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문제 정의
- 이외에도 적포도주나 생체 귀지 (cerumen)에 함유된 MSM 분석을 위해 silica fused Stabilwax-DA 컬럼을 사용하여 GC-MS 분석법으로 보고된 적이 있지만 이들 분석방법은 식이보충제로 사용되는 MSM 분석으로 사용되기는 편리하지 않아 적절하지 않다 [11,12]. 따라서 본 연구에서는 MSM 기능성원료를 이용하여 다양한 제형으로 만들어져 판매되고 있는 건강기능식품을 대상으로 Association of Official Analytical Chemists (AOAC) 가이드라인 [10]의 검증절차에 따라 적합성, 최적성, 안정성을 고려한, 편리하면서도 최적의 검증된 분석 방법을 개발하여 식이보충제 MSM의 기준 및 규격관리와 관련된 중요자료로 활용하고자 하였다 [13].
- 본 연구에서는 MSM 식이보충제로부터 지표성분인 MSM을 GC-FID로 간편하게 분석하는 방법을 개발하였고, AOAC 가이드라인 [10]에서 제안하는 성능특성으로 본 분석법을 검증 하였다. 그 결과 선택성에서 분리능은 5.
제안 방법
- 3개의 표본시료 (MSM1, MSM2, MSM3)에 대하여 각각의 함량측정값의 1배, 2배 및 3배가 되도록 일정량의 MSM 표준용액을 첨가하였고, 5회 반복실험을 통하여 평균 회수율을 측정하였다. 그 결과 Table 6에서 보여주고 있는 바와 같이, 3개의 표본시료에서의 회수율이 각각 96.
- 짧은 시간 내에 동일한 분석자, 시약, 장비, 기구 등 조건이 동일하게 유지되는 상태에서 서로 다른 기질, 농도, 시간에서 동시 반복을 수행하였다. 5번의 반복실험을 통해 얻어진 값으로 다양한 반복 표준 편차를 구하고 허용범위 결정은 질량 백분율 (mass fraction, C)을 RSDr = C-0.15의 식에 따라 결정하였다. 이로부터 계산된 값을 측정된 반복성의 RSDr 값과 HORRATr 공식 [10]에 의해 비교하여 0.
- 검체량의 변화에 대한 반복 정밀성을 확인하기 위하여 표본 시료 MSM1을 3개의 농도 (616.1 mg/g×1배, 2배 및 3배로 늘리고 각각에 대해서 5회 반복 측정했다.
- 국내 유통 중인 MSM 보충제에 대하여 전체 시료를 대표할수 있는 서로 다른 속성 (제형, 원료특성 등)의 3개 표본시료 (MSM1, MSM2, MSM3)을 선정하여 분석법 검증을 수행했으며, 시료의 MSM 성분량과 부원료의 정보는 Table 2과 같다.
- 기능 (지표)성분을 분석하기 위해 불꽃이온화검출기 (flame ionization detector, FID)가 달린 가스크로마토그래피 6890 기기 (Agilent Tech., CA, USA)를 사용하였으며, 컬럼은 DB-1 capillary column (0.32 mm I.D. × 30 m, 0.25 µm, dimethylpolysiloxane, Agilent Tech., CA, USA)을 사용하였다.
- 분석 시간의 변화에 대한 반복정밀성을 확인하기 위하여 균질화시킨 시료 MSM1을 4°C 냉장실에 보관하면서 0h, 24h, 48h마다 시험조작을 5회 반복 실험하였다.
- 분석법 검증실험의 선택성을 확인하기 위하여 MSM 표준품과 시료에서의 분리도 및 머무름 시간을 확인하였다. Fig.
- 서로 다른 기질의 표본시료에 대하여 최적의 분리능을 결정 하기 위해서 AOAC 가이드라인 [10]의 신뢰도 특성 (reliabiity characteristics)에서 제안하고 있는 정확성, 반복정밀성, 측정불확도, 재현정밀성, 중간 정밀성, 정량한계, 검출한계 등을 제시하여 표현하였다.
- 선정된 표본시료에서 잔존하는 방해물질 (interference)을 제거함과 동시에 지표 (기능)성분을 효과적으로 추출할 수 있는 방법을 제시하며, 크로마토그래피를 이용하여 최적의 상태로 정량화 할 수 있는 정도, 즉, 분리능으로 선택성을 평가 하였다.
- 표준용액을 이용하여 표본시료가 포함될 수 있는 농도범위를 선정하고 농도와 기기 반응 시그널간의 함수 관계를 그래프로 나타내었다. 선형성의 적절성을 판단하기 위해서 결정 계수 (coefficient of determination)를 나타내는데 본 연구에서는 AOAC 가이드라인 [10]에서 제안하고 있는 결정계수가 0.99 이상인지를 확인하였다.
- 시료 기질변화에 대한 반복 정밀성을 확인하기 위하여 서로 다른 기질을 가지고 있는 표본시료 3개 (MSM1, MSM2, MSM3)를 각각 5회 반복 실험하였다. 그 결과 Table 4에서 보여주고 있는 바와 같이, MSM 함량이 MSM1 시료에서는 61.
- 시료가 전체 시험법을 거쳐 회수되는 백분율을 보았으며, 표준물질 첨가법에 따라 단일 분석용액에 대해 측정하고 같은 수준 및 원래 수준의 2배 또는 3배의 표준분석물을 추가하여 확인하였다.
- 15의 식에 따라 결정하였다. 이로부터 계산된 값을 측정된 반복성의 RSDr 값과 HORRATr 공식 [10]에 의해 비교하여 0.5~2.0 사이에 존재할경우 동일한 조건에서의 반복실험에 문제가 없는지를 확인 하였다.
- 짧은 시간 내에 동일한 분석자, 시약, 장비, 기구 등 조건이 동일하게 유지되는 상태에서 서로 다른 기질, 농도, 시간에서 동시 반복을 수행하였다. 5번의 반복실험을 통해 얻어진 값으로 다양한 반복 표준 편차를 구하고 허용범위 결정은 질량 백분율 (mass fraction, C)을 RSDr = C-0.
- 표준용액 7개의 농도로 적절히 희석하여 10.0, 25.0, 50.0, 100.0, 200.0, 400.0, 800.0 µg/mL 농도에 대한 직선성을 검토했으며, 시험시 나타날 수 있는 오차범위를 확인하기 위하여각 농도에 대해서 3회 반복 실험을 수행했다.
- 표준용액을 이용하여 표본시료가 포함될 수 있는 농도범위를 선정하고 농도와 기기 반응 시그널간의 함수 관계를 그래프로 나타내었다. 선형성의 적절성을 판단하기 위해서 결정 계수 (coefficient of determination)를 나타내는데 본 연구에서는 AOAC 가이드라인 [10]에서 제안하고 있는 결정계수가 0.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, 메탄올은 Merck사 (Darmstadt, Germany)로부터 HPLC급을 구입하여 사용하였다. 본 연구에서 사용한 시료는 국내 대형 마트에서 직접 구입했으며, 제형과 원료형태에 따라 MSM1, MSM2 및 MSM3로 구분하여 사용하였다.
-
3. 시험용액의 조제
제형이나 기질이 다른 3개의 표본시료 (MSM1, MSM2, MSM3)를 대상으로 캡슐제는 캡슐을 제거한 후 균질화기로 완전히 균질화시키며, 정제는 막자사발을 이용하여 완전히 분쇄한 후 균질화기기로 균질화시킨 것을 사용하였다
. 그리고 시료 일정량을 100 mL 용량플라스크에 취하고 내부표준 용액 1 mL를 넣은 후 메탄올 50 mL를 넣은 후 마개를 닫고 50°C에서 10분간 초음파추출 한다. - , CA, USA)을 사용하였다. 캐리어 가스는 질소를 사용하였고, 유속은 분당 1.0 mL로 분석했으며 기타 분석조건은 Table 1과 같다.
- 표준물질인 MSM과 내부표준물질 (IS)인 디에틸렌글리콜 메틸에테르 (diethylene glycol methyl ether)는 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, 메탄올은 Merck사 (Darmstadt, Germany)로부터 HPLC급을 구입하여 사용하였다. 본 연구에서 사용한 시료는 국내 대형 마트에서 직접 구입했으며, 제형과 원료형태에 따라 MSM1, MSM2 및 MSM3로 구분하여 사용하였다.
데이터처리
- 검출한계 및 정량한계를 구하기 위하여 표본시료를 분석한 크로마토그램에서 기능 (지표)성분이 위치하는 곳의 노이즈(nosie)값을 10회 측정값으로부터 표준편차를 구하고 3배를 더한 값을 검출한계, 10배를 더한 값을 정량한계로 하였다. 그 결과 검출한계는 0.
성능/효과
- 1%로 확인 되었다. 5회 반복 측정을 통해 확인한 함량 측정값을 이용하여 허용범위를 확인한 결과, 시간별 상대표준편차와 intra-day RSD%가 모두 허용범위를 만족함을 알 수 있었다 [10]. 따라서 동일한 조건에서 분석시간을 달리하더라도 본문에서 제시하는 시험방법의 반복정밀성은 문제가 없다는 것을 확인할 수 있었다.
- 1 mg/g×1배, 2배 및 3배로 늘리고 각각에 대해서 5회 반복 측정했다. 그 결과 Table 3에서 보여주고 있는 바와 같이, 표본시료에서의 MSM1 함량은 1배로 증량할 경우 61.6%, 2배에서 59.8%, 3배에서는 60.4%로 나타났으며, 평균 MSM 함량은 60.6%로 확인되었다. 또한 각각의 증량에 대한 상대표준편차는 1.
- 시료 기질변화에 대한 반복 정밀성을 확인하기 위하여 서로 다른 기질을 가지고 있는 표본시료 3개 (MSM1, MSM2, MSM3)를 각각 5회 반복 실험하였다. 그 결과 Table 4에서 보여주고 있는 바와 같이, MSM 함량이 MSM1 시료에서는 61.6%, MSM2 시료에서는 47.9%, MSM3 시료에서는 49.6%로 나타났다. 이러한 결과 값을 이용하여 허용범위를 확인한결과 3개의 표본시료에서 모두 0.
- C 냉장실에 보관하면서 0h, 24h, 48h마다 시험조작을 5회 반복 실험하였다. 그 결과 Table 5에서 보는 바와 같이, MSM 함량이 0h에서는 61.6%, 24h에서는 60.6% 및 48h에서는 60.7%로 나타났으며, 상대표준편차는 각각 0h은 1.0%, 24h과 48h은 1.1%로 확인 되었다. 5회 반복 측정을 통해 확인한 함량 측정값을 이용하여 허용범위를 확인한 결과, 시간별 상대표준편차와 intra-day RSD%가 모두 허용범위를 만족함을 알 수 있었다 [10].
- 3개의 표본시료 (MSM1, MSM2, MSM3)에 대하여 각각의 함량측정값의 1배, 2배 및 3배가 되도록 일정량의 MSM 표준용액을 첨가하였고, 5회 반복실험을 통하여 평균 회수율을 측정하였다. 그 결과 Table 6에서 보여주고 있는 바와 같이, 3개의 표본시료에서의 회수율이 각각 96.7~97.1%, 96.6~97.3%, 96.8~97.2%로 나왔으며, 상대표준편차는 0.7~2.2%, 1.4~2.5%, 1.4~2.1%로 나타났다. 이러한 결과는 AOAC 가이드라인 [10]에서 제시하고 허용범위에 모두 포함되는 것으로서 동 시험법에 대하여 서로 다른 기질을 가진 시료에 대하여 정확성에 문제가 없다는 것을 알 수 있었다.
- 그 결과 검출한계는 0.29 µg/mL이며, 정량한계는 0.97 µg/mL 로 나타났다 (Fig. 3).
- 그 결과 선택성에서 분리능은 5.8로 가이드라인에서 요구하는 1.0 이상을 만족했으며, 직선성은 7개의 농도범위 10.0~800.0 µg/mL에서 결정계수가 0.9997으로 확인되었다.
- 0 µg/mL 농도에 대한 직선성을 검토했으며, 시험시 나타날 수 있는 오차범위를 확인하기 위하여각 농도에 대해서 3회 반복 실험을 수행했다. 그 결과 직선성 결정계수는 0.9997로 AOAC 가이드라인 [10]에서 요구하는 결정계수 0.95 이상을 만족함을 확인하였다 (Fig. 2)
- 그래서 검체 증량과 기질변화에 대한 반복정밀성, 고농도에서의 회수율 시험등을 수행하지 않았고, GC 분석조건에서는 분석 온도를 190°C로 일정하게 유지함으로서 시험액으로부터 오염물질이 컬럼에 침적되는 현상을 충분히 고려하지 않았다.
- 1 mg/g×1배와 2배는 가이드라인 허용범위를 만족하였으나, 3배로 증량할 경우 허용범위를 벗어나는 것을 확인하였다. 그리고 기질에 대한 반복 정밀성을 확인하기 위해 3개의 표본시료를 대상으로 MSM을 5회 반복측정한 결과 상대 표준편차가 각각 1.0%, 1.1%, 1.1%로 확인되었고 허용범위인 0.3~1.1%을 모두 만족했다. 분석시간별 반복정밀성 시험에서는 표준시료 MSM1을 대상으로 0h, 24h, 48h 반복측정한 결과, 시간별 상대표준편차와 intra-day 상대표준편차가 모두 허용범위인 0.
- 9997으로 확인되었다. 그리고 정확성을 확인하기 위하여 3개의 표본시료 (MSM1-3)에서 산출된 함량 측정값을 이용하여 허용범위를 설정한후 따로 표준물질 첨가법에 따라 농도별 회수율을 확인한 결과 각각 96.7~97.1%, 96.6~97.3%, 96.8~97.2%를 보여주어 가이드라인의 허용범위를 모두 만족함을 알 수 있었다. 또한 반복정밀성을 확인하기 위하여 MSM1의 표본시료를 각각 616.
- 5회 반복 측정을 통해 확인한 함량 측정값을 이용하여 허용범위를 확인한 결과, 시간별 상대표준편차와 intra-day RSD%가 모두 허용범위를 만족함을 알 수 있었다 [10]. 따라서 동일한 조건에서 분석시간을 달리하더라도 본문에서 제시하는 시험방법의 반복정밀성은 문제가 없다는 것을 확인할 수 있었다.
- 따라서 시료 검체량의 변화에 따른 반복정밀성은 시료량의 변화를 616.1 mg/g×1배 및 2배까지 늘리더라도 동일한 조건에서의 반복실험에 문제가 없다는 것을 알 수 있었으나, 시료량의 변화를 3배로 했을 경우에는 AOAC에서 제안하는 허용범위를 초과하는 것으로 보아 반복정밀성은 시료량의 영향을 받는다는 것을 알 수 있었다.
- 또한 반복정밀성을 확인하기 위하여 MSM1의 표본시료를 각각 616.1 mg/g×1배, 2배, 3배로 증량하여 5회 반복측정한 결과, 616.1 mg/g×1배와 2배는 가이드라인 허용범위를 만족하였으나, 3배로 증량할 경우 허용범위를 벗어나는 것을 확인하였다.
- 1 전체에서 MSM 성분과 IS의 머무름시간이 서로 일치함을알 수 있다. 또한 분리능 (resolution, Rs)을 확인하기 위하여 시료용액 중의 두 개의 피크의 머무름시간 t1과 t2의 분리 시간적 거리와 두 개의 피크 폭 W1과 W2를 조사한 결과 5.8로 나타남으로서 AOAC 가이드라인 [10]에서 제시하는 최소 1.0 이상의 분리능을 가짐을 확인할 수 있었다.
- 본 분석법의 검출한계와 정량한계 결과를 최근에 발표된 복합 식이보충제 중 MSM을 GC-FID로 분석한 Satínský°[9] 등의 실험결과와 (검출한계: 7.1 µg/mL, 정량한계: 23.5 µg/mL) 비교해 볼 때 상당히 좋은 결과임을 보여주고 있다.
- 1%을 모두 만족했다. 분석시간별 반복정밀성 시험에서는 표준시료 MSM1을 대상으로 0h, 24h, 48h 반복측정한 결과, 시간별 상대표준편차와 intra-day 상대표준편차가 모두 허용범위인 0.3~1.1%로 만족함을 알 수 있었으며, 검출한계와 정량한계는 각각 0.29 µg/mL와 0.97 µg/mL으로 확인되었다.
- 1%이였다 [10]. 산출된 허용범위를 이용하여 각 표본시료의 상대표준편차가 허용 범위에 포함되는지를 확인한 결과 MSM1은 1.0%, MSM2와 MSM3은 1.1%로 나타남에 따라 서로 다른 기질을 가지고 있는 표본시료의 반복정밀성은 동일한 조건에서의 문제가 없다는 것을 확인할 수 있었다.
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