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문제 정의
- 이렇듯 블루베리에 대한 최근의 연구동향은 영양학적 내용과 함께 항산화 작용, 항암작용, 피부 미백작용에 관한 연구가 대부분으로 항염 활성에 대한 국내 연구는 진행된 사례가 거의 없다. 따라서 본 연구에서는 국내산 블루베리 착즙액의 성분 분석 및 총 폴리페놀의 함량에 따른 항염증 효과의 검증을 통해 추후 피부에 적용할 수 있는 항염증 개선 화장품 소재 개발의 기초 자료로 활용하고자 한다.
- 본 연구에서는 국내에서 생산되는 블루베리 주스의 기능적 특성을 조사하기 위하여 HPLC 분석을 통해 지표성분을 검출및 총 폴리페놀 함량을 구하였으며, 항염증 평가를 위해 RAW 267. 4 세포주에서의 NO 감소 효과를 측정하였다.
제안 방법
- 본 연구에서는 국내에서 생산되는 블루베리 주스의 기능적 특성을 조사하기 위하여 HPLC 분석을 통해 지표성분을 검출및 총 폴리페놀 함량을 구하였으며, 항염증 평가를 위해 RAW 267. 4 세포주에서의 NO 감소 효과를 측정하였다. HPLC 분석결과 cyanidin-3,5-di-O-glucoside, cyanidin-3-galactoside, cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3-O-rutinoside, delphinidin, cyanidin, pelargonidin, malvidin이 검출되었다.
- 수용액 (2:98, w/v)을 각각 1:1:1 비율로 섞어서 암실에서 50분 동안 반응을 시켰다. UV-spectrophotometer를 이용하여 750 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 기준 물질로는 gallic acid를 사용하여 GAE 의 양으로 표시하였다.
- 본 실험에서는 NO 대사과정에서 발생하는 nitrite (NO2−)를 측정함으로써 NO의 양을 간접적으로 결정하였으며 결과는 Fig. 3에 나타내었다.
- 불순물 제거를 위해 추출물을 syringe filter (0.45 µm)를 사용하여 여과하고, 35℃에서 감압 농축하여 ethanol을 선택적으로 증발시켰다.
- 블루베리 추출물 동결건조 분말의 안토시아닌 조성은 HPLC (SPD-20A, SIMADZU Co., Japan)을 이용하여 분석하였다. Column은 C18 column (PRONTOSIL, 4.
- 블루베리를 착즙기로 착즙하여 각각 20 µg/mL, 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL, 1000 µg/mL 농도범위에서 세포 독성을 검사하였다.
- 0 mL/min, 시료 주입량은 20 µL이었다. 안토시아닌의 지표성분은 cyanidin-3, 5-di-O-glucoside, cyanidin-3-O-galactoside, cyanidin-3-O-glucoside, cyanidin-3-O-rutinoside, delphinidin, cyanidin, pelargonidin, malvidin 등의 8종을 Sigma-Aldrich로부터 구입하였고 HPLC chromatogram에서 retention time의 비교로 분석하였다.
- 총 폴리페놀 함량을 측정하기 위해 Sluis 등 [14]의 방법을 변형하여 사용 하였으며, 측정방법은 2 M Folin-Ciocalteu phenol 시약 (Sigma-Aldrich, USA)을 10배 희석하여 블루베리 추출물과 2% Na2CO3 수용액 (2:98, w/v)을 각각 1:1:1 비율로 섞어서 암실에서 50분 동안 반응을 시켰다. UV-spectrophotometer를 이용하여 750 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- Column은 C18 column (PRONTOSIL, 4.6×250 mm)을 사용하였으며, 온도는 30ºC, 검출 파장은 546 nm에서 검출하였다.
- RAW264.7 세포주는 한국세포주 은행에서 분양 받았으며, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배지에 10% fecal bovine serum (FBS)과 1% streptomycin/penicillin을 첨가하여 37ºC 온도에서 5% CO2 상태로 배양하였으며, 세포가 바닥 면적의 90% 정도까지 자란 상태에서 계대 배양을 하였다.
- 본 실험에 사용한 블루베리는 담양군 소재 블루베리 향토사업단 출하공장에서 구입하였으며, 항염 활성 측정에 사용된 블루베리 시료는 블루베리 원물 100 g을 착즙기 (Hurom HEDBF04, Korea)로 착즙 후 10,625 g에서 7분간 원심분리하고 상등액을 취하여 여과 (Sartorius 0.45 µm) 하고 동결건조 하여 사용하였다.
- 이동상 용매 A는 HCOOH:H2O (10:90, v/v), 이동상 용매 B는 HCOOH:H2O:acetonitrile (10:60:30, v/v/v)를 사용하였고, 유속은 1.0 mL/min, 시료 주입량은 20 µL이었다.
데이터처리
- 대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검증은 t-test 사용하였으며, p<0.05 이하인 경우 유의하다고 판정하였다.
- 모든 결과값은 세 번 반복실험 후 통계처리하였으며, 실험에 의해 얻어진 값들의 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- 1% N-(1-naphthy1) ethylene-diamine(dihydrochloride in distilled water) 50 µL를 혼합하고 10 min 동안 반응시킨 후 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 안정된 최종산물인 nitrite를 NO 생성의 indicator로 사용하여 Park [15] 등이 제시한 방법에 따라 측정하였다.
성능/효과
- 4 세포주에서의 NO 감소 효과를 측정하였다. HPLC 분석결과 cyanidin-3,5-di-O-glucoside, cyanidin-3-galactoside, cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3-O-rutinoside, delphinidin, cyanidin, pelargonidin, malvidin이 검출되었다. 블루베리 주스의총 폴리페놀 함량은 블루베리 착즙액 0.
- MTT assay 를 이용하여 세포독성을 조사한 결과 20~1000 µg/mL의 실험 전체 농도범위에서 48 h 지난 후 세포독성은 나타나지 않았으며, 항염 평가에서는 블루 베리 주스 20~1000 µg/mL + LPS 200 ng 농도범위에서 농도의존적으로 NO 생성이 감소함을 확인하였다.
- 7 세포에 대한 NO 생성이 억제되는 것을 확인했던 결과와 유사하다 [20]. 본 연구에서는 기존의 연구와 달리 ethanol 추출방법을 사용 하지 않고 블루베리를 착즙하여 상등액만을 취했기 때문에총 폴리페놀의 함량이 낮아 다른 연구의 결과보다 높은 농도에서 NO 생성이 억제된 것으로 판단된다. 추후 효소를 이용한 추출 방법이나 microwave 방법 등 추출 방법을 달리하여 기존의 연구 결과와 비교해 볼 필요가 있다고 판단된다.
- 블루베리 착즙액을 RAW 264.7 세포주에 처리한 후 염증유발 물질인 LPS 200 ng 처리하였을 때, 블루베리 20 µg + LPS 200 ng에서는 NO 생성이 거의 감소하지 않았고 블루베리 500 µg + LPS 200 ng sample과 블루베리 1 mg + LPS 200 ng에서는 NO 생성이 약간 감소되었다.
- 1과 Table 2에 나타내었다. 실험결과 13.28, 14.38, 15.09, 15.85, 16.76, 20.08, 24.83, 31.48 분에서 각각 cyanidin3,5-di-O-glucoside, cyanidin-3-galactoside, cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3-O-rutinoside, delphinidin, cyanidin, pelargonidin, malvidin이 검출되었다. 지표 물질의 농도 대비 검출 면적을 이용하여 보정곡선을 그렸고, 보정식은 각각 y =45839916x − 3530684, y = 47181376.
- 9530이다. 이와 같은 보정식을 이용하여 블루베리 추출물 유래 지표물질의 함량을 계산하였으며, 본 실험에서 블루베리 추출물의 성분을 확인한결과 delphinidin, cyanidin, pelargonidin, malvidin 기본형태의 화합물과 함께 당이 결합된 형태인 cyanidin-3, 5-di-O-glucoside, cyanidin-3-O-galactoside, cyanidin-3-O-glucoside, cyanidin-3-O-rutinoside가 있는 것으로 확인되었으며, 실험 결과는 Table 2에 나타내었다.
- 지표 물질의 농도 대비 검출 면적을 이용하여 보정곡선을 그렸고, 보정식은 각각 y =45839916x − 3530684, y = 47181376.3x − 5776396.5, y =42425078x − 384566.5, y = 45839916 − 3530684, y =97621784x − 2787021, y = 110721222.8571x − 15591528, y =36397028.5714x − 5508022, y = 94087548.2857x − 24907803.5이었으며, 신뢰도값 (R2)은 각각 0.9842, 0.9939, 0.9885, 0.9983, 0.9995, 0.9836, 0.9930, 0.9530이다.
후속연구
- 15 mg/mL의 폴리페놀 함량을 확인하였는데, 잎이 열매보다 비교적 높은 폴리페놀 함량을 나타내는 이유는 잎에 다량으로 포함되어 있는 클로로겐산 (chlorogenic acid) 때문으로 추정된다. 본 실험에서 사용한 총 폴리페놀 분석방법은 블루베리 열매의 추출 방법 측면에서 보았을 때 블루베리 열매 착즙액의 상등액 기준이므로 추후 블루베리의 추출방법을 달리 하거나 미생물 발효를 통한 방법을 이용하여 총 폴리페놀 함량을 다시 제시할 필요가 있다고 생각된다.
- 이와 같은 결과는 이와 같은 결과는 블루베리속에 포함되어 있는 폴리페놀 성분인 레스베라트롤이 HT-29 세포의 MTT assay 를 통한 세포생존율 측정에서 50 µM, 100 µM, 200 µM 농도에서 48시간 동안 HT-29 세포의 증식이 억제 되었던 연구 결과와 유사하다 [11]. 추후 실험시간을 각각 달리하거나 다른 세포에서의 생존성도 조사할 필요가 있다고 사료된다.
- 본 연구에서는 기존의 연구와 달리 ethanol 추출방법을 사용 하지 않고 블루베리를 착즙하여 상등액만을 취했기 때문에총 폴리페놀의 함량이 낮아 다른 연구의 결과보다 높은 농도에서 NO 생성이 억제된 것으로 판단된다. 추후 효소를 이용한 추출 방법이나 microwave 방법 등 추출 방법을 달리하여 기존의 연구 결과와 비교해 볼 필요가 있다고 판단된다.
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