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문제 정의
- 본 연구에서는 香砂養胃湯의 경구 투여가 PTU로 유발된 Rat 갑상선기능저하증 및 관련 간손상에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 500, 250 및 125 ㎎/㎏의 香砂養胃湯 물 추출물(HSYYT)을 투여하여 유효한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 실험동물은 군당 8마리씩 6그룹 – 정상 대조군, PTU 대조군, LT4 투여군 및 세 가지 용량(500, 250 및 125 ㎎/㎏)의 HSYYT 투여군-으로 구분하여 실험을 실시하였다. 500, 250 또는 125 ㎎의 HSYYT을 각각 10 ㎖의 멸균 증류수에 용해시켜, ㎏당 5 ㎖/㎏의 용량으로 존데(zonde)가 부착된 5ml 주사기를 이용하여 매일 1회씩 PTU 투여 시작 2주 전부터 42일 동안 강제 경구 투여하였다. 2.
- 香砂養胃湯이 PTU로 유발된 Rat의 갑상선기능저하와 간손상에 미치는 영향을 평가하기 위하여 500, 250 및 125 ㎎/㎏ HSYYT 투여 후 체중 및 장기 중량, 혈중 호르몬 함량, 혈청 성분의 함량, 항산화 방어 인자, 조직병리학적 변화를 LT4 0.5 ㎎/㎏ 복강 투여한 군과 비교하여 살펴본 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 00 g)이 일정한 실험동물을 선별하여 군당 8마리씩 총 6개 군으로 구분하여 실험에 사용하였다. 모든 실험동물은 HSYYT 또는 용매 투여 시작일 및 최종 부검일 18시간 전 각각 절식을 실시하였으며(이 기간에도 음수는 자유롭게 공급하였다), picric acid로 개체를 식별하였다. 본 동물실험은 대구한의대학교 동물실험윤리위원회(IACUC)의 사전 승인을 받아 수행하였다(승인번호: DHU2013-067).
- 모든 실험동물의 체중을 HSYYT 투여 시작 1일 전, 투여 시작일, 투여 7, 14(PTU 및 LT4 투여 시작일), 21, 28, 35, 41 및 42(최종 희생일)일 후에 automatic electronic balance(Precisa Instrument, Zürich, Switzland)를 이용하여 각각 측정하였으며, 사료섭취에 따른 체중 변화를 최소화하기 위해 HSYYT 투여시작일 및 최종 희생일에 모든 실험동물은 18시간 정도 절식을 실시하였고, 실험 시작시의 개체 차이에 의한 체중 변화를 최소화하기 위해 2주간의 HSYYT 전 투여기간, 4주간의 PTU 투여기간 및 6주간의 실험 전 기간 동안의 체중 변화량인 증체량(body weight gains)을 각각 측정하였다.
- 본 연구에서는 香砂養胃湯의 갑상선기능저하증에 대한 효과를 PTU 유발 갑상선기능저하증 Rat 모델을 이용하여 평가하였으며, 그 결과는 현재 갑상선기능저하증 치료제로 사용되고 있는 LT4 0.5 ㎎/㎏ 복강 투여군10,11,14)과 비교하였다.
- 실험동물은 군당 8마리씩 6그룹 – 정상 대조군, PTU 대조군, LT4 투여군 및 세 가지 용량(500, 250 및 125 ㎎/㎏)의 HSYYT 투여군-으로 구분하여 실험을 실시하였다. 500, 250 또는 125 ㎎의 HSYYT을 각각 10 ㎖의 멸균 증류수에 용해시켜, ㎏당 5 ㎖/㎏의 용량으로 존데(zonde)가 부착된 5ml 주사기를 이용하여 매일 1회씩 PTU 투여 시작 2주 전부터 42일 동안 강제 경구 투여하였다.
대상 데이터
- VAF Outbred Crl:CD[Sprague-Dawley] Rat(6-wk old upon receipt, OrientBio, Seungnam, Korea)을 15일간의 순화과정을 거쳐 실험에 사용하였으며, 순화과정 및 실험 전 기간 동안 온도(20-25℃)와 습도(40-45%)가 조절된 사육실에서 polycarbonate 사육상자에 4마리씩 수용하여 사육하였고, 명암주기(light:dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였으며, 사료(Samyang, Korea)와 음수는 자유롭게 공급하였다. 순화과정 후 체중(Average: 287.10±15.01 g; ranged in 265.00~322.00 g)이 일정한 실험동물을 선별하여 군당 8마리씩 총 6개 군으로 구분하여 실험에 사용하였다. 모든 실험동물은 HSYYT 또는 용매 투여 시작일 및 최종 부검일 18시간 전 각각 절식을 실시하였으며(이 기간에도 음수는 자유롭게 공급하였다), picric acid로 개체를 식별하였다.
- 실험에 사용된 약재는 대원약업사(Daegu, Korea)에서 매입한 것을 현미경하에서 관능검사를 통하여 선정하여 사용하였으며, 본 실험에 사용된 香砂養胃湯 1첩 분량(52.00 g)의 조성은 아래와 같다(Table 1). 선정된 약제 10첩 분량(총량 520.
- 총 132 마리의 수컷 SPF.VAF Outbred Crl:CD[Sprague-Dawley] Rat(6-wk old upon receipt, OrientBio, Seungnam, Korea)을 15일간의 순화과정을 거쳐 실험에 사용하였으며, 순화과정 및 실험 전 기간 동안 온도(20-25℃)와 습도(40-45%)가 조절된 사육실에서 polycarbonate 사육상자에 4마리씩 수용하여 사육하였고, 명암주기(light:dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였으며, 사료(Samyang, Korea)와 음수는 자유롭게 공급하였다. 순화과정 후 체중(Average: 287.
데이터처리
- PTU 유발 갑상선기능저하증에 대한 HSYYT 또는 LT4의 유효한 효과를 좀 더 명확히 하기 위하여 HSYYT 또는 LT4 투여군과 PTU 대조군과의 percent change(%)를 {((Data of PTU control-Data of Intact vehicle control)/Data of Intact vehicle control) × 100}을 이용하여 측정하였으며, PTU에 의한 갑상선기능저하증 및 관련 간손상의 유발 정도를 보다 명확히 하기 위해 정상(Intact) 대조군과 PTU 대조군과의 percent change(%)를 {((Data of administered groups-Data of PTU control)/ Data of PTU control) × 100}을 이용하여 각각 측정하였다.
- 등분산일 경우 one way ANOVA test를 실시한 다음 least-significant differences(LSD) test로 사후 검증을 실시하여 군 간의 유의성을 측정하였다
- 모든 수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 다중비교검증을 이용하여 통계처리를 실시하였고, 분산동질성을 Levene test18)를 실시하여 검증하였다
- 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal-Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는 Mann-Whitney U test를 실시하여 군 간의 유의성을 검증하였다
성능/효과
- HSYYT 125 ㎎/㎏ 투여군에서는 대조군과 비교하여 갑상선기능저하증 및 관련 간손상에 대한 변화는 유의하게 나타나지 않았다.
- HSYYT 500 및 250 ㎎/㎏ 투여에 의해 PTU로 유발된 갑상선기능저하증 소견이 용량 의존적으로 억제되었으며, 관련 간 항산화 방어 system 변화 역시 효과적으로 조절되는 것으로 관찰되었다.
- 본 실험의 결과 28일 간의 연속적인 PTU 10 ㎎/㎏ 피하 투여에 의해 체중 감소, 갑상선 중량의 증가, 간 중량의 감소, 혈청 중 T3, T4 감소와 TSH 증가, 혈청 중 HDL 증가와 Triglyceride 감소, 간 항산화 방어 system 장애, 혈청 중 AST 증가가 인정되었으며, 조직병리학적으로 갑상선 여포세포 증식에 의한 비대 소견과 간세포의 지방 소적 침윤에 의한 간 비대에 따른 단위 면적당 간세포의 수적 감소가 인정되었으나, HSYYT 500 및 250 ㎎/㎏에 의해 투여 용량 의존적으로 PTU 유발 갑상선기능저하증 및 관련 간 손상 소견이 억제되었으며, 간 항산화 방어 system 변화 역시 500 및 250 ㎎/㎏ HSYYT 투여에 의해 효과적으로 조절되는 것으로 관찰되었다. PTU 대조군과 비교하여 HSYYT 125 ㎎/㎏ 투여군에서는 갑상선기능저하증 및 관련 간손상에 대한 효과는 유의하게 나타나지 않았다.
- 본 실험의 결과, PTU 투여에 의해 유의한 혈청 중 Total Cholesterol 및 LDL 변화는 나타나지 않았으나, HDL 증가와 Triglyceride 감소가 나타났다. PTU 대조군에 비해 혈청 중 HDL 감소와 Triglyceride 증가가 HSYYT 500 및 250 ㎎/㎏ 투여군에서 인정된 점은 갑상선호르몬 증가에 의해 간에서 지질 대사 기능이 정상화되고 이차적으로 지질 이용이 증가되어 나타난 결과로 판단된다. LT4 투여군에서도 PTU 대조군에 비해 혈청 중 HDL 감소와 Triglyceride 증가가 각각 유의하게 나타났으나, HSYYT 125 ㎎/㎏ 투여군에서는 PTU 대조군에 비해 혈청 중 Total Cholesterol, LDL, HDL 및 Triglyceride 변화는 유의하게 나타나지 않았다.
- PTU 투여군에서는 체중 감소, 갑상선 중량 증가, 간 중량 감소, 혈청 중 T3, T4 감소와 TSH 증가, 혈청 중 HDL 증가와 Triglyceride 감소, 간 항산화 방어 system 장애, 혈청 중 AST 증가가 나타났으며, 조직병리학적으로 갑상선 여포 세포 증식에 의한 비대 소견과 간세포의 지방 소적 침윤에 의한 비대에 따른 단위 면적당 간세포의 수적 감소가 나타났다.
- 이러한 PTU 유발 체중 또는 체중 증가량의 감소가 LT4 및 HSYYT 250 및 500 ㎎/㎏ 투여에 의해 억제되었으나, 125 ㎎/㎏ HSYYT 투여군에서는 PTU 대조군에 비해 체중 및 체중 증가량 변화는 실험 전 기간 동안 유의하게 나타나지 않았다. 따라서 250 ㎎/㎏ 이상의 HSYYT 투여는 PTU 투여로 유발되는 갑상선기능저하증시 체중 감소를 효과적으로 억제하는 것으로 판단된다.
- 이러한 갑상선 중량 증가 및 비활동성 갑상선 종대의 조직병리학적 변화가 HSYYT 500 및 250 ㎎/㎏ 투여에 의해 용량 의존적으로 억제되었으나, 125 ㎎/㎏ 투여군에서는 PTU 대조군과 비교하여 유의한 갑상선 중량 및 조직병리학적 변화는 인정되지 않았다. 따라서 250 ㎎/㎏ 이상의 HSYYT 투여는 PTU에 의한 갑상선 변화를 직접적으로 억제하는 것으로 판단된다.
- 250 및 500 ㎎/㎏ HSYYT 투여군에서는 LT4 투여군과 유사하게 PTU 투여에 의한 간손상 소견이 억제되었으나, HSYYT 125 ㎎/㎏ 투여군에서는 PTU 대조군과 비교하여 유의한 혈중 AST 변화 및 간 조직병리학적 변화는 인정되지 않았다. 따라서 250 ㎎/㎏ 이상의 HSYYT이 갑상선기능저하증시 유발되는 간손상을 억제하는 것으로 판단된다.
- 본 실험 결과에서도 PTU 대조군에서는 PTU 투여 2주 후부터 체중 감소가 나타나기 시작하여, 4주간의 PTU 투여기간 및 6주간의 실험 전 기간 동안 체중 증가량 역시 정상 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 이러한 PTU 유발 체중 또는 체중 증가량의 감소가 LT4 및 HSYYT 250 및 500 ㎎/㎏ 투여에 의해 억제되었으나, 125 ㎎/㎏ HSYYT 투여군에서는 PTU 대조군에 비해 체중 및 체중 증가량 변화는 실험 전 기간 동안 유의하게 나타나지 않았다.
- 본 실험의 결과 28일 간의 연속적인 PTU 10 ㎎/㎏ 피하 투여에 의해 체중 감소, 갑상선 중량의 증가, 간 중량의 감소, 혈청 중 T3, T4 감소와 TSH 증가, 혈청 중 HDL 증가와 Triglyceride 감소, 간 항산화 방어 system 장애, 혈청 중 AST 증가가 인정되었으며, 조직병리학적으로 갑상선 여포세포 증식에 의한 비대 소견과 간세포의 지방 소적 침윤에 의한 간 비대에 따른 단위 면적당 간세포의 수적 감소가 인정되었으나, HSYYT 500 및 250 ㎎/㎏에 의해 투여 용량 의존적으로 PTU 유발 갑상선기능저하증 및 관련 간 손상 소견이 억제되었으며, 간 항산화 방어 system 변화 역시 500 및 250 ㎎/㎏ HSYYT 투여에 의해 효과적으로 조절되는 것으로 관찰되었다. PTU 대조군과 비교하여 HSYYT 125 ㎎/㎏ 투여군에서는 갑상선기능저하증 및 관련 간손상에 대한 효과는 유의하게 나타나지 않았다.
- 일부 연구에서는 ALT 상승없이 AST 증가만 나타나는 경우도 있고, 미세 구조상 간세포 비대에 의한 단위 면적당 간세포 수적 감소가 나타난 경우도 있다5,10,11). 본 실험의 결과 간 중량 감소와 함께 혈중 AST 현저한 증가 및 간세포의 지방 소적 침윤에 의한 비대에 따른 단위 면적당 간세포의 수적 감소가 PTU 투여에 의해 유발되었으나 유의성 있는 ALT 증가는 나타나지 않았다. 250 및 500 ㎎/㎏ HSYYT 투여군에서는 LT4 투여군과 유사하게 PTU 투여에 의한 간손상 소견이 억제되었으나, HSYYT 125 ㎎/㎏ 투여군에서는 PTU 대조군과 비교하여 유의한 혈중 AST 변화 및 간 조직병리학적 변화는 인정되지 않았다.
- 일반적으로 알려진 지질 단백질 이상은 Total Cholesterol 및 LDL이 증가하여 이들로 인해 혈관계 합병증이 유발되고 LT4 투여에 의해 이러한 합병증이 억제되는 것으로 알려져 있으나27), 혈청 중 지질 변화는 갑상선호르몬 상태에 따라 다양하게 변화되고 특히 항산화 방어 system 변화와 직결되어 증감하는 것으로 알려져 있어, 갑상선기능저하증의 유발 정도, 시기 및 다른 합병증 유무에 따라 매우 다양한 혈청 중 지질 함량 변화가 초래된다5,10,11,26). 본 실험의 결과, PTU 투여에 의해 유의한 혈청 중 Total Cholesterol 및 LDL 변화는 나타나지 않았으나, HDL 증가와 Triglyceride 감소가 나타났다. PTU 대조군에 비해 혈청 중 HDL 감소와 Triglyceride 증가가 HSYYT 500 및 250 ㎎/㎏ 투여군에서 인정된 점은 갑상선호르몬 증가에 의해 간에서 지질 대사 기능이 정상화되고 이차적으로 지질 이용이 증가되어 나타난 결과로 판단된다.
- 이에 따라 강력한 항산화 효과를 나타내는 천연물 유래의 갑상선기능저하증 치료제의 개발이 주목 받고 있는 실정이며 현재 HSYYT 자체의 항산화 효과는 이미 알려져 있다14,15,30). 본 실험의 결과도 PTU 투여에 의해 지질 과산화의 감소와 함께 대표적인 내인성 항산화 효소인 SOD 활성의 증가와 함께 CAT 감소에 따른 대표적인 세포 호흡성 산화물질인 H2O2의 간 mitochondria fraction 내 축적이 인정되었으나, 250 ㎎/㎏ 이상의 HSYYT은 LT4와 유사하게 SOD 활성을 억제하였고, CAT 활성 증가에 의해 간 세포내 H2O2 축적을 억제시키는 것으로 관찰되었다. 혈중 AST 변화와 간 조직병리학적 변화 결과와 일치되어 HSYYT 125 ㎎/㎏ 투여군에서는 PTU 대조군과 비교하여 유의한 간의 항산화 방어 시스템 변화 역시 나타나지 않았다.
- PTU는 대표적인 갑상선 억제제로 Iodine과 Tyrosine의 결합을 억제하는 작용을 하여 TSH 증가와 함께 T3 및 T4의 감소, 비 활동성 갑상샘 종대(simple goiter)를 유발하고5,23,24), 조직병리학적으로 갑상선 여포세포 증식에 의한 비대 소견과 여포 직경 및 여포내 colloid 물질 감소를 특징적으로 나타낸다10,11,23,25). 본 실험의 결과에서도 갑상선 중량 증가와 함께 갑상선 여포 세포 증식에 의한 비대, 여포 직경 및 여포 내 colloid 물질의 감소 등의 조직병리학적 변화, 즉 전형적인 비활동성 갑상선 종대 소견이 PTU 대조군에서 나타났다. 이러한 갑상선 중량 증가 및 비활동성 갑상선 종대의 조직병리학적 변화가 HSYYT 500 및 250 ㎎/㎏ 투여에 의해 용량 의존적으로 억제되었으나, 125 ㎎/㎏ 투여군에서는 PTU 대조군과 비교하여 유의한 갑상선 중량 및 조직병리학적 변화는 인정되지 않았다.
- 이상에서 250 및 500 ㎎/㎏ HSYYT 경구투여는 항산화 방어 system 조절을 통해 갑상선기능저하증 및 관련 간손상에 유효한 효과를 나타낼 것으로 판단된다.
후속연구
- HSYYT 250 및 500 ㎎/㎏ 투여군에서는 투여 용량 의존적인 TSH 감소와 T4 증가가 각각 인정되었고, T3 역시 유의하게 증가되었다. 따라서 250 mg/kg 이상의 HSYYT은 LT4와는 달리 단순히 감소된 T4 보충뿐만 아니라, 본 실험에서 인정된 항산화 방어 시스템 활성을 통해 갑상선 여포 세포 변화를 억제하여 갑상선기능저하증에 유효한 효과를 나타내는 것으로 판단되나, 정확한 기전은 본 실험에서는 알 수 없으므로 다방면의 다양한 기전 연구가 향후 수행되어야 할 것으로 판단된다.
- 이상에서 250 및 500 ㎎/㎏ HSYYT 경구투여는 PTU 유발 갑상선기능저하증시 초래되는 체중 감소, 갑상선 종대, 갑상선호르몬 변화, 혈청 중 지질 함량 변화 및 간손상을 투여 용량 의존적으로 억제하였고, PTU 유발 갑상선기능저하증시 초래되는 항산화 방어 system 변화 역시 투여 용량 의존적으로 억제하였으므로 항산화 방어 system 조절을 통해 갑상선기능저하증 및 관련 간손상에 유효한 효과를 나타낼 것으로 기대되나, 향후 명확한 기전 연구가 수행되어야 할 것으로 판단된다.
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