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문제 정의
- 본 연구는 해양생물 유래 피부건강 기능성의 소재를 발굴할 목적으로 굴 단백질의 효소 가수분해물이 주름 개선에 미치는 효과를 조사하였다. 굴 단백질 가수분해물의 항산화 효과를 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 및 2,2'- azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) 라디칼 소거능으로 확인하였으며, collagenase 저해 활성을 측정하여 그 효과를 확인하였다.
가설 설정
- 1)The IC50 calculated as the average value of experiments at least three times.
제안 방법
- 10,000 rpm에서 10분간 원심분리(MICRO17TR, Hanil Science Industrial, Incheon, Korea) 하고 상등액을 취하여 실린더형 여과기(0.22μm)로 여과한 후, 유리아미노산 분석기(Biochrom 20, LKB Biochrom Ltd., Cambridge, UK)로 분석하였다.
- 의 농도로 분주한 후 24시간 동안 FBS free 배지로 안정화하고 배지에 시료를 녹여 세포에 처리하였다. 24시간 동안 배양한 다음 배양 상등액을 취해 procollagen type 1 C-peptide EIA kit(Takara Bio Inc., Shiga, Japan)으로 procollagen 함량을 측정하여 콜라겐의 생성 정도를 비교하였다. 배양액 내의 총 단백질 함량을 Lowry 법(20)에 따라 측정하여 콜라겐의 생성량을 보정하였다.
- Adenosine은 식품의약안전처 고시형 주름 개선 원료로 굴 가수분해물과 비교하기 위하여 함께 측정하였다(Table 3). Adenosine 5 mg/mL의 농도와 굴 가수분해물 50 mg/ mL에서 collagenase 저해 활성은 비슷하였고, 굴 가수분해물 100 mg/mL의 농도에서는 81.
- MMP-1 효소 활성 저해능은 procollagen 함량 측정과 같은 방법으로 세포를 배양하여 MMP-1 human biotrak ELISA system(GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, UK)으로 측정하였다.
- 인간 피부 섬유아세포주인 CCD986sk를 Iscove's modified Dulbecco's medium(IMEM) 배지로 배양하였다. 각 세포주는 배양 플레이트에 배양하여 1주일에 2~3회 계대하였으며, 배지는 10% FBS 배지를 함유한 성장배지를 이용하였다. 세포주는 95% humidity, 5% CO2와 35°C로 조절된 항온기에서 배양하였으며, 배지는 2일에 한 번씩 교환하였다.
- 굴 가수분해물과 분자량 분획물의 collagenase 활성 저해능은 EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay kit(D12054, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하였다. Kit 시약은 정제된 효소를 이용하여 세포나 조직 용해물에서 collagenase 활성을 측정하는 high-throughout 형식의 활성 저해 효과를 선별하는 방법으로, 형광 표지자인 DQ gelatin conjugate에 효소가 작용할 때 발현되는 형광량을 측정하는 방법이다.
- 굴 가수분해물과 분획물의 피부세포에 주름 개선 효능을 확인하기 위하여 먼저 인간 피부 섬유아세포인 CCD986sk를 통해 독성시험을 실시하였다(Table 4). 먼저 세포를 웰당 2×103 농도로 96 웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 안정화한 후 굴 가수분해물은 최종농도가 각각 5 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL 및 100 μg/mL로, 굴 가수분해 분획물은 1 μg/mL, 10 μg/mL 및 50 μg/mL의 농도가 되도록 배지에 혼합하여 배양하였다.
- 굴 가수분해물은 한외여과막을 통해 분자량별로 분획하였다. 한외여과는 10,000 Da 이상, 3,000~10,000 Da, 1,000~3,000 Da 및 1,000 Da 미만과 5,000 Da 미만의 분획물로 분리하였으며, 분획은 분자량에 따른 여과막을 장착한 한외 여과기(Stirred Ultrafiltration Cells 8200, Millipore Corporation, Darmstadt, Germany)를 사용하였다.
- 굴 단백질 가수분해물의 항산화 효과를 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 및 2,2'- azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) 라디칼 소거능으로 확인하였으며, collagenase 저해 활성을 측정하여 그 효과를 확인하였다.
- 굴 단백질 가수분해물의 항산화 효과를 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 및 2,2'- azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) 라디칼 소거능으로 확인하였으며, collagenase 저해 활성을 측정하여 그 효과를 확인하였다. 그리고 굴 가수분해물을 분자량 크기별로 분획하여 분자량의 크기에 따른 인간 피부 섬유아세포의 procollagen 생성능과 matrix metalloproteinase-1(MMP-1) 활성 저해능을 측정하여 주름 개선에 미치는 효과를 비교하였다.
- 마쇄 굴의 2배의 물을 넣고, 단백질 분해 효소인 Protamex를 생굴 무게의 1%가 되도록 넣어 2시간 동안 40°C에서 가수분해 한 다음, 100°C에서 30분간 가열하여 효소를 불활성화 하였다.
- 먼저 세포를 웰당 2×103 농도로 96 웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 안정화한 후 굴 가수분해물은 최종농도가 각각 5 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL 및 100 μg/mL로, 굴 가수분해 분획물은 1 μg/mL, 10 μg/mL 및 50 μg/mL의 농도가 되도록 배지에 혼합하여 배양하였다.
- 섬유아세포에 대한 독성 여부를 알아보기 위하여 세포를 96웰 플레이트에 1×104 cells의 농도로 분주하고 24시간 동안 안정화하였다.
- 세포주는 95% humidity, 5% CO2와 35°C로 조절된 항온기에서 배양하였으며, 배지는 2일에 한 번씩 교환하였다.
- 시료는 최종 농도가 10, 50, 100 및 200μg/mL가 되도록 배지에 녹여 세포에 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.
- 4 mM의 DPPH 용액을 가해 30분간 실온에서 반응시키고, Microplate reader(Perkin Elmer 1420, VICTORTM X Multilabel Plate Readers, Waltham, MA, USA)로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 흡광도를 비교하여 굴 가수분해물 및 분획물의 DPPH 라디칼의 소거능을 측정하였다.
- 시료용액 10 μL와 ABTS 용액 190 μL를 혼합 하여 6분간 실온에서 차광한 상태로 반응시키고 734 nm에서 흡광도를 측정하여 아래의 식에 의해 라디칼 소거능을 계산하였다.
대상 데이터
- , Tongyeong, Korea)을 구입하여 사용하였다. 굴을 가수분해 하기 위한 단백질 분해 효소는 식품 첨가물로 인정된 neutral protease(Neutrase)와 subtilisin 유래 protease(Protamex)를 바이오시스(Busan, Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 CCD986sk 세포주는 미국 세포주 은행(American Type Culture Collection(ATCC), Manassas, VA, USA)에서 분양받아 사용하였다.
- 굴을 가수분해 하기 위한 단백질 분해 효소는 식품 첨가물로 인정된 neutral protease(Neutrase)와 subtilisin 유래 protease(Protamex)를 바이오시스(Busan, Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 CCD986sk 세포주는 미국 세포주 은행(American Type Culture Collection(ATCC), Manassas, VA, USA)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양에 필요한 배지 등은 Hyclone 사(Thermo Fisher Scientific Inc.
- 실험에 사용한 참굴(Crassostrea gigas)은 경남 통영 연안의 양식장에서 채취하여 알굴의 형태로 급속 동결하여 1~2년 정도 냉동 보관된 제품(Daione Foods Co., Tongyeong, Korea)을 구입하여 사용하였다. 굴을 가수분해 하기 위한 단백질 분해 효소는 식품 첨가물로 인정된 neutral protease(Neutrase)와 subtilisin 유래 protease(Protamex)를 바이오시스(Busan, Korea)로부터 구입하여 사용하였다.
- 인간 피부 섬유아세포주인 CCD986sk를 Iscove's modified Dulbecco's medium(IMEM) 배지로 배양하였다.
데이터처리
- 대조군에 대한 통계적 유의성은 P<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
- 본 연구의 모든 실험 결과는 3회 이상 반복하여 얻은 측정값의 평균값으로 나타내었다. 통계분석은 Minitab 17(MiniTab 17, Minitab Inc., State College, PA, USA)을 이용하였고, 결과는 일원 분산분석 후 Turkey 다중비교법을 수행하였다. 대조군에 대한 통계적 유의성은 P<0.
이론/모형
- ABTS 라디칼 소거능의 측정은 Re 등(19)의 방법에 따라 측정하였다. 7 mM ABTS와 140 mM potassium persulfate를 혼합하여 어두운 곳에 12시간 동안 양이온화한 후, 흡광도가 734 nm에서 0.
- 굴 가수분해물은 Hur 등(18)의 방법에 따라 제조하였으며, 냉동굴을 냉동 상태에서 습식 분쇄기로 마쇄하였다. 마쇄 굴의 2배의 물을 넣고, 단백질 분해 효소인 Protamex를 생굴 무게의 1%가 되도록 넣어 2시간 동안 40°C에서 가수분해 한 다음, 100°C에서 30분간 가열하여 효소를 불활성화 하였다.
- , Shiga, Japan)으로 procollagen 함량을 측정하여 콜라겐의 생성 정도를 비교하였다. 배양액 내의 총 단백질 함량을 Lowry 법(20)에 따라 측정하여 콜라겐의 생성량을 보정하였다.
성능/효과
- ABTS 라디칼 소거 활성은 3,000~10,000 Da 분획물에서 가장 높은 활성을 보였으나, DPPH 라디칼 소거 활성과 마찬가지로 높은 편은 아니었다(Table 2). Mendis 등(25)은 어피 젤라틴 가수분해물로부터 정제한 펩타이드의 항산화 특성 연구에서 His-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Leu(797Da) 배열을 가지는 펩타이드가 항산화제인 BHT와 비슷한 높은 항산화능을 갖는다고 보고하였다.
- 2%의 높은 collagenase 저해 활성을 보여주었다. Adenosine 5 mg/mL는 모든 분획물 50 mg/mL에서 유의적인 차이가 보여 분획물의 높은 활성 저해능을 확인할 수 있었다. 그러나 농도에 따른 분획물 간의 상관관계는 없었다.
- Adenosine은 식품의약안전처 고시형 주름 개선 원료로 굴 가수분해물과 비교하기 위하여 함께 측정하였다(Table 3). Adenosine 5 mg/mL의 농도와 굴 가수분해물 50 mg/ mL에서 collagenase 저해 활성은 비슷하였고, 굴 가수분해물 100 mg/mL의 농도에서는 81.2%의 높은 collagenase 저해 활성을 보여주었다. Adenosine 5 mg/mL는 모든 분획물 50 mg/mL에서 유의적인 차이가 보여 분획물의 높은 활성 저해능을 확인할 수 있었다.
- Adenosine은 0.1과 1 μg/mL의 농도에서 MMP-1 활성을 저해하였고 굴 가수분해 분획물은 아데노신에 미치지는 못하였으나 1,000~3,000 Da 분획물에서 농도가 증가함에 따라 저해 활성이 증가하였으며, 50 μg/mL 농도에서는 가장 높은 저해 활성을 보였다.
- DPPH 라디칼 소거능은 농도별 항산화 활성을 3회 이상 실시하여 그 평균값으로 50% 라디칼 소거 활성(IC50)을 계산하였고 굴 가수분해물의 IC50 값은 11.1 mg/mL였으며, 아스코르브산의 경우는 0.03 mg/mL로 굴 가수분해물에 비해 현저히 낮았다(Table 2). 한편 1,000~3,000 Da과 3,000~10,000 Da 분획물의 DPPH 라디칼 소거능(IC50)은 각각 6.
- 5,000 Da 미만의 분획물에서는 MMP-1 활성 저해능이 1,000~3,000 Da 분획물보다 좋지 않았다. Procollagen 생성 효능과 MMP-1 저해 효능은 1,000~3,000 Da에서 모두 가장 높은 활성을 보여주었다.
- 굴 가수분해물과 분획물은 주름 개선 기능성 고시 원료인 아데노신보다 높은 활성은 아니지만 단일성분이 아닌 가수 분해 혼합물로서 주름 개선 기능성 소재 개발의 가능성을 확인하였다. 굴 가수분해물 분획물은 천연물 유래의 펩타이드 혼합물로 기능적 효능을 나타내는 유효성분 펩타이드의 구조에 대한 연구와 작용기전에 대한 연구가 진행되어야만 한다.
- 메밀단백질 가수분해물을 Sephadex G-25 gel 여과를 통해 회수한 저분자 분획물로부터 ABTS 라디칼 소거능이 매우 높은 펩타이드를 분리하였다(26). 굴 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼 저해 활성은 분자량 분포와 항산화 활성과의 상관관계는 없었다. Pihlanto(27)의 보고처럼 단백질의 가수분해 펩타이드의 항산화 활성은 항산화 활성 측정법에 따라 차이가 있고, 펩타이드의 항산화 활성에 대한 구조 활성 상관관계는 아직까지 완전히 이해될 수는 없으나 가수분해 효소의 기질 특이성에 따라 생성되는 아미노산 배열 및 아미노산 조성의 영향을 받는 것으로 여겨진다.
- 굴 가수분해물의 유리아미노산 함량은 약 7.8%로 urea와 taurine 함량이 가장 높았고, proline, asparagine, alanine, glutamic acid, leucine, glycine 순으로 아미노산이 함유되어 있었다(Table 1).
- 굴 유래 펩타이드 분획물은 1,000~3,000 Da의 분획물에서 procollagen 생성 효능이 가장 높았고, 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 활성 저해에도 관여하기 때문에 주름 개선에 가장 효과적으로 나타났다. 또한 수율을 높이기 위해 실시한 5,000 Da 미만의 효능 실험에서는 1,000~3,000 Da의 분획물과 유사한 높은 활성을 보여 5,000 Da 미만의 분획물과 큰 차이가 없었다.
- 3% 이상 증가하였다고 보고하였다(31). 굴 유래 펩타이드 분획물은 1,000~3,000 Da의 분획물에서 약 42.2%의 활성 저해능을 보여주어 S. officinalis 뿌리 추출물과 비슷한 저해 활성을 보였다. Kim 등(32)은 마늘의 성분인 caffeic acid, S-allyl cysteine 및 uracil이 NF-KB의 생성을 억제하여 MMP의 활성을 저해하고 procollagen 생성을 증진한다고 하였다.
- 굴 유래 펩타이드 분획물은 1,000~3,000 Da의 분획물에서 procollagen 생성 효능이 가장 높았고, 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 활성 저해에도 관여하기 때문에 주름 개선에 가장 효과적으로 나타났다. 또한 수율을 높이기 위해 실시한 5,000 Da 미만의 효능 실험에서는 1,000~3,000 Da의 분획물과 유사한 높은 활성을 보여 5,000 Da 미만의 분획물과 큰 차이가 없었다. 이처럼 procollagen과 MMP-1 활성 저해능은 분획물에 따라 활성 차이를 보여주었고, 이러한 차이는 분자량의 차이보다는 항산화 활성과 마찬가지로 가수분해 효소의 기질 특이성에 따라 생성되는 아미노산 배열 및 아미노산 조성의 영향을 받는 것으로 여겨진다.
- 모든 분획물에서 농도가 증가함에 따라 procollagen의 생성량이 증가하였다(Table 5). 무시료 처리군에 비해 adenosine 10 μg/mL 처리군은 유의적으로 생성량이 증가하였으며, 굴 가수분해 분획물에서는 1,000~3,000 Da에서 procollagen 생성량이 가장 높았고 다음으로는 5,000 Da 순이었다.
- 무시료 처리군에 비해 adenosine 10 μg/mL 처리군은 유의적으로 생성량이 증가하였으며, 굴 가수분해 분획물에서는 1,000~3,000 Da에서 procollagen 생성량이 가장 높았고 다음으로는 5,000 Da 순이었다.
- 먼저 세포를 웰당 2×103 농도로 96 웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 안정화한 후 굴 가수분해물은 최종농도가 각각 5 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL 및 100 μg/mL로, 굴 가수분해 분획물은 1 μg/mL, 10 μg/mL 및 50 μg/mL의 농도가 되도록 배지에 혼합하여 배양하였다. 세포의 생존율은 무처리군에 대비한 시료 처리군의 흡광도의 비를 %로 표시한 결과, 모든 농도에서 독성이 나타나지 않았다.
- 시료 무처리 대조군과 굴 가수분해 분획물의 MMP-1의 저해 활성을 비교한 결과(Table 6), 굴 가수분해 분획물은 모든 농도에서 농도 의존적으로 MMP-1의 활성을 저해하였다. Adenosine은 0.
- 총 가수분해물에 대한 분획물의 구성 비율은 10,000 Da 이상이 34.1%, 3,000~10,000 Da은 8%였으며, 3,000 Da 미만의 분획은 57.5%로 굴 가수분해물의 50% 이상이 저분자의 펩타이드까지 가수분해 되었음을 알 수 있었다. 한편 5,000 Da 미만의 분획물은 전체 가수분해물의 60.
후속연구
- 굴 가수분해물 분획물은 천연물 유래의 펩타이드 혼합물로 기능적 효능을 나타내는 유효성분 펩타이드의 구조에 대한 연구와 작용기전에 대한 연구가 진행되어야만 한다. 더불어 화장품 소재로 개발하기 위해서는 굴 가수분해물의 경피 흡수율을 높이기 위한 연구도 진행되어야만 할 것이다.
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