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제안 방법
- DPPH 라디칼 소거 활성 측정: 유산균을 1.0×109 CFU/mL의 농도로 희석한 배지 500 μL와 메탄올로 희석한 15 mM 2,2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma-Aldrich Co.) 용액 500 μL를 1:1의 비율로 96-well plate에 혼합하여 빛이 차단된 상태에서 30분간 방치하였다.
- plantarum KCTC 3099(Lp-3099)의 프로바이오틱 효과(내산 및 내담즙성 측정, 장 부착능과 열 안정성, 항산화 및 항암 기능성의 측정)를 된장에서 유래한 Lac. lactis KFCC 11510P(L-lactis)와 비교하여 측정하였다. 그 결과 4종의 김치 L.
- plantarum 균주와 Lac. lactis 균주의 프로바이오틱 효과를 내산성, 내담즙염성, 장내 부착성, 열에 대한 내성, 항산화 및 in vitro 항암 효과 측정을 통해 비교하였다.
- 각 균주는 MRS broth(Difco, Sparks, MD, USA)를 이용하여 37℃에서 혐기적으로 3차 계대배양하여 프로바이오틱 효능 확인 실험에 사용하였고, in vitro 항암 기능성 실험에서는 이를 원심분리(3,000×g, 5분) 한 후 phosphate buffered saline(PBS)에 2회 세척한 다음 100°C에서 20분 사멸시켜 사용하였다(19).
- 프로바이오틱스는 제제화 공정에서 고온의 환경에 노출되면 생균력이 감소할 수 있으므로 유산균의 열 안정성은 프로바이오틱스 균주 선정에 중요한 기준 중 하나이다(34). 각 유산균의 열 안정성은 50℃, 70℃, 80℃에서 1시간 동안 방치하며 30분 단위로 생균수를 측정하였다(Fig. 4).
- 각 유산균의 장 부착능을 확인하기 위해 HT-29 cells를 이용하여 유산균의 장 부착능을 확인하였다(Fig. 3). 그 결과 Lp-pF1, Lp-PNU와 Lp-CB가 각각 83.
- 그리고 1 mM FeCl3 및 1.04 mM EDTA 용액 50 μL, 1 mM ascorbic acid 50 μL, 0.1 M H2O2 5 μL를 각각 첨가하고 37°C에서 10분간 반응시킨 후, 2.8% trichloroacetic acid 500 μL와 1% 2-thiobarbituric acid 250 μL를 첨가하고 95°C에서 8분간 가열하였다.
- plantarum과 비교하여 프로바이오틱 효과의 차이가 있는지 그리고 어떠한 프로바이오틱의 특징과 건강 기능성을 나타내는지 확인할 필요가 있다. 그리고 된장에서 유래한 대표적인 유산균(17)과 김치에서 유래한 유산균을 비교하기 위해 그 프로바이오틱 효과가 검증된 Lactococcus lac-tis KFCC 115109(L-lactis)(18)와도 비교하였다.
- 0×108 CFU/mL가 되도록 현탁하여 각 well에 접종하고 37℃, 5% CO2 조건에서 2시간 배양하여 HT-29 cell에 부착시켰다. 배양이 완료된 후 부착되지 않은 유산균을 제거하기 위해 3분씩 200 rpm의 속도로 교반(Orbital shaker NB- 101S, N-Biotek, Bucheon, Korea)하면서 PBS로 3회 세척을 실시하였다. 세척이 완료된 후 0.
- 내산성: 유산균은 구강으로 섭취할 경우 위와 십이지장을 통과하여 장에 도달하게 되므로, pH 3 이하의 조건에서 생존이 가능한 유산균만이 장에 도달하여 프로바이오틱 기능성을 발휘할 수 있다(27,28). 본 연구에서는 각 균주의 인공 위액에 대한 내성을 측정하기 위하여 pH 2.5의 산과 소화효소인 pepsin을 함유한 인공 위액에 각 균주를 접종하여 시간별로 생균수를 측정하였다(Fig. 1). 반응 1시간 후 생균수를 측정하여 반응 전의 생균수와 비교한 결과, Lp-pF1, Lp- PNU, Lp-CB 모두 90.
- 02% EDTA(Gibco, Grand Island, NY, USA)를 10분간 처리하여 세포를 분리하였다. 분리한 세포를 멸균한 증류수로 단계별로 희석하여 MRS 평판배지에 접종하고 48시간 배양하여 생균을 counting 한 후 장 부착률을 측정하였다(23).
- 여기에 MRS broth에서 배양한 유산균을 1.0×108 CFU/mL 수준으로 접종한 후 37℃에서 3시간 배양하며 1시간마다 생균수를 측정하였다(20).
- 열 안정성은 MRS broth에서 배양한 1.0×109 CFU/mL의 유산균을 50℃, 70℃ 및 80℃에 1시간 방치하며 30분 단위로 배양된 배지 1 mL를 채취한 후 멸균한 증류수에서 단계별로 희석하여 MRS 평판배지에 접종한 다음, 37℃에서 48시간 동안 배양하고, 생균수를 측정하여 생존율을 계산하였다(24).
- 유산균의 항암 효과는 MTT assay를 이용하여 HT-29 인체대장암 세포에서 성장 억제 효과를 측정하였다(Fig. 7). 저농도 처리군(5.
- 인공 담즙산에 1.0×108 CFU/mL 수준의 각 유산균 현탁액을 접종하여 37°C에서 6시간 배양하며 2시간마다 생균수를 측정하여 인공 담즙산에 대한 내성을 측정하였다.
- 인공 담즙산에 대한 내성 실험은 Cebeci와 Gürakan(10), Kim 등(21), Jung 등(22)의 방법을 변형하여 수행하였다.
- 인공 위산에 대한 내성은 1 mg/mL pepsin(Sigma- Aldrich Co., St. Louis, Mo, USA) 용액에 HCl을 이용하여 pH를 2.5로 조정하여 인공 위산을 제조하였다. 여기에 MRS broth에서 배양한 유산균을 1.
- 0×108 CFU/mL 수준의 각 유산균 현탁액을 접종하여 37°C에서 6시간 배양하며 2시간마다 생균수를 측정하여 인공 담즙산에 대한 내성을 측정하였다. 인공 위액 및 인공 담즙산에서의 생균수 측정은 인공 위액 및 담즙산에서 배양한 각 균주를 멸균한 증류수에서 단계별로 희석하여 MRS 평판배지에 접종한 후, 37℃에서 48시간 동안 배양하고 배양 후 생균수를 측정하여 생존율을 계산하였다.
대상 데이터
- 인공 담즙산에 대한 내성 실험은 Cebeci와 Gürakan(10), Kim 등(21), Jung 등(22)의 방법을 변형하여 수행하였다. 0.02 M cholic acid, 1% deoxycholic acid, 0.05 mg/mL lipase, 0.02 mg/mL pancreatin 용액에 1 N HCl 및 NaOH를 이용하여 pH 8.0으로 조정하여 인공 담즙산을 준비하였다.
- HT-29 cells(human colon adenocarcinoma cells)은 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 10% FBS와 100 units/mL penicillin-streptomycin이 함유된 RPMI 1640을 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator (Forma, model 311S/N29035, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 배양하였다.
- plantarum CBT LP3 KCTC 10782BP(Lp-CB)를 선택하였고, Lac. lactis KFCC 11510P(L-lactis)는 된장에서 분리한 균으로 미생물자원센터(Jeongeup, Korea)에서 구입하여 대조군으로 사용하였다. 각 균주는 MRS broth(Difco, Sparks, MD, USA)를 이용하여 37℃에서 혐기적으로 3차 계대배양하여 프로바이오틱 효능 확인 실험에 사용하였고, in vitro 항암 기능성 실험에서는 이를 원심분리(3,000×g, 5분) 한 후 phosphate buffered saline(PBS)에 2회 세척한 다음 100°C에서 20분 사멸시켜 사용하였다(19).
데이터처리
- Mean values with different letters (a-c) at each incubation time are significantly different (P<0.05) according to Duncan's multiple range test.
- Mean values with different letters (a-e) at each incubation time are significantly different (P<0.05) according to Duncan's multiple range test.
- 각 군 간의 비교는 Duncan's multiple range test를 사용하였으며, 대조군과 비교하여 P 값이 5% 미만일 때 통계학적으로 유의성이 있다고 판정하였다(13).
- 모든 실험 결과는 평균치와 표준편차(mean±SD)를 사용하여 나타내었다.
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