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문제 정의
- 이에 따라, 본 연구에서는 보리 발아 후 추출한 당단백질 추출물을 이용하여 영양성분의 변화를 분석하고 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 이용하여 산화질소 II와 사이토카인(인터류킨-6, 종양괴사인자-α)의 생성량을 측정하여 체내 면역 증진 소재로서의 이용 가능성을 검토하고자 하였다.
제안 방법
- 2 µm PVDF syringe filter로 여과한 후 BioLC (ICS-3000, DIONEX, Sunnyvale, CA, USA)에 CarboPac-PA10컬럼을 연결하여 분석하였다. 20 mM 수산화나트륨(sodium hydroxide)을 이용하여 40분간 0.5 mL/min이 되도록 isocratic 조건으로 분석하였다. 검출은 AgCl을 작용 전극으로 하여 four-potential step(E=0.
- 0 mL/min으로 하였으며, 오븐 온도는 46℃로 설정하였다. HP 1100 Series, 254 mm 검출기(detector)로 검출하였으며, 이 동상은 140 mM NaHAc, 0.1% TEA, 6% CH3CN가 포함된 A용액(pH 6.1)과 60% CH3CN B용액에 대하여 A용액:B용액으로 초기 100:0에서 22.72분 부터는 0:100으로 기울기조건을 설정하였다.
- RAW 264.7 세포를 2×105 cell/well의 농도로 96 well plate에 분주 24시간 후 시료를 6, 25, 100 µg/mL의 농도로 처리하고, 비처리 대조군으로는 DMEM 배지를 처리하여 24시간 배양하였다.
- 발아 전후 보리 당단백질 추출물의 분자량을 확인하기 위해 Laemmli (8)의 방법에 따라 실시하였다. Stacking gel 5%, running gel 15%의 조성으로 이루어진 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)을 제작 후 전기이동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)을 실시하고 쿠마시블루(Coomassie blue)로 염색하였다. 분자량 표준물질은 10-250 kDa 마커(maker)(Thermo, Rockford, IL, USA)를 이용하였다.
- 아미노산 조성은 시료를 완전히 건조시킨 후 110℃에서 24시간 동안 염화수소(HCl)로 가수분해하였다. 가수분해한 후 노루신(norleucine)을 첨가하여 가수분해된 아미노산을 페닐아이소싸이오 사이아네이트(phenylisothiocyanate)로 유도체화 시켰다. 시료를 완전히 말린 후 A 용매 200 µL에 녹여 원심분리 후에 상층액을 따서 HPLC를 이용하여 아미노산을 분석하였다.
- 검출은 AgCl을 작용 전극으로 하여 four-potential step(E=0.1V, E= −0.2V, E=0.6V, E= −0.1V)로 구성된 integrated amperometry quadruple mode로 측정하였다.
- 면역 활성을 측정하기 위하여 RAW 264.7 세포에 24-GEGB와 48-GEGB를 처리한 결과 GEB에 비해 더 높은 산화질소 II와 사이토카인(인터류킨-6, 종양괴사인자-α)을 생성하였다.
- 발아 보리 당단백질 추출물의 또 다른 면역 증강 효과를 확인 하기 위해 인터류킨-6, 종양괴사인자-α의 사이토카인 생성을 확인하였다.
- 발아 전후 보리 당단백질 추출물에 대한 영양성분 변화와 RAW 264.7 세포에 처리 후 생성하는 산화질소 II와 사이토카인(인터류킨-6, 종양괴사인자-α) 양을 측정하여 면역 증진 효능을 예측하였다.
- 발아 전후 보리 당단백질 추출물의 단백질 함량은 비시초닌산(bicinchoninic acid) 단백질분석키트(protein assay kit, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 이용하여 분석하였다. 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 표준물질로 사용하여 시료 25 µL를 96 well plate에 분주하고 비시초닌산 분석시약(assay reagent) 200 µL를 가하여 37℃ 배양기에서 30분간 반응시킨 후 판독기(microplate reader)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 세척한 보리 종자는 4℃에서 48시간 동안 침지시킨 후 20℃ 배양기(incubator)에서 24, 48시간 동안 발아시켰다. 발아된 보리는 흐르는 물에서 깨끗하게 세척한 후 40℃의 열풍건조기에서 건조 시켜 분쇄하여 발아하지 않은 보리 종자와 비교하여 실험하였다.
- 배양 후 상층액 100 µL와 동량의 Griess reagent (Sigma-Aldrich)를 혼합하여 상온에서 15분 반응시킨 후 판독기를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 사이토카인인 인터류킨-6와 종양괴사인자-α의 생성량 측정은 RAW 264.7 세포를 96 구멍플레이트에 2×105 cell/well의 농도로 분주 24시간 후 발아 보리 당단백질을 6, 25 µg/mL의 농도로 처리하고, 24시간 배양 후 세포의 상층액을 각각의 ELISA kit (Enzo Inc., Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 측정하였다(10).
- 산 가수분해 과정을 거친 시료는 0.2 µm PVDF syringe filter로 여과한 후 BioLC (ICS-3000, DIONEX, Sunnyvale, CA, USA)에 CarboPac-PA10컬럼을 연결하여 분석하였다.
- 시료를 6, 25, 100 µg/mL의 농도로 처리하였을 때 GEB의 경우 2.6, 3.8, 17.8 µM 의 산화질소 II를 생성하였고, 24- GEGB의 경우 18.8, 29.2, 36.3 µM의 산화질소 II를, 48-GEGB의경우 35.5, 38.8, 40.8 µM의 산화질소 II를 각각 생성하였다.
- 시료를 완전히 말린 후 A 용매 200 µL에 녹여 원심분리 후에 상층액을 따서 HPLC를 이용하여 아미노산을 분석하였다.
- 즉, RAW 264.7 세포를 2×105 cell/well의 농도로 96 구멍플레이트에 분주 24시간 후 발아 보리 당단백질을 6, 25, 100 µg/mL의 농도로 처리하고, 비처리 대조군으로는 DMEM 배지를, 양성대조군으로는 1 µg/mL의 지방질다당류(lipopolysaccharide)를 처리하여 24시간 배양하였다.
- 0) 1 L에 넣고 4℃에서 16시간 동안 진탕하면서 추출하였다. 추출 후 원심분리 하여 당단백질 추출물이 녹아 있는 상층액을 농축한 후에 투석막(Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA, USA)을 이용하여 24시간 투석하였다. 투석 후 80% 황산암모늄(ammonium sulfate)을 첨가하여 4시간 동안 단백질을 침전 시킨 후 원심분리하여 침전물을 증류수에 용해하여 다시 24시간 동안 투석하였다.
- , Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 측정하였다(10). 측정방법은 단일클론항체가 코팅된 미량정량플레이트(microtiter plate)에 시료를 넣은 다음 실온에서 반응시킨 후 제공된 세척용액(washing buffer) (0.05% Tween 20 in PBS (pH 7.2-7.4))으로 세척하였다. 이어 다중클론성 항체를 넣어 각각의 사이토카인을 96 well plate에 부착시킨 후 실온에서 반응시키고 세척 후 측정하고자 하는 사이토카인의 3 conjugate 용액을 넣고 반응시켰다.
- , Rancho Dominguez, CA, USA)을 이용하여 24시간 투석하였다. 투석 후 80% 황산암모늄(ammonium sulfate)을 첨가하여 4시간 동안 단백질을 침전 시킨 후 원심분리하여 침전물을 증류수에 용해하여 다시 24시간 동안 투석하였다. 투석된 용액은 냉동건조 하였고, 얻어진 건조 분말은 발아 전 보리 당단백질 추출물(GEB, glycoprotein extracts from barley)과 24시간 발아 보리 당단백질 추출물(24-GEGB, glycoprotein extracts from 24 h-germinated barley), 48시간 발아 보리 당단백질 추출물(48-GEGB, glycoprotein extracts from 48 h-germinated barley)로 구분하여 −20℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 투석된 용액은 냉동건조 하였고, 얻어진 건조 분말은 발아 전 보리 당단백질 추출물(GEB, glycoprotein extracts from barley)과 24시간 발아 보리 당단백질 추출물(24-GEGB, glycoprotein extracts from 24 h-germinated barley), 48시간 발아 보리 당단백질 추출물(48-GEGB, glycoprotein extracts from 48 h-germinated barley)로 구분하여 −20℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 2 mL (1 mg/mL)과 혼합 후 실온에서 20분간 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 포도당(glucose)을 표준당으로 하여 시료의 총당 함량을 계산하였다.
대상 데이터
- 40071) 세포를 한국세포주은행(KTCC)에서 분양 받아 사용하였다. RAW 264.7 세포는 10% FBS를 함유한 DMEM 배지를 이용하여 37oC, 5% CO로 조절된 배양기에서 배양하였다.
- 도정하지 않은 2012년산 겉보리(hulled barley) 종자를 농협 하나로 마트로부터 구입하여 이물질과 손상된 곡립을 제거하기 위하여 체(2.0 mm)를 이용하여 정선한 후 흐르는 물로 세척하였다. 세척한 보리 종자는 4℃에서 48시간 동안 침지시킨 후 20℃ 배양기(incubator)에서 24, 48시간 동안 발아시켰다.
- 실험에 사용한 세포는 면역세포 중 대식세포주인 RAW 264.7(KTCC No.40071) 세포를 한국세포주은행(KTCC)에서 분양 받아 사용하였다. RAW 264.
데이터처리
- 본 실험에서 측정한 분석결과는 평균±표준편차로 표기하였으며, 실험군간의 통계학적 분석은 분산분석(analysis of variance, ANOVA)을 실시하였고, 그 결과에 따라 Duncan의 다중 범위 검정법(Duncan’s multiple range test)으로 유의성을 검정하였다(α=0.05).
이론/모형
- 발아 전후 보리 당단백질 추출물의 RAW 264.7 세포에 대한 독성 측정은 노란색 수용성 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 를 세포에 처리하여 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 테트라졸륨(tetrazolium)의 링(ring)구조가 끊어진 비수용성의 자줏빛 포마잔(formazan)으로 환원되는 MTT assay의 원리를 이용하였다(9). RAW 264.
- 발아 전후 보리 당단백질 추출물의 면역 증진능력을 확인하기 위하여 마이크로플레이트법으로 세포의 배양 상층액 중의 NO2-의 생성농도를 정량함으로써 측정하였다. 즉, RAW 264.
- 발아 전후 보리 당단백질 추출물의 분자량을 확인하기 위해 Laemmli (8)의 방법에 따라 실시하였다. Stacking gel 5%, running gel 15%의 조성으로 이루어진 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)을 제작 후 전기이동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)을 실시하고 쿠마시블루(Coomassie blue)로 염색하였다.
- 발아 전후 보리 당단백질 추출물의 중성당 및 아미노산 조성은 Na 등(7)의 방법으로 분석하였다. 중성당은 각 시료 0.
- 발아 전후 보리 당단백질 추출물의 총당 함량 분석은 페놀황산법(phenol-sulfuric acid)으로 실시하였다(6). 0.
성능/효과
- 6%)의 순으로 나타났다. 24-GEGB의 총 중성당 함량은 5515.1 pmol로 자일로스가 46.7%로 가장 많이 함유되어 있었고, 아라비노스 (35.8%), 포도당(11.6%)의 순으로 나타났으며, 48-GEGB의 총 중 성당 함량은 9175.7 pmol로 자일로스가 48.2%로 가장 많이 함유 되어 있었고, 아라비노스(36.3%), 포도당(12.2%)의 순으로 나타났다. 연구 결과 48-GEGB는 GEB에 비해 당의 함량이 1.
- GEB의 경우 6 µg/mL의 농도로 처리하였을 때 생성된 종양괴사인자-α는 대조군(200 pg/mL)과 유의적인 차이를 나타내지 않았지만, 발아가 진행될수록 비처리 대조군에 비해 종양괴사인자-α의 생성이 유의적으로 증가하였다.
- 발아 전후 보리 당단백질 추출물의 중성당 함량은 Table 2에 나타내었다. GEB의 주요 중성당은 아라비노스(arabinose), 포도당, 자일로스(xylose)로 전체 중성당 조성의 95.8%를 차지하고 있었 으며, 그 외 중성당은 5% 미만으로 낮게 나타났고, 갈락토사민 (galactosamine)과 만노스(mannose)는 확인되지 않았다. GEB의 경우 총 중성당 함량은 7457.
- 7 세포에 24-GEGB와 48-GEGB를 처리한 결과 GEB에 비해 더 높은 산화질소 II와 사이토카인(인터류킨-6, 종양괴사인자-α)을 생성하였다. 결론적으로, 보리 종자가 발아하면 종자 내 단백질, 지방질 및 당질 등의 영양성분 조성이 변하고, 그 결과 발아보리 당단백질 추출물은 외부 침입에 대해 1차 적으로 방어하는 대식세포를 자극하여 세포에 독성을 미치지 않는 범위의 면역매개물질 생성하여 면역 증진 효과를 기대할 수 있는 것으로 판단된다.
- 1에 나타내었다. 단백질 밴드 확인 결과 보리가 48시간 발아함에 따라 단백질 농도가 증가하였음을 확인할 수 있었고, 주요 밴드는 55 kDa의 크기에서 확인할 수 있었다. GEB의 분자량은 5, 20, 40, 60 kDa, 24-GEGB의 분자량은 5, 20, 40, 55, 60 kDa, 48-GEGB의 분자량은 5, 20, 40, 45, 55, 60 kDa 크기의 단백질로 나타났다.
- 이는 종자가 발아하면서 저장되어 있던 유지가 에너지원으로 이용되어지기 때문에 총 지질 함량이 감소하였다는 결과와 비슷한 경향을 나타내었다(11). 단백질 함량은 GEB가 69.7%, 24-GEGB는 66.5%, 48-GEGB은 66.44%로 발아 후 약간의 감소를 보였지만 발아시간에 따라 유의적인 변화는 없었다. Vernaza 등(12)의 연구에서 발아한 콩 단백질 추출물의 수용성 단백질 함량을 분석한 결과 발아전 62.
- 따라서 발아한 보리 당단백질 추출물은 대식세포를 활성화시켜 인터류킨-6를 생성하여 B세포의 항체생성 작용을 활성화시키는 체액성 면역(humoral immunity)에 도움을 주고, 또한 종양괴사인자-α를 생성하여 T림프구가 외부 항원을 인지하여 분비하는 생리활성 물질인 lymphokine을 분비하는데 도움을 주어 세포성 면역(cell-mediated immunity) 증강에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.
- 5%를 차지하고 있었다. 발아에 따른 총 아미노산 함량은 GEB가 168.5 mg/g, 24-GEGB가 174.1 mg/g, 48-GEGB가 209.0 mg/g으로 GEB에 비해 각각 1.03, 1.24배 아미노산 함량이 증가 하였다. Huh 등(17)의 연구에 따르면 발아시킨 콩의 아미노산 함량은 24, 48, 72시간 발아함에 따라 발아 전에 비해 각각 1.
- 보리가 발아함에 따라 단백질의 경우 45, 55 kDa 크기의 분자량을 가지는 단백질이 생성되었고, 당조성은 자일로스(48.2%)와 아라비노스(36.3%)의 조성으로 변화되는 것을 확인하였다. 미강 당단백질에 대한 선행연구에서는 당쇄(glycan)가 면역반응에 관여 한다는 결론을 얻었고(25) 다수의 연구에서 다당성분이 대식세포를 자극하여 면역반응에 관여한다는 보고(26,27)를 종합했을 때, 면역반응에 관여하는 발아보리 당단백질 중 당쇄 부분이 주요 활성부위로 추론된다.
- 7 세포에 처리 후 생성하는 산화질소 II와 사이토카인(인터류킨-6, 종양괴사인자-α) 양을 측정하여 면역 증진 효능을 예측하였다. 보리의 발아가 진행됨에 따라 당단백질 추출물의 단백질과 지방질 함량은 감소하고 총당 함량은 증가하는 추세를 확인하였다. 주요 중성당은 아라비노스, 포도당, 자일로스이며 발아함에 따라 6탄당인 포도당은 감소한 반면, 5탄당인 아라비노스와 자일로스는 증가하였다.
- 시료를 6, 25, 100 µg/mL의 농도로 세포에 처리하여 세포의 생존율을 측정한 결과 100µg/mL의 고농도에서는 6 µg/mL의 저농도보다 세포 생존율이 낮아졌지만 GEB, 24-GEGB, 48-GEGB 시료 모두 90%이상의 세포 생존율을 나타내어 대식세포 생장에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 시료를 대식세포에 각각 6, 25 µg/ mL의 농도로 처리하였을 때 GEB의 경우 각각 40.2, 212.6 pg/mL 의 인터류킨-6를 생성하였고, 24-GEGB의 경우 1159.4, 1418.4 pg/mL, 48-GEGB의 경우 1428.8, 1425.6 pg/mL의 인터류킨-6를 각각 생성하여 발아가 진행될수록 인터류킨-6의 생성이 급격하게 증가 하는 것으로 나타났다.
- 2%)의 순으로 나타났다. 연구 결과 48-GEGB는 GEB에 비해 당의 함량이 1.2배 증가하였으며, GEB에는 6탄당인 포도당이 가장 많이 함유되어 있었으나 24, 48시간 발아함에 따라서 포도당의 함량은 감소하고 5탄당인 아라비노스와 자일로스의 함량이 증가하였다. 이와 같은당 함량의 변화는 α-아밀레이스 활성과 밀접한 관계가 있는 것으로 Kim 등(16)의 연구에 따르면 발아 초기에는 종실에 함유되어 있던 sucrose나 포도당이 호흡의 기질로 이용되고, 발아가 진행되면서 α-아밀레이스 활성의 증가로 전분이 분해된다는 보고에 따라 발아시간에 따른 보리 당단백질 추출물의 경우 발아전에 비해 24시간 발아시 감소하였다가 48시간 발아하면서 중성당이 증가한 것으로 판단된다.
- β-아밀레이스의 경우에는 발아하지 않은 보리에 단백질과 결합한 상태로 있지만 발아가 시작되는 동시에 유리되어 전분을 maltose 단위로 분해하고, α-아밀레이스의 경우 보리 배유에 있는 탄수화물에 무작위로 작용하여 저분자인 dextrin, 포도당 등으로 분해 후 발아시 필요한 에너지원으로 사용된다(15). 이와 같은 결과 보리가 발아하면서 아밀레이스의 활성이 증가하여 발아시간에 따른 보리 당단백질 추출물의 총당 함량이 증가된 것으로 보인다.
- 보리의 발아가 진행됨에 따라 당단백질 추출물의 단백질과 지방질 함량은 감소하고 총당 함량은 증가하는 추세를 확인하였다. 주요 중성당은 아라비노스, 포도당, 자일로스이며 발아함에 따라 6탄당인 포도당은 감소한 반면, 5탄당인 아라비노스와 자일로스는 증가하였다. 아미노산 함량은 GEB에 비해 24-GEGB와 48-GEGB에서 각각 1.
- 2%로 발아 전 후에 따른 큰 차이는 나타나지 않았다. 지방질 함량은 GEB가 6.83%, 24-GEGB는 2.29%, 48- GEGB가 0.82%로 발아가 진행될수록 감소하였다. 이는 종자가 발아하면서 저장되어 있던 유지가 에너지원으로 이용되어지기 때문에 총 지질 함량이 감소하였다는 결과와 비슷한 경향을 나타내었다(11).
- 3%으로 보고한 것과 비교해 볼 때 보리 당단백질 추출물의 단백질 함량과 비슷한 결과를 나타내었다. 총당 함량은 GEB의 경우 2.9%, 24- GEGB는 4.7%, 48-GEGB는 9.9%로, 발아 전에 비해 24시간 발아시 1.6배, 48시간 발아시 3.4배 증가하였다. 보리 종자는 수분을 흡수하여 발아를 시작하면 배아에서 지베를린(gibberellin)이라는 식물 성장 호르몬이 호분층의 세포를 자극하여 α-아밀레이스, β-아밀레이스, 프로테이스 등의 다양한 가수분해 효소를 합성하고, 배유에 저장되어 있는 영양소를 분해해서 에너지원으로 사용한다(13,14).
- 특히 48-GEGB 의 경우 100 µg/mL의 농도에서 양성대조군인 지방질다당류와 비슷한 산화질소 II를 생성하여 발아가 진행 될수록 대식세포 활성화 효과가 증가하는 것으로 나타났다.
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