[논문]원형질체 재생을 통한 느티만가닥버섯 단핵균주 선발

오연이; 공원식; 장갑열; 신평균; 김은선; 오민지; 최인걸

doi:10.14480/jm.2015.13.3.270

원형질체 재생을 통한 느티만가닥버섯 단핵균주 선발
Selection of parental monokaryons from Korean Hypsizigus marmoreus by protoplast regeneration 원문보기

Journal of mushrooms = 한국버섯학회지, v.13 no.3, 2015년, pp.270 - 273

오연이 (고려대학교 생명공학과 대학원 생명공학과&BK21플러스) , 공원식 (농촌진흥청 국립원예특작과학원 버섯과) , 장갑열 (농촌진흥청 국립원예특작과학원 버섯과) , 신평균 (농촌진흥청 국립원예특작과학원 버섯과) , 김은선 (농촌진흥청 국립원예특작과학원 버섯과) , 오민지 (농촌진흥청 국립원예특작과학원 버섯과) , 최인걸 (고려대학교 생명공학과 대학원 생명공학과&BK21플러스)

초록
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만가닥버섯은 일본에서 가장 중요한 식용버섯이다. 그러나 배양기간이 약 85~120일로 길어서 국내에서 다른 버섯에 비해 배양이 어려운 실정이다. 이 연구에서는 만가닥버섯 표준유전체 염기서열분석을 위하여 '해미'품종으로부터 원형질체를 분리하고 재생하여 모균주의 단핵균주를 얻었다. MCM배지 및 MYG배지에서 배양되고, 균질화된 균사체는 원형질체를 얻기 위하여 Novozyme효소를 처리하였다. 원형질체 분리의 가장 높은 효율은 MCM 배지에서 이차배양이 3일된 균사체에 2.5시간 효소처리 조건이었다. 분리된 원형질체는 재생배지에서 2주 동안 배양되어 재생되었다. 재생체는 클램프로 단핵균주를 확인하고 '해미'의 모균주의 단핵균주와 클램프 유무로 친화성을 확인하였다. 분리된 모균주의 단핵균주는 짧은 배양기간을 가진 품종을 개발하기 위한 유전적 기초자료를 완성하는 표준유전체 염기분석 재료로서 사용될 예정이다.

Abstract ▼ AI-Helper

Hypsizigus marmoreus is commercially the most important edible mushroom in Japan. This mushroom is usually cultivated for a longer period (about 85~120 days) than other mushroom. In order to develop a new cultivar that has a shortened cultivation period, the genome analysis of this strain has been considered. This study aims to obtain parental monokaryotic strains reproducing 'Haemi' cultivar in Hypsizigus marmoreus for reference genome sequencing. The mycelia were cultured in MCM and MYG media for various incubation periods. Homogenized mycelia were treated with commercial cell wall degrading enzymes to maximize protoplasts production yield from Hypsizigus marmoreus. The greatest number of protoplasts was obtained from mycelia cultured in MCM media for 3 days using Novozyme enzyme. The isolated protoplasts were grown in regeneration agar media after two weeks. Regenerated colonies were picked and moved on separated dishes for microscopic observation. Neohaplonts regenerated from dikayotic strains were identified by the absence of clamp connections. We confirmed that one of monokaryotic strains is a parental strain by crossing with an original compatible strain of 'Haemi' cultivar. This parental strain will be used for reference genome sequence analysis.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이 실험에서는 만가닥버섯의 표준유전체 염기서열분석을 위한 재료로서 모균주의 단핵균주를 확보하기 위해 원형질체분리 및 재생법을 사용하였고(Chen et al, 2012), 이를 위해 두 배지조건에서 효소처리 시간 및 균사체 배양조건에 따라 고효율의 원형질체 분리 및 재생 조건을 확립하고자 수행하였다.
이 연구에서는 만가닥버섯 표준유전체 염기서열분석을 위하여 ‘해미’품종으로부터 원형질체를 분리하고 재생하여 모균주의 단핵균주를 얻었다.

제안 방법

‘해미’ 품종의 표준유전체 염기서열분석을 위해 원형질체 분리 및 재생방법을 사용하였다.
이 연구에서는 만가닥버섯 표준유전체 염기서열분석을 위하여 ‘해미’품종으로부터 원형질체를 분리하고 재생하여 모균주의 단핵균주를 얻었다. MCM배지 및 MYG배지에서 배양되고, 균질화된 균사체는 원형질체를 얻기 위하여 Novozyme효소를 처리하였다. 원형질체 분리의 가장 높은 효율은 MCM 배지에서 이차배양이 3일된 균사체에 2.
여과 후 2000 rpm, 10℃, 10분 원심분리하여 원형질체를 수집하였다(Yoo and Cha, 1993). Novozyme 효소용액을 각각 2~3시간 30분 간격으로 처리한 후, 현미경으로 관찰하였다(Fig. 2). 그 결과 MCM, YGM 액체배지에서 배양된 균사체를 2.
원형질체 분리를 위한 균사체는 2009년 개발된 느티만가닥 ‘해미’ 품종을 이용하였다. 균사체는 100 ml Mushroom Complete Media (MCM; 20% Dextrose, 0.5% MgSO₄, 0.46%KH₂PO₄, 1.0%K₂HPO₄, 2.0%Yeastextract, 2.0%Peptone)와 Malt-glucose extract-glucose(MYG; 1% Malt extract, 0.4% Yeast extract, 1% Glucose) 액체배지를 이용하여 1 L 삼각플라스크에 24℃에서 14일간 정치 배양하였다(Das and Jee, 1996). 액체배양된 균사는 호모게나이저로 20초동안 낮은 속도로 균질화된 후 다시 MCM, MYG 액체배지에 24℃에서 1~3일 배양하였다.
분리된 원형질 재생체들은 클램프 유무로 먼저 단핵균주인지 확인하고, 만가닥 ‘해미’품종의 모균주의 단핵균주(MKACC51987-8)와 교잡하여 교잡주를 배양하고 그 균사체의 클램프를 확인하였다.
, 2011). 이 유전양식을 바탕으로 모단핵균주 분리를 위하여 느티만가닥의 원형질 재 생체는 기존 해미 모균주의 단포자 MKACC51987-8와 교잡 후 클램프의 유무로 한 쪽 모균주의 단핵균주를 확인하였다. 분리된 원형질 재생체들은 클램프 유무로 먼저 단핵균주인지 확인하고, 만가닥 ‘해미’품종의 모균주의 단핵균주(MKACC51987-8)와 교잡하여 교잡주를 배양하고 그 균사체의 클램프를 확인하였다.
분리된 원형질체는 재생배지에서 2주 동안 배양되어 재생되었다. 재생체는 클램프로 단핵균주를 확인하고 ‘해미’의 모균주의 단핵균주와 클램프 유무로 친화성을 확인하였다. 분리된 모균주의 단핵균주는 짧은 배양기간을 가진 품종을 개발하기 위한 유전적 기초자료를 완성하는 표준유전체 염기분석 재료로서 사용될 예정이다.
6M sucrose)에서 30℃, 2~3시간 30분 간격으로 처리하였다. 효소처리된 균사체는 현미경으로 관찰하여 원형질체가 분리되었는지 확인하였다. 균사체와 원형질체를 분리하기 위해 0.

대상 데이터

원형질체 분리를 위한 균사체는 2009년 개발된 느티만가닥 ‘해미’ 품종을 이용하였다.

성능/효과

그 결과 MCM, YGM 액체배지에서 배양된 균사체를 2.5시간 효소용액처리 한 것이 모두 원형질체 분리효율이 높았으며, 두 배지 중 MCM배지가 3.6×107 protoplasts/ml으로 가장 분리효율이 높았다(Table 1).
6×10⁷ protoplasts/ml으로 가장 분리효율이 높았다(Table 1). 또한, 원형질체분리를 위한 이차 균사체배양조건을 알아보기 위해 배양기간을 1, 3, 5일을 배양하여 같은 효소용액에 원형질체를 분리한 결과 MCM배지에서 배양된 균사체는 3일에서 많은 원형질체가 분리되었고, YGM배지에서는 1일 배양한 것이 분리효율이 높았다. 가장 원형질체가 많이 분리되는 조건은 MCM배지에서 3일 배양된 것이었다.
MCM배지 및 MYG배지에서 배양되고, 균질화된 균사체는 원형질체를 얻기 위하여 Novozyme효소를 처리하였다. 원형질체 분리의 가장 높은 효율은 MCM 배지에서 이차배양이 3일된 균사체에 2.5시간 효소처리 조건이었다. 분리된 원형질체는 재생배지에서 2주 동안 배양되어 재생되었다.
원형질체를 재생하기 위해 0.6 M sucrose을 첨가한 MCM 고체배지에 얻어진 원형질체를 100 µl씩 넣고 도말하고, 오버레이배지는 MCM 고체배지를 만든 후 즉시 65℃에서 액체상태로 유지하여 원형질체가 도말된 배지 위에 덮어서 24℃에서 14일 이상 배양하였고, 배양된 콜로니들의 개수를 확인하여 재생효율을 측정한 결과, 원형질체 재생은 원형질체 분리와 달리 MCM배지보다 MYG배지에서 분리한 원형질체가 재생효율이 높았다(Table 3).

후속연구

재생체는 클램프로 단핵균주를 확인하고 ‘해미’의 모균주의 단핵균주와 클램프 유무로 친화성을 확인하였다. 분리된 모균주의 단핵균주는 짧은 배양기간을 가진 품종을 개발하기 위한 유전적 기초자료를 완성하는 표준유전체 염기분석 재료로서 사용될 예정이다.
이 모균주의 단핵균주는 만가닥 ‘해미’품종의 표준유전체 염기서열분석에 사용될 예정이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	느티만가닥버섯은, 접종 후 수확까지 몇 일이 소요되는가?	느티만가닥버섯(Hypsizigus marmoreus)은 일본에서 가장 많이 재배되는 버섯 중 하나이며, 우리나라에서는 상품명으로 백만송이, 백일송이로 판매되는 불리는 식용버섯으로 접종 후 수확하기까지 85~120일정도 소요된다. 가을철 느릅나무 등의 말라 죽은 활엽수나 그루터기에서 다발로 무리를 지어 자라며, 버섯은 긴 대와 둥근 단추모양 또는 반구모양의 갓으로 구성된다.
	우리나라에서 느티만가닥버섯은 어떤 상품명으로 불리나?	느티만가닥버섯(Hypsizigus marmoreus)은 일본에서 가장 많이 재배되는 버섯 중 하나이며, 우리나라에서는 상품명으로 백만송이, 백일송이로 판매되는 불리는 식용버섯으로 접종 후 수확하기까지 85~120일정도 소요된다. 가을철 느릅나무 등의 말라 죽은 활엽수나 그루터기에서 다발로 무리를 지어 자라며, 버섯은 긴 대와 둥근 단추모양 또는 반구모양의 갓으로 구성된다.
	느티만가닥버섯은 어떻게 구성되는가?	느티만가닥버섯(Hypsizigus marmoreus)은 일본에서 가장 많이 재배되는 버섯 중 하나이며, 우리나라에서는 상품명으로 백만송이, 백일송이로 판매되는 불리는 식용버섯으로 접종 후 수확하기까지 85~120일정도 소요된다. 가을철 느릅나무 등의 말라 죽은 활엽수나 그루터기에서 다발로 무리를 지어 자라며, 버섯은 긴 대와 둥근 단추모양 또는 반구모양의 갓으로 구성된다. 초기의 갓 표면은 짙은 크림색을 띠다가 자라면서 차차 옅어지며 평평해 진다.

참고문헌 (14)

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