 분리한 균주를 분리 동정한 결과 각각 B.
제안 방법
- 0.85% sodium chloride(Duksan pure chemicals Co., Ltd., Seoul, Korea)용액 9 mL를 혼합하여 10배 희석법으로 희석한 다음, 각각에 희석액 100 μL를 nutrient agar(Difco, Detroit, MI, USA)에 접종하여 37℃ 배양기(IB-25G, Jeio tech Co., Ltd., Seoul, Korea)에서 24시간 배양한 다음 형성된 colony를 skim milk가 2% 포함된 nutrient agar 배지에 균주를 접종한 뒤 37℃에서 24시간 배양한 후 형성되는 투명환의 크기를 측정하여 protease 활성이 높은 균주를 분리하였고 CDD5, CPD4, CGD3로 명명하였다.
- 3. Investigation of growth conditions of Bacillus amyloliquefaciens strains CDD5, CPD4 and CGD3 isolaed from Deonjang and Cheonggukjang.
- 분리 동정된 미생물의 생육조건을 확인하기 위해 초기 pH, NaCl 및 glucose 조건을 달리하여 균의 생육 정도를 600 nm에서 흡광도로 측정하였다. Nutrient broth(Difco.)의 pH를 3.0~11.0로 조정 후, 1%(v/v)의 전배양 균주를 각 배지에 접종하여 24시간 배양을 진행하면서 균 생육을 관찰하였다. 그리고 균 생육에 있어서 NaCl 및 glucose 농도의 영향을 확인하기 위하여 NaCl은 3~15% 농도를 달리한 Nutrient broth(Difco.
- Protease 활성에 영향을 미치는 pH, 온도 및 기질특이성은 37℃에서 24시간 동안 180 rpm으로 진탕 배양한 후 배양액을 3,000 rpm, 10분간 원심분리 하여 배양 상층액을 조효소액으로 사용하였고, 가장 높은 protease 효소활성을 100%로 하여 각 균주의 효소활성의 pH, 온도, 기질특이성을 나타내었다. 효소 활성에 미치는 pH의 영향을 확인하기 위하여 50 mM 완충용액(pH 3.
- )에 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 다음 형성된 colony 수를 계측하고, colony에 희석배수를 곱하여 시료 mL당 colony forming unit(CFU)로 나타내었다. Protease 활성은 Kunitz법(20)을 변형하여 측정하였다. 시료 0.
- Protease 활성은 tyrosine (Sigma-Aldrich Co.)을 정량하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였으며, 활성단위(unit)는 1분당 1 μg의 tyrosine을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.
- 0로 조정 후, 1%(v/v)의 전배양 균주를 각 배지에 접종하여 24시간 배양을 진행하면서 균 생육을 관찰하였다. 그리고 균 생육에 있어서 NaCl 및 glucose 농도의 영향을 확인하기 위하여 NaCl은 3~15% 농도를 달리한 Nutrient broth(Difco.)를 제조하였고, glucose는 5~40% 농도를 달리하여 1%(v/v)의 전배양 균주를 각각의 배지에 접종한 후 24시간 배양을 진행하면서 균 생육을 관찰하였다.
- 된장 및 청국장으로부터 protease 생산균주를 분리 한결과 skim milk(2.0%)를 첨가한 nutrient agar배지에서 우수한 활성환을 나타내면서 GRAS 미생물인 3개의 protease 생산균주를 선정하였다(Table 1). 최종적으로 16S ribosomal RNA 유전자 염기서열을 이용하여 BLAST 분석한 결과 분리 한 세 균주는 모두 Bacillus amyloliquefaciens와 98~99%의 유사성을 보였으며 각각 Bacillus amyloliquefaciens CDD5, Bacillus amyloliquefaciens CPD4 및 Bacillus amyloliquefaciens CGD3로 명명하였다.
- 된장 및 청국장으로부터 분리된 B. amyloliquefaciens CDD5, B. amyloliquefaciens CPD4, B. amyloliquefaciens CGD3의 최적 생육특성을 확인하기 위해 초기 pH, NaCl, glucose를 달리한 배지에서 균주를 배양하여 생육특성을 확인하였다(Fig. 3). 그 결과 세 균주 모두 초기 pH 5.
- 된장 및 청국장으로부터 분리된 protease 생산균주가 식품에 적용가능 한 미생물인지 확인하기 위하여 16S ribosomal RNA 유전자 염기서열 분석을 통한 균주동정을㈜솔젠트(Solgent Co., Daejeon, Korea)에 의뢰하여 동정하였다.
- 분리 동정된 미생물의 생육조건을 확인하기 위해 초기 pH, NaCl 및 glucose 조건을 달리하여 균의 생육 정도를 600 nm에서 흡광도로 측정하였다. Nutrient broth(Difco.
- Protease 활성에 영향을 미치는 pH, 온도 및 기질특이성은 37℃에서 24시간 동안 180 rpm으로 진탕 배양한 후 배양액을 3,000 rpm, 10분간 원심분리 하여 배양 상층액을 조효소액으로 사용하였고, 가장 높은 protease 효소활성을 100%로 하여 각 균주의 효소활성의 pH, 온도, 기질특이성을 나타내었다. 효소 활성에 미치는 pH의 영향을 확인하기 위하여 50 mM 완충용액(pH 3.0~7.0, citrate-phosphate buffer; pH 6.0~8.0, phosphate buffer; pH 8.0~9.0, Tris-HCl buffer; pH 10.0, carbonate-bicabonate buffer)을 이용하여 기질을 제조하였으며, 온도의 영향은 20℃~70℃ 범위에서 확인하였다. 효소활성에 따른 기질특이성은 0.
- 0, carbonate-bicabonate buffer)을 이용하여 기질을 제조하였으며, 온도의 영향은 20℃~70℃ 범위에서 확인하였다. 효소활성에 따른 기질특이성은 0.6%의 bovine serum albumin, casein, egg white, elastin, skim milk를 기질로 하여 protease활성을 측정하였다.
대상 데이터
- Protease 생산 균주를 분리하기 위하여 4개지역(구미, 김천, 대구 및 포항) 각 가정에서 제조한 된장16종 및 청국장 5종을 수집하고 2014년 11월에 80종을 분리하여 시료로사용하였으며, 그 중 protease분비능이 있는 균주를 다음과 같이 분리하였다. 0.
데이터처리
- Mean±SD (n=3) with different letters above a bar are significantly different by Duncan’s multiple range test (p<0.05).
이론/모형
- α-Glucosidase 저해활성은 Watanabe 등(21)의 방법에 따라 측정하였다.
성능/효과
- amyloliquefaciens CGD3 균주 모두 50℃에서 최적 온도를 나타내었다. B. amyloliquefaciens CDD5는 40~50℃에서 75% 이상, B. amyloliquefaciens CPD4는 40~60℃에서 73%이상, B. amyloliquefaciens CGD3는 40~60℃에서 80% 이상 높은 효소활성을 보였다. 이 결과는 protease 활성의 최적온도가 30℃인 Kim 등(28)의 연구와 비교하면 본 연구의 균주가 다소 높은 최적 온도를 나타냈으며, Kim(25)이 청국장으로부터 분리한 Bacillus subtillis JK-1의 최적 온도가 55℃인 결과와 유사하였다.
- 이러한 결과를 종합하여 보면, 12시간 이상 배양이 요구되며 protease 효소 활성도 우수한 것으로 사료되며 Lim 등(24)의 연구결과에 따르면 최대 활성이 검출된 시점이 exponential phase의 말기시점으로서 균체량과 효소생산량과의 상관관계가 약간의 차이를 보이며 균주의 grow pattern과 효소활성과는 반드시 일치하는 것은 아니나 정체기 시점에서부터 활성이 감소하는 현상이 일반적인 현상이라고 보고하였는데 이는 본 실험결과와 유사하였다. B. amyloliquefaciens CDD5는 7.13 log CFU/mL 까지 생육하였지만 protease 활성이 0.55~1.14 U/mL로 낮았고 B. amyloliquefaciens CPD4 및 B. amyloliquefaciens CGD3의 균주는 우수한 protease활성을 가지는 균주임을 확인하였다.
- B. amyloliquefaciens CDD5의 경우α-glucosidase 저해활성을 거의 나타내지 않았지만 B. amyloliquefaciens CPD4 및 B. amyloliquefaciens CGD3에서는 각각 96.65% 및 97.85%의 높은 저해활성을 나타내었다.
- 21 U/mL로서 가장 높게 나타났다. B. amyloliquefaciens 이 생산하는 protease 활성은 pH 7.0~10.0, 온도는 50℃에서 최적활성을 나타내었으며, casein에서 protease활성이 가장 우수하게 나타났다. pH, NaCl, glucose 농도를 달리한 배양 조건에 따른 B.
- 09%로 감소하는 경향으로 나타나 alkaline protease로 사료된다. B. amyloliquefaciens의 protease의 최적 활성 온도를 확인한 결과 분리된 B. amyloliquefaciens CDD5, B. amyloliquefaciens CPD4, B. amyloliquefaciens CGD3 균주 모두 50℃에서 최적 온도를 나타내었다. B.
- B. amyloliquefaciens의 내염성을 확인하기 위해 NaCl을 농도별로 첨가한 배지에서의 생육특성을 확인한 결과 B. amyloliquefaciens CGD3는 6% 농도에서 배양 시 흡광도 값이 0.54±0.05로 가장 높은 생육을 보였으며, 동일한 농도에서 B. amyloliquefaciens CDD5, B. amyloliquefaciens CPD4의 흡광도는 각각 0.48±0.03, 0.43±0.01를 보였고 9% 농도에서 가장 높은 생육을 보여 각각 0.60±0.01, 0.61±0.03의 흡광도 값을 나타내었고 분리 세 균주 모두 12% 농도까지 느리지만 증식하였으며 15% 농도에서는 생육하지 못하였다.
- amyloliquefaciens CGD3는 내염성이 높은 균주임을 확인하였다. Glucose를 농도별로 첨가한 배지에서 B. amyloliquefaciens 내당성을 확인한 결과 B. amyloliquefaciens CDD5, B. amyloliquefaciens CPD4, B. amyloliquefaciens CGD3 모두 5% 농도까지 균이 생육하였으나 10% 이상에서는 현저하게 생육이 낮아짐을 확인할수 있었으며, 특히 B. amyloliquefaciens CPD4는 5% 농도에서 B. amyloliquefaciens CDD5, B. amyloliquefaciens CGD3균주들 보다 생육이 저조하여 내당성이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 넓은 범위의 pH에 생육이 가능하고 저염장류들의 식염농도가 통상 12% 부근인 점을 고려할 때 장류등의 염을 포함한 조건하에서 발효하여 산업용 미생물로서 적용가능하리라 사료된다.
- Myoung 등(19)이 전통식품에서 분리하여 항당뇨 물질로서 이용가능성을 보고한 B. subtillis Y3-7의 배양액의 α-glucosidase 저해능이 80.01%의 결과와 비교하여 본 실험에서 분리한 B. amyloliquefaciens CPD4 및 B. amyloliquefaciens CGD3가 α-glucosidase 저해 활성이 우수함을 확인하였다.
- 생균수는 12~24시간 배양시 최고생육이 유지되다가 24시간 이후부터 생육이 감소하였다. Protease 활성 또한 최고생육을 유지하는 24시간 배양 시 B. amyloliquefaciens CGD3는 9.21 U/mL로 가장 높은 활성을 나타내었고, B. amyloliquefaciens CPD4는 6시간 이후 지속적으로 생육이 증가하다가 48시간 배양시 8.02 U/mL로 높은 활성을 나타내었다. 이는 Ahn 등(8)이 청국장으로부터 분리한 Bacillus strains 중 B.
- 0, 온도는 50℃에서 최적활성을 나타내었으며, casein에서 protease활성이 가장 우수하게 나타났다. pH, NaCl, glucose 농도를 달리한 배양 조건에 따른 B. amyloliquefaciens의 생육특성으로는 pH 5.0~10.0의 넓은 범위에서 생육하였고, NaCl은 12% 농도까지 증식하였으며 glucose 5%까지는 생육하나 10% 농도부터는 현저하게 생육이 낮아짐을 확인하였다. 또한 혈당저하를 유도하는 α-glucosidase의 저해활성을 측정한 결과, B.
- 0, 50℃의 조건에서 최대 활성을 나타낸 alkaline protease의 특성과 유사하였다. protease의 기질에 대한 특이성을 확인한 결과 Table 2와 같으며 B. amyloliquefaciens CDD5, B. amyloliquefaciens CPD4, B. amyloliquefaciens CGD3 세 균주 모두 casein을 기질로 사용하였을 때 가장 높은 protease활성을 보였으며 skim milk를 기질로 사용하였을 때 45.34, 57.24 및 67.12%의 활성을 확인하였다. 이는 Lim 등(30)이 메주에서 분리한 단백질분해 효소생산하는 Rhizopus stolonifer, Rhizopus oryzae 및 Absidia corymbifera 와 같은 접합균모두 Hammastein casein에 대한 기질특이성이 가장 높아 유사한 경향을 나타내었으며, Byun 등(31)이 전통메주에서 분리한 Bacillius subtillis YG-95는 soy protein isolate(SPI)가 casein보다 높게 나와 상이한 결과를 나타내었다.
- 1과 같다. 각 균주의 생육도는 12시간 배양하였을 때 B. amyloliquefaciens CDD5, B. amyloliquefaciens CPD4 및 B. amyloliquefaciens CGD3가 각각 7.13, 7.18, 7.32 log CFU/mL로 최대 생육도를 보였으며 protease활성은 0~6시간까지는 protease활성이 나타나지 않다가 6시간이후 protease활성이 점차 증가하는 경향을 보여주었다. 생균수는 12~24시간 배양시 최고생육이 유지되다가 24시간 이후부터 생육이 감소하였다.
- 3). 그 결과 세 균주 모두 초기 pH 5.0~10.0의 배지조건에서 고르게 생육하였다. 이는 Bae 등(32)이 맥아에서 분리한 B.
- 2와 같다. 그 결과 최적 pH는 B. amyloliquefaciens CDD5에서 pH 8.0, B. amyloliquefaciens CPD4가 pH 9.0, B. amyloliquefaciens CGD3는 pH 8.0으로 나타났다. 이는 Kim(25), Hwang 등(26), Moon 등(27), Kim 등(28)이 Bacillus sp.
- 또한 혈당저하를 유도하는 α-glucosidase의 저해활성을 측정한 결과, B. amyloliquefaciens CPD4 및 B. amyloliquefaciens CGD3에서는 각각 96.65% 및 97.85%의 저해율을 나타내었다.
- amyloliquefaciens CGD3로 명명하였다. 분리균주의 생육은 12시간 배양 시, 7.13~7.32 log CFU/mL로 최대 생육도를 보였으며 24시간까지 유지되다가 감소하는 경향을 나타내었고, 그 중 B. amyloliquefaciens CGD3의 protease 활성이 9.21 U/mL로서 가장 높게 나타났다. B.
- 분리한 3종의 균주가 생산하는 α-glucosidase 효소활성 저해능을 각 균주의 배양 상층액으로 측정한 결과 B. amyloliquefaciens CPD4 및 B. amyloliquefaciens CGD3 균주에서 양성대조군인 acarbose만큼 우수한 억제효과를 나타냄을 확인하였다(Fig. 4).
- 본 연구에서는 새로운 프로바이오틱스를 선발하고자 protease를 생산하는 GRAS균주를 된장 및 청국장으로부터 분리하고 그 특성을 조사하였다. 분리한 균주를 분리 동정한 결과 각각 B. amyloliquefaciens CDD5, B. amyloliquefaciens CPD4 및 B. amyloliquefaciens CGD3로 명명하였다. 분리균주의 생육은 12시간 배양 시, 7.
- 이는 Kim(25), Hwang 등(26), Moon 등(27), Kim 등(28)이 Bacillus sp.의 alkaline protease의 최적 pH가 9.0~10.0인 연구결과와 비교하여 B. amyloliquefaciens CDD5는 pH 7.0~9.0범위에서 78% 이상, B. amyloliquefaciens CPD4는 pH 8.0~10.0범위에서 protease 활성이 62% 이상, B. amyloliquefaciens CGD3는 pH 7.0~9.0 의 범위에서 protease 활성이 75% 이상의 활성을 나타냄으로써 유사한 경향을 보였다. 특히 B.
- 03의 흡광도 값을 나타내었고 분리 세 균주 모두 12% 농도까지 느리지만 증식하였으며 15% 농도에서는 생육하지 못하였다. 이는 Lee 등(33)의 연구결과에도 유사하게 12%의 NaCl 농도에서도 균생육이 양호하다는 보고하였으며 이러한 결과를 종합하여 볼 때, B. amyloliquefaciens CDD5, B. amyloliquefaciens CPD4는 B. amyloliquefaciens CGD3는 내염성이 높은 균주임을 확인하였다. Glucose를 농도별로 첨가한 배지에서 B.
- amyloliquefaciens CGD3균주들 보다 생육이 저조하여 내당성이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 넓은 범위의 pH에 생육이 가능하고 저염장류들의 식염농도가 통상 12% 부근인 점을 고려할 때 장류등의 염을 포함한 조건하에서 발효하여 산업용 미생물로서 적용가능하리라 사료된다.
- 00 U/mL의 활성을 나타내었다. 이에 따라 본 연구에서 분리한 B. amyloliquefaciens 균주중 B. amyloliquefaciens CGD3균주가 우수한 protease활성을 갖는 균주임을 확인하였다. 이러한 결과를 종합하여 보면, 12시간 이상 배양이 요구되며 protease 효소 활성도 우수한 것으로 사료되며 Lim 등(24)의 연구결과에 따르면 최대 활성이 검출된 시점이 exponential phase의 말기시점으로서 균체량과 효소생산량과의 상관관계가 약간의 차이를 보이며 균주의 grow pattern과 효소활성과는 반드시 일치하는 것은 아니나 정체기 시점에서부터 활성이 감소하는 현상이 일반적인 현상이라고 보고하였는데 이는 본 실험결과와 유사하였다.
- 0%)를 첨가한 nutrient agar배지에서 우수한 활성환을 나타내면서 GRAS 미생물인 3개의 protease 생산균주를 선정하였다(Table 1). 최종적으로 16S ribosomal RNA 유전자 염기서열을 이용하여 BLAST 분석한 결과 분리 한 세 균주는 모두 Bacillus amyloliquefaciens와 98~99%의 유사성을 보였으며 각각 Bacillus amyloliquefaciens CDD5, Bacillus amyloliquefaciens CPD4 및 Bacillus amyloliquefaciens CGD3로 명명하였다. Jung(22)은 B.
- 0범위에서 95% 생존율을 나타낸 결과와 비교하여 분리균주가 더 넓은 pH 범위에서 생육함을 확인할 수 있었다. 특히 B. amyloliquefaciens CGD3가 pH 5.0에서 가장 안정적으로 생육함을 알 수 있었고 pH 5.0 이하, pH 10.0 이상의 조건에서는 분리된 모든 균주가 생육이 현저하게 저하되어 pH 3.0, pH 11.0의 조건에서 균 생육은 거의 확인되지 않았다. B.
후속연구
- 등과 같은 미생물의 배양액 등으로부터 정제되어 이용되고 있으므로 본 연구에서 α-glucosidase 저해 효과를 가지고 있어 당뇨예방용 기능성식품 소재로의 활용가능성이 기대된다.
- 85%의 저해율을 나타내었다. 이러한 결과는 특히 protease활성이 가장 우수하고 α-glucosidase 또한 높은 저해활성을 가진 B. amyloliquefaciens CGD3 균주의 생육특성을 고려하여 단백질 분해 분야의 프로바이오틱 적용 및 당뇨예방용 기능성식품 소재로의 가능성이 기대된다.
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