선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 연잎 추출물의 항산화 효능과 ty- rosinase 저해활성 및 미백인자인 MITF, TRP-1, TRP-2, ty- rosinase의 Melanorna 발현억제 효과를 확인하여 미백화장품의 소재로서의 가능성을 검증하고자 한다.
가설 설정
- C: TRP-2 protein expression rate of NNL extract. D: Tyrosinase protein expression rate of NNL extract. After B16F10 cells (1×106 cells) were started in serum free medium for 1 hr the cells were treated with 25, 50 and 100 μg/ml of NNL extract for 24 hr.
제안 방법
- 다시 4℃, 13, 200 rpm에서 20분간 원심분리 하였고, 그 상층 액을 제거 한 후 75% EtOH-diethylpyrocarbonate water를 각 튜브에 1 ml씩 분주하여 4℃, 13, 200 rpm에서 5분간 원심분리한 뒤 상층액을 제거한 뒤 실온에서 건조시켰다. DEPC를 50 μl씩 분주하여 녹인 후 96 well plate에 RNA 5 μl와 멸균수 195 μl를 첨가하여 260 nm, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다. Oligo (dT) 15 primer (500 μg/ ml) 1 μl, 추출한 RNA (2 μg)와 nuclease free water로 10 μl를맞추고 75℃에서 5분간 반응시킨 후 5X reaction buffer, MgCl2, PCR necleotide mix, rnasin inhibitor, reverse tran- scriptase, nuclease free water를 첨가하여 25℃에서 5분, 42℃ 에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.
- PCR tube에 Go Flexi DNA polymerase, primer, 합성한 cDNA를 첨가하여 섞어 준 후 PCR을 실행하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogen- ase (GAPDH)는 94℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45 초(35 cycles), tyrosinase는 94℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72 ℃ 45초(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94℃에서 30초, 58 ℃에서 45초, 72℃에서 45초(40 cycles)을 하였다. PCR로 합성시킨 후 0.
- DEPC를 50 μl씩 분주하여 녹인 후 96 well plate에 RNA 5 μl와 멸균수 195 μl를 첨가하여 260 nm, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다. Oligo (dT) 15 primer (500 μg/ ml) 1 μl, 추출한 RNA (2 μg)와 nuclease free water로 10 μl를맞추고 75℃에서 5분간 반응시킨 후 5X reaction buffer, MgCl2, PCR necleotide mix, rnasin inhibitor, reverse tran- scriptase, nuclease free water를 첨가하여 25℃에서 5분, 42℃ 에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.
- 실험에 사용한 pri- mer sequences는 Table 1과 같다. PCR tube에 Go Flexi DNA polymerase, primer, 합성한 cDNA를 첨가하여 섞어 준 후 PCR을 실행하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogen- ase (GAPDH)는 94℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45 초(35 cycles), tyrosinase는 94℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72 ℃ 45초(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94℃에서 30초, 58 ℃에서 45초, 72℃에서 45초(40 cycles)을 하였다.
- Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogen- ase (GAPDH)는 94℃에서 30초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45 초(35 cycles), tyrosinase는 94℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72 ℃ 45초(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94℃에서 30초, 58 ℃에서 45초, 72℃에서 45초(40 cycles)을 하였다. PCR로 합성시킨 후 0.002% ethidium bromide를 첨가한 1.5% agarose gel 에 100 V에서 40분간 전기영동 후 LAS 4, 000을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.
- 추출시료로 사용하였다. 건조된 연잎을 파쇄 후 연잎 200 g의 10배의 70% ethanol 2,000 ml 가하여 3시간 진탕 혼합하여 이후 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 분리한 상등액은 여과지(Whatman No.
- Chin [4] 등의 어성초 메탄올 추출물의 경우 100 μg/ml의 농도에서 74%의 증식억제를 보인 결과와 비교하였을 때 연잎 추출물의 멜라노마 세포(B16F10)에 대한 세포독성이 적은 것을 확인할 수 있었다. 따라서 미백관련 신호전달인 자의 측정은 100% 이상의 세포 생존율을 보이는 100 μ g/ml 이하의 농도에서 실험을 실시하였다.
- 또한 본 연구에서는 연잎 추출물이 melanin 합성에 관여하는 효소인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase mRNA에 미치는 영향을 알아보기 위하여 멜라노마 세포에 25, 50, 100 μ g/ml의샘플을 농도별로 처리한 후 24시간 뒤에 PCR로 mRNA 발현량을 측정하여 Fig. 6과 같이 나타내었다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 housekeeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다.
- 이 때, 세포의 종류나 환경에서도 발현 정도의 차이가 거의 없는 house- keeping gene인 β-actin을 positive control로서 사용하였다. 또한 비교군으로서 기존에 미백 화장품에 첨가물로서 사용하는 kojic acid 100 μg/ml를 사용하여 나타내었다. 그 결과 Fig.
- 멜라닌 생성에 관여하는 미백인자 중 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 활성을 확인하기 위해 melanoma cell (B16F10) 을 100 mm tissue culture dish에 1×106 cells/well을 seeding 한 후 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화시켰다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도 별로 처리한 배지로 24시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 phosphate buffered saline (PBS)로 2번 세척하였다.
- 미백인자인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 PCR을 실시하였다. 실험에 사용한 pri- mer sequences는 Table 1과 같다.
- 연잎 추출물이 melanin 합성에 관련 있는 효소인 tyrosinase 의 미치는 영향을 알아보기 위하여 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현을 측정하였다. 맬라노마 세포에 연잎 추출물을 농도별로 25, 50, 100 μg/ml 처리하여 24시간 뒤에 western blotting으로 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 단백질 발현 측정 결과를 Fig.
- 5와 같이 나타내었다. 이 때, 세포의 종류나 환경에서도 발현 정도의 차이가 거의 없는 house- keeping gene인 β-actin을 positive control로서 사용하였다. 또한 비교군으로서 기존에 미백 화장품에 첨가물로서 사용하는 kojic acid 100 μg/ml를 사용하여 나타내었다.
- 6과 같이 나타내었다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 housekeeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다. 그 결과 Fig.
- 전자공여능(EDA: electron donating abilities) 측정 실험은 Blois의 방법[2]을 변형하여 시행하였다. 에탄올에 용해한 0.
대상 데이터
- A)에서 구입하여 사용하였다. mRNA 발현억제 측정에 사용된 Trizol lysis buffere ambion (U.S.A)에서 구입하였고, DNA poltmerase, 5X reaction buffer, MgCl2, PCR necleotide mix등의 시약은 Promega (U.S.A)에서 구입하여 사용하였다. 단백질 발현 억제와 mRNA 발현억제 측정에 사용된 항체는 Tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related pro- tein-2 (TRP-2), tyrosinase, glyceraldehyde-3-phosphate de- hydrogenase (GAPDH), β-actin, primary antibodies와 mouse- anti-goat, rabbit-anti-mouse 등 secondary antibodies는 Santacruz (CA, U.
- A)에서 구입하여 사용하였다. 단백질 발현 억제와 mRNA 발현억제 측정에 사용된 항체는 Tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related pro- tein-2 (TRP-2), tyrosinase, glyceraldehyde-3-phosphate de- hydrogenase (GAPDH), β-actin, primary antibodies와 mouse- anti-goat, rabbit-anti-mouse 등 secondary antibodies는 Santacruz (CA, U.S.A)에서 구입하였으며, microphthalmia- associated transcription factor (MITF)는 Abcam (U.S.A)에서구입하여 사용하였다.
- 본 실험에 이용한 B16F10인 melanoma cell을 ATCC (U.S.A) 에서 구입하여 사용하였다. 세포의 배양은 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin (100 U/ml)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.
- 본 실험의 재료는 충청남도 아산시에서 생산된 연잎을 구입하여 추출시료로 사용하였다. 건조된 연잎을 파쇄 후 연잎 200 g의 10배의 70% ethanol 2,000 ml 가하여 3시간 진탕 혼합하여 이후 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다.
- A)에서 구입하였다. 세포 독성 측정에 사용된 3-[4, 5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl-tetrazolium- bromide (MTT)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A)에서 구입하여 사용하였다. mRNA 발현억제 측정에 사용된 Trizol lysis buffere ambion (U.
- A) 에서 구입하여 사용하였다. 세포의 배양은 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin (100 U/ml)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.
- 실험에 사용한 기기는 ELISA reader (Tecan, Austria), im- age quant LAS 4, 000 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden), CO2 incubator (vision scientific, Korea), pH meter (Mettler-Toledo AG, Swltzerland), centrifuge (Hanil Science Industrial Co. Korea), autoclave (JS Research Inc, Korea), Davinch-Chemi™ imager CAS-400SM System (Davinch-K Co, Korea), PCR (C-100, Bio-Rad. U.S.A) 등을 사용하였다.
- 항산화 및 tyrosinase 활성억제 측정에 사용된 1-1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl (DPPH), xanthine, xanthine oxidase, ty- rosinase mushroom, L-3, 4-dihydroxy- phenyl-alanine (L- DOPA), dimethyl sulfoxide (DMSO) 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A)에서 구입하였다. 세포 독성 측정에 사용된 3-[4, 5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl-tetrazolium- bromide (MTT)는 Sigma Chemical Co.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복으로 행하여 평균치와 표준편차로 나타내었고, 결과 통계처리는 SPSS10.0 (Evanston, IL, USA) software를 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석(analysis of variance ANOVA)을 한 후 α=0.05 수준에서 Turkey’s HSD test에 의해 유의성을 분석하였다.
이론/모형
- Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법[30]에 따라 측정하였다. 반응구는 67 mM sodium phosphate buffer (pH 6.
- Xanthine oxidase 저해활성은 Stirpe와 Corte의 방법[26]에 따라 측정하였다. 각 시료용액 0.
- 세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법[3]에 따라 시행하였다. 멜라노마 세포(B16F10)를 96 well plate에 1×105 cells/ well이 되게 0.
성능/효과
- Zanabaatar 등[34]의 꽃송이버섯, 양송이버섯, 새송이버섯, 잎새버섯에서 각각 19. 5%, 56.7%, 37.0%, 21.8%의 저해 활성을 나타낸 결과와 Yoon 등[33]의 미숙, 완숙 및 과숙 뜰보리수의 1,000 μg/ml 농도에서 30.0%, 28.2%, 18.2%의 xanthine oxidase 저해활성을 나타낸 결과와 비교하였을 때 연잎 추출물의 xanthine oxidase 저해 활성이 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
- 또한 비교군으로서 기존에 미백 화장품에 첨가물로서 사용하는 kojic acid 100 μg/ml를 사용하여 나타내었다. 그 결과 Fig. 5에서 보는 바와 같이 연잎 추출물을 25, 50, 100 μg/ml의 농도로 처리한 맬라노마 세포에서 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 의 단백질 발현이 농도가 높아짐에 따라서 억제됨을 확인하였으며, 100 μg/ml에서 각각 69.6%, 27.7%, 67.3%, 67.8%의 발현억제를 보여주었다. 또한 MITF, TRP-2, tyrosinase의 단백질발현은 비교군인 kojic acid 100 μg/ml에 비해 감소한 것을 확인하였고, TRP-1은 kojic acid 100 μg/ml와 유사한 결과를 나타내어 우수한 억제 효과를 확인할 수 있었다.
- 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 housekeeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다. 그 결과 Fig. 6에서 보는 바와 같이 연잎 추출물을 25, 50, 100 μ g/ml의농도로 처리한 멜라노마 세포에서 MITF, TRP-1, TRP-2, ty- rosinase의 mRNA발현이 농도가 높아짐에 따라서 억제됨을 확인하였으며, 100 μg/ml에서 각각 65.5%, 72.4%, 85.7%, 83.6%의 발현 억제를 보여주었다. 또한 MITF, TRP-1, TRP-2의 mRNA발현은 비교군인 kojic acid 100 μg/ml에 비해 감소한 것을 확인하였고, tyrosinase는 kojic acid 100 μg/ml와 유사한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 6%의 발현 억제를 보여주었다. 또한 MITF, TRP-1, TRP-2의 mRNA발현은 비교군인 kojic acid 100 μg/ml에 비해 감소한 것을 확인하였고, tyrosinase는 kojic acid 100 μg/ml와 유사한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 8%의 발현억제를 보여주었다. 또한 MITF, TRP-2, tyrosinase의 단백질발현은 비교군인 kojic acid 100 μg/ml에 비해 감소한 것을 확인하였고, TRP-1은 kojic acid 100 μg/ml와 유사한 결과를 나타내어 우수한 억제 효과를 확인할 수 있었다.
- 4와 같이 나타내었다. 연잎 추출물은 1,000 μg/ml에서 82.2%의 세포 생존율을 확인할 수 있었다. Chin [4] 등의 어성초 메탄올 추출물의 경우 100 μg/ml의 농도에서 74%의 증식억제를 보인 결과와 비교하였을 때 연잎 추출물의 멜라노마 세포(B16F10)에 대한 세포독성이 적은 것을 확인할 수 있었다.
- Allopurinole xanthine oxidase에 의하여 alloxanthine 으로 산화된 후, xanthine oxidase의 활성부위에 결합하여 효소의 활성을 저해함으로써 urate 생성을 억제하는 것으로 알려져 있다[18]. 연잎 추출물의 xanthine oxidase 저해 효과를 측정한 결과를 Fig. 2에 나타내었으며, 1,000 μg/ml에서 92.7% 의 높은 저해활성을 확인할 수 있었다. Zanabaatar 등[34]의 꽃송이버섯, 양송이버섯, 새송이버섯, 잎새버섯에서 각각 19.
- 연잎 추출물의 경우 1,000 μg/ml에서 42.7 %를 나타내었으며, Cho 등[6]의 솔순과 솔잎의 에탄올 추출물은 4, 000 μg/ml 에서 각각 15.2%, 6.9%의 tyrosinase의 활성저해를 나타낸 결과와 비교하였을 때 연잎 추출물의 tyrosinase 저해활성 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
- 1에 나타내었다. 연잎 추출물의 경우 농도가 증가함에 따라 전자공여 능이 증가되는 것을 확인하였고, 1,000 μg/ml에서 67.8%의 활성을 나타내었다. 이는 Park [23]의 씀바귀 에탄올 추출물의결과와 비교하였을 때 연잎 추출물과 같은 농도인 1,000 μg/ml에서 24.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.