본 연구에서는 우리나라에서 가장 많이 재배되고 있는 캠벨어얼리 포도 품종에서 포도가지를 대상으로 산화방지, 항염증 및 항가려움증 효과를 검증하고 활성물질을 나타내는 지표물질을 추적 조사하였다. 그 결과 포도가지 추출물의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량은 각각 $201.42{\pm}4.16$과 $11.85{\pm}0.44mg\;GAE/g$으로 조사되었다. 또한 캠벨어얼리 포도가지 추출물의 ABTS와 DPPH 라디칼 소거 활성은 각각 $45.60{\pm}0.09$ ($IC_{50}$)과 $299.13{\pm}0.22$ ($IC_{50}$)으로 나타나 산화방지 활성이 우수하였다. 게다가 캠벨어얼리 포도가지 추출물은 지방질다당류로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 전염증성 매개물인 산화질소와 프로스타글란딘$E_2$를 iNOS와 COX-2 분자 발현 억제를 통하여 억제하였고, 전염증성 사이토카인인 인터류킨-1베타와 인터류킨-6를 농도 의존적으로 억제하는 효능이 있었다. 더욱이 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)와 calcium ionophore A23187로 활성화된 인간 유래 비만세포인 HMC-1 세포에서 종양괴사인자-알파와 인터류킨-6를 농도 의존적으로 억제하는 효능이 있었다. 마지막으로 Compound 48/80으로 유도되는 마우스 가려움증을 캠벨어얼리 포도가지 추출물은 효과적으로 억제하였다. 이러한 캠벨어얼리 추출물에서 활성을 나타내는 물질을 추적한 결과 레스베라트롤의 함량이 높게 검출되었다. 그러므로 본 연구의 결과를 종합해 볼 때 캠벨어얼리 포도가지 추출물은 아토피 질환에서 나타나는 염증과 가려움증을 효과적으로 제어할 수 있는 효과적인 소재임을 제시하였다.
본 연구에서는 우리나라에서 가장 많이 재배되고 있는 캠벨어얼리 포도 품종에서 포도가지를 대상으로 산화방지, 항염증 및 항가려움증 효과를 검증하고 활성물질을 나타내는 지표물질을 추적 조사하였다. 그 결과 포도가지 추출물의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량은 각각 $201.42{\pm}4.16$과 $11.85{\pm}0.44mg\;GAE/g$으로 조사되었다. 또한 캠벨어얼리 포도가지 추출물의 ABTS와 DPPH 라디칼 소거 활성은 각각 $45.60{\pm}0.09$ ($IC_{50}$)과 $299.13{\pm}0.22$ ($IC_{50}$)으로 나타나 산화방지 활성이 우수하였다. 게다가 캠벨어얼리 포도가지 추출물은 지방질다당류로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 전염증성 매개물인 산화질소와 프로스타글란딘 $E_2$를 iNOS와 COX-2 분자 발현 억제를 통하여 억제하였고, 전염증성 사이토카인인 인터류킨-1베타와 인터류킨-6를 농도 의존적으로 억제하는 효능이 있었다. 더욱이 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)와 calcium ionophore A23187로 활성화된 인간 유래 비만세포인 HMC-1 세포에서 종양괴사인자-알파와 인터류킨-6를 농도 의존적으로 억제하는 효능이 있었다. 마지막으로 Compound 48/80으로 유도되는 마우스 가려움증을 캠벨어얼리 포도가지 추출물은 효과적으로 억제하였다. 이러한 캠벨어얼리 추출물에서 활성을 나타내는 물질을 추적한 결과 레스베라트롤의 함량이 높게 검출되었다. 그러므로 본 연구의 결과를 종합해 볼 때 캠벨어얼리 포도가지 추출물은 아토피 질환에서 나타나는 염증과 가려움증을 효과적으로 제어할 수 있는 효과적인 소재임을 제시하였다.
This study was designed to investigate the antioxidant activities of the ethanol extracts (GBE) of grape branches (Campbell Early). The total polyphenol and flavonoid content of GBE was $201.42{\pm}4.16$ and $11.85{\pm}0.44mg\;GAE/g$, respectively. The antioxidant activity of G...
This study was designed to investigate the antioxidant activities of the ethanol extracts (GBE) of grape branches (Campbell Early). The total polyphenol and flavonoid content of GBE was $201.42{\pm}4.16$ and $11.85{\pm}0.44mg\;GAE/g$, respectively. The antioxidant activity of GBE was measured using the ABTS and DPPH assays, and the $IC_{50}$ values were $45.60{\pm}0.09$ and $299.13{\pm}0.22$, respectively. GBE inhibited the production of pro-inflammatory mediators (NO, iNOS, $PGE_2$, COX-2, $IL-1{\beta}$, and IL-6) in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages in a dose-dependent manner. Moreover, GBE treatment significantly suppressed the production of $TNF-{\alpha}$ and IL-6 cytokines in phorbol 12-myristate 13-acetate plus calcium ionophore A23187-stimulated HMC-1 human mast cells. Furthermore, the administration of GBE markedly inhibited the scratching behavior induced by the compound 48/80 in ICR mice. These results suggested that GBE has potential as a therapeutic agent against inflammation and itch-related skin diseases.
This study was designed to investigate the antioxidant activities of the ethanol extracts (GBE) of grape branches (Campbell Early). The total polyphenol and flavonoid content of GBE was $201.42{\pm}4.16$ and $11.85{\pm}0.44mg\;GAE/g$, respectively. The antioxidant activity of GBE was measured using the ABTS and DPPH assays, and the $IC_{50}$ values were $45.60{\pm}0.09$ and $299.13{\pm}0.22$, respectively. GBE inhibited the production of pro-inflammatory mediators (NO, iNOS, $PGE_2$, COX-2, $IL-1{\beta}$, and IL-6) in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages in a dose-dependent manner. Moreover, GBE treatment significantly suppressed the production of $TNF-{\alpha}$ and IL-6 cytokines in phorbol 12-myristate 13-acetate plus calcium ionophore A23187-stimulated HMC-1 human mast cells. Furthermore, the administration of GBE markedly inhibited the scratching behavior induced by the compound 48/80 in ICR mice. These results suggested that GBE has potential as a therapeutic agent against inflammation and itch-related skin diseases.
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문제 정의
그러므로 본 연구는 캠벨어얼리의 포도가지 추출물을 대상으로 자체의 산화방지 효능을 검증 한 후 활성화된 설치류 유래 큰 포식세포인 RAW 264.7 세포와 인간 유래 비만세포인 HMC-1 세포에서 항염증 효과를 검증하고 ICR계 마우스를 대상으로 가려움 억제에 대한 효능을 조사하여 보고하고자 한다.
그러므로 iNOS와 COX-2 발현의 억제는 산화질소 및 프로스타글란딘 E2의 생성 억제로 이어지기 때문에 이들의 제어는 염증반응을 제어하는 데 효과적이다. 따라서 본 연구에서 포도가지 추출물은 이들 분자 발현을 효과적으로 제어할 수 있는 우수한 소재라 판단된다.
그러므로 아토피 피부염을 개선하는 데는 효과적으로 가려움증을 억제해야 한다(31,32). 본 연구는 포도가지 추출물이 피부 가려움증 억제에 미치는 영향을 알아보기 위하여 포도가지 추출물(50 mg/kg body weight (BW))과 프레드니솔론(10 mg/kg BW)을 ICR 마우스에 경구 투여하고 1시간 후에 가려움 유발 물질을 마우스 등의 양쪽 어깨 높이 사이에 피하 주사하였다. 그 결과 Fig.
제안 방법
1시간 후 지방질다당류(1 μg/mL)를 처리하여 16시간 배양한 후, PBS로 세척하고 세포를 원심분리 하여 얻은 pellet에 NP40 cell lysis buffer를 첨가하여 얼음에 30분 동안 배양 후 12,000 rpm으로 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었고, Bio-Rad protein assay(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 시약을 사용하여 단백질을 정량하였다.
RAW 264.7 세포를 6 well plate에 최종농도가 2×105 cells/mL가 되도록 분주한 뒤 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 25, 50, 75, 100 μg/mL의 포도가지추출물을 처리하였다.
RAW 264.7 세포를 6 well plate에 최종농도가 2×105 cells/mL가 되도록 분주한 뒤 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 25, 50, 75, 100 μg/mL의 포도가지추출물을 처리한 다음 1시간 후 지방질다당류(1 μg/mL)를 처리하여 16시간 배양하였다.
RAW 264.7 세포를 96 well plate에 최종농도가 2×105 cells/mL가 되도록 분주한 뒤 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 25, 50, 75, 100 μg/mL의 포도가지추출물을 처리한 다음 1시간 후 지방질다당류 (1 μg/mL)를 처리하여 16시간 배양하였다.
1차 항체(iNOS, COX-2, 베타액틴)는 4℃에서 overnight 시킨 후 TBS-T (tris-buffered saline and tween-20) 완충용액(buffer)으로 10분간 3회 세척하였고, 2차 항체는 1:5,000으로 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. TBS-T로 10분간 3회 세척한 후 PVDF 막에 ECL (Pierce Biotechnology) 시약을 처리하여 측정하였다.
그 후 대조군으로서 생리식염수를 경구투여 하였고, 실험군으로서 포도가지 추출물을 50 mg/kg, 양성대조군으로 프레드니솔론(prednisolone) 5 mg/kg씩 경구투여하고, 60분 후에 compound 48/80을 50 μg/site 농도로 0.10 mL씩 마우스 등의 양쪽 어깨 사이 높이에 피하주사(s.c.injection) 하여 가려움증을 유발하였다.
다음은 캠벨어얼리 포도가지 추출물이 iNOS와 COX-2 단백질의 발현 억제를 통하여 산화질소와 프로스타글란딘 E2 생성을 억제하는지 알아보기 위하여 웨스턴블롯을 수행하였다. 그 결과 Fig.
또한 HMC-1 세포를 6 well plate에 최종농도가 5×105 cells/mL가 되도록 분주한 뒤 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 25, 50, 75, 100 μg/mL의 포도가지추출물을 처리한 다음 1시간 후 PMA (30 nM)와 A23187(1 μM)로 동시에 자극하고 16시간 후에 세포 상층액으로부터 종양괴사인자-알파와 인터류킨-6에 대한 ELISA kit를 활용하여 R&D system사가 제공하는 방법으로 종양괴사인자-알파와 인터류킨-6을 측정하고 정량하였다.
마지막으로 캠벨어얼리 포도가지에 함유되어 있는 염증억제 활성 물질을 검증하고자 HPLC를 이용하였으며 각 시료의 주요 성분에 대한 크로마토그램(choromatogram) 결과는 다음과 같이 제시하였다. 분석 시료의 추출물 분석에 사용한 표준성분으로서 루틴(3)은 표준용액에서 머무름시간(min)이 약 10.
무균환경에서 사육된 4주령의 수컷 ICR 마우스는 중앙실험동물(주)(Seoul, Korea)에서 구입하였고, 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일간 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 사육환경은 낮과 밤의 주기를 12시간씩 하였고, 온도(20-22℃)와 습도(50-60%)는 일정하게 유지하였으며, 전주대학교 실험동물위원회의 규정에 준하여 실험하였다.
세포배양액 100 μL와 그리스시약 100 μL를 혼합하여 실온에서 15분 동안 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기(Tecan Group Ltd., Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였고, 질산나트륨(sodium nitrate)으로 표준곡선을 작성하여 산화질소 생성량을 산출하였다.
1% 포름산(formic acid) 수용액(A)과 아세토나이트릴(acetonitrile) (B)로 20% B-5 min, 30% B-12 min, 60% B20 min, 80% B-30 min, 80% B-34 min, 60%-B 37 min, 20% B-40 min까지 기울기(gradient) 조건으로 분석하였다. 외부표준물질(External standard)는 트랜스-레스베라트롤(trans-resveratrol), 퀘세틴(quercetin), 루틴(rutin)을 사용하였으며, 각 표준물질의 정성 및 정량은 머무름시간(retention time)과 고유의 표준품과 비교하여 보정선으로부터 추출물의 함량 결과를 얻었다.
5 mL/min, 15 μL를 injection volume으로 설정하였다. 이동상은 0.1% 포름산(formic acid) 수용액(A)과 아세토나이트릴(acetonitrile) (B)로 20% B-5 min, 30% B-12 min, 60% B20 min, 80% B-30 min, 80% B-34 min, 60%-B 37 min, 20% B-40 min까지 기울기(gradient) 조건으로 분석하였다. 외부표준물질(External standard)는 트랜스-레스베라트롤(trans-resveratrol), 퀘세틴(quercetin), 루틴(rutin)을 사용하였으며, 각 표준물질의 정성 및 정량은 머무름시간(retention time)과 고유의 표준품과 비교하여 보정선으로부터 추출물의 함량 결과를 얻었다.
추출물의 최종 농도가 500 μg/mL 되도록 정량하여 50 μL에 준비된 ABTS 용액 950 μL를 첨가하여 암소에서 30분간 반응시킨 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였다.
퀘세틴을 표준물질로 하여 0-100 μg/mL 농도 범위에서 얻은 표준 보정선으로부터 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정하였다.
포도가지 추출물을 처리할 경우 종양괴사인자-알파, 인터류킨-6, 인터류킨-1베타 같은 전염증성 인자의 생성을 억제하는지 알아보기 위하여 포도가지 추출물(0, 25, 50, 75, 100 μg/mL)을 농도별로 처리하고 1시간 후에 지방질다당류(1 μg/mL) 또는 PMA(30 nM)와 A23187 (1 μM)로 동시에 자극하고 16시간 배양한 다음 상층액을 얻어 ELISA 분석을 수행하여 알아본 결과는 Fig. 3에 나타내었다.
포도가지 추출물이 산화질소 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 포도가지 추출물(0, 25, 50, 75, 100 μg/mL)을 농도별로 처리하고 1시간 후에 지방질다당류(1 μg/mL)로 자극하여 16시간 배양한 다음 산화질소 및 프로스타글란딘 E2 생성량을 확인하였다(Fig. 1).
포도가지추출물의 가려움증 억제 효과를 확인하기 위하여 ICR 마우스를 실험군당 5마리씩 각각 투명 아크릴 케이지(20×26×13 cm)에 한마리씩 넣고, 30분 동안 동일 환경에서 방치하여 안정시켰다.
표준곡선(standard curve)는 갈산을 사용하여 31.25-1000 μg/mL 농도로 제조한 후 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 보정선으로부터 시료 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정하였다.
항산화 활성을 평가하는 방법으로 DPPH와 ABTS를 이용하여 확인하였다. 캠벨어얼리 포도가지 추출물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성을 알아본 결과 Table 1에 나타낸 바와 같이 DPPH 라디칼 소거 활성 IC50은 45.
대상 데이터
10% FBS (fetal bovine serum, Life Technology, Carlsbad, CA, USA)와 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Life Technology) 배지를 사용하였고, 인간유래비만 세포주인 HMC-1 세포는 10% FBS와 glutamax가 첨가된 IMDM (Iscove’s modified Dulbecco’s medium, Life Technology) 배지를 사용하여 각각 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
1차 항체 iNOS는 BD Pharmingen사(San Diego, CA, USA)에서, COX-2는 Cayman Chemical사(Ann Arbor, MI, USA)로부터 구입하였고, 베타액틴(β-actin)과 2차 항체 goat anti-rabbit IgG HRP-conjugated antibody는 Santa Cruz Biotechnology사(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다.
6×150 mm, 3 μm pore size), 온도는 35℃로 하였다. 검출기는 Agilent DAD를 사용하였고, 파장(wavelength)은 260 nm로 하였다. 유속은 0.
무균환경에서 사육된 4주령의 수컷 ICR 마우스는 중앙실험동물(주)(Seoul, Korea)에서 구입하였고, 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일간 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 사육환경은 낮과 밤의 주기를 12시간씩 하였고, 온도(20-22℃)와 습도(50-60%)는 일정하게 유지하였으며, 전주대학교 실험동물위원회의 규정에 준하여 실험하였다.
본 실험에 사용된 세포는 마우스 유래 큰포식세포주인 RAW 264.7 세포로 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 10% FBS (fetal bovine serum, Life Technology, Carlsbad, CA, USA)와 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Life Technology) 배지를 사용하였고, 인간유래비만 세포주인 HMC-1 세포는 10% FBS와 glutamax가 첨가된 IMDM (Iscove’s modified Dulbecco’s medium, Life Technology) 배지를 사용하여 각각 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
본 실험에 사용된 캠벨어얼리 포도가지는 전라북도 김제시 백구면 여씨포도농장에서 2015년 11월 11일에 구입하였다. 구입한 재료는 수돗물에서 잘 세척한 다음 증류수에 간단히 침지시켜 물기를 제거한 후 40℃ 건조기에서 충분히 건조하였다.
분석을 위한 검액을 제조하기 위해 포도가지 추출물을 취하여 70% 메탄올수용액(MeOH aqueous solution, v/v)을 이용하였다. 원심분리 후 상층액을 0.
모든 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 대조군과 실험군 간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Microsoft Excel program의 Student’s t-test를 사용하여 실시하였으며, 조사 항목들 간의 유의성 검정은 p<0.05 수준에서 실시하였다.
이론/모형
ABTS 라디칼 소거능은 Re 등(17)의 방법에 의하여 측정하였다. ABTS 7.
DPPH 라디칼 소거 활성은 Blois(16)의 방법으로 측정하였다. 포도가지 추출물을 500 μg/mL으로 정량하여 증류수에 녹여 96 well plate에 각 시료를 100 μL를 주입하고, 동시에 0.
injection) 하여 가려움증을 유발하였다. 가려움증 유발물질을 주사한 마우스는 곧바로 Mihara의 방법(18)을 따라 micro-camera (ONCCTV, Seoul, Korea)를 사용하여 60분 동안 녹화하였으며, 뒷발로 가려움증 유발물질이 주입된 부위를 긁는 횟수를 이중맹검법으로 계수하여 평가하였다.
총 폴리페놀은 폴린-시오칼토(Folin Ciocalteu) 법(14)에 따라서 정량하여 나타내었다. 포도가지추출물 0.
총 플라보노이드는 Moreno 등(15)의 방법에 따라 1 mg/mL 농도의 시료액에 10% 질산알루미늄(aluminum nitrate) 0.1 mL, 1M 아세트산포타슘(potassium acetate) 0.1 mL 및 에탄올(ethanol) 4.3 mL를 차례로 가하여 혼합하고 실온에서 40분간 방치한 다음 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 퀘세틴을 표준물질로 하여 0-100 μg/mL 농도 범위에서 얻은 표준 보정선으로부터 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정하였다.
성능/효과
생성을 억제하는지 알아보기 위하여 웨스턴블롯을 수행하였다. 그 결과 Fig. 2에 보이는 것처럼, 지방질다당류를 처리한 군에서 iNOS와 COX-2의 발현양이 무처리군과 비교하여 크게 증가하였지만, 포도가지 추출물을 처리한 군에서는 지방질다당류 처리군과 비교하여 iNOS와 COX-2의 발현양이 농도의존적으로 뚜렷한 감소 효능을 보였으며, 이것은 산화질소와 프로스타글란딘 E2 생성 억제 효과와 유사한 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 포도가지 추출물 처리 시 iNOS와 COX-2 단백질의 발현 억제를 통하여 산화질소와 프로스타글란딘 E2 생성을 억제함으로써 항염증 효능을 나타내는 것으로 사료된다.
3에 나타내었다. 그 결과 Fig. 3A에 보이는 것처럼 RAW 264.7 세포에서 지방질다당류를 처리한 군에서 인터류킨-6와 인터류킨-1 베타 사이토카인 생성양이 무처리군과 비교하여 크게 증가하였지만, 포도가지 추출물을 농도별로 처리하였을 경우 지방질다당류에 의해 증가한 인터류킨-6, 인터류킨-1베타 사이토카인을 억제하였고, 인터류킨-1베타 사이토카인 억제 효능이 보다 더 낮은 농도에서 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 Fig.
그 결과 Fig. 4와 같이 compound 48/80을 피하에 주입한 실험군은 284.1±19.4회/60분으로 정상 대조군(2.4 ±1.0회/60분)에 비해서 긁는 횟수가 현저히 증가하였다(p<0.001).
1). 그 결과 지방질다당류를 처리한 군에서 산화질소 및 프로스타글란딘 E2 생성량이 무처리군과 비교하여 크게 증가하였지만, 포도가지 추출물을 전처리한 군에서는 지방질다당류 처리군과 비교하여 산화질소 및 프로스타글란딘 E2 생성량이 농도 의존적으로 감소하였으며, 프로스타글란딘 E2 생성 억제 효능이 매우 우수하였다. 산화질소는 반응성이 높은 생체 가스로 산화질소합성효소(synthase)에 의해 L-arginine으로부터 생성되어지며, 빠르게 산화되면서 활성질소종을 유도하면서 염증반응을 더욱 가속시켜 조직손상을 야기한다(20).
그 결과 포도가지 추출물(GBE)의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 각각 201.42±4.16 mg/g과 11.85±0.44 mg/g을 나타내었다.
그러나 포도가지 추출물을 처리한 실험군은 compound 48/80이 유도하는 가려움증을 억제하는 효과가 매우 우수하였으며, compound 48/80이 유도하는 가려움 횟수가 116.4±5.7/60분으로 약 41% 억제 효과가 있었다(p<0.001).
또한 프로스타글란딘 E2는 cyclooxygenase-2 (COX-2)로부터 생산되어 염증반응에 관여하는 매개물로 작용한다(21). 그러므로 본 연구결과 산화질소, 프로스타글란딘 E2와 같은 염증 매개물을 억제하는데 있어 캠벨어얼리 포도가지 추출물은 산화질소 및 프로스타글란딘 E2 억제를 통하여 염증반응을 제어할 수 있을 것으로 사료된다. 지금까지 포도를 비롯한 포도씨, 포도 껍질, 포도 잎 등을 활용한 추출물 및 폴리페놀 성분이 세포 및 동물 실험에서 산화질소, 프로스타글란딘 E2, COX-2, 종양괴사인자-알파 같은 염증 인자들을 억제함으로써 우수한 항염 효능을 보인다고 보고되었다(22-26).
이러한 전염증성 사이토카인의 억제는 급성 및 만성 염증을 억제하는데 효과적이다. 그러므로 본 연구에서 얻은 캠벨포도가지 추출물은 활성화된 큰포식세포에서 종양괴사인자-알파, 인터류킨-1베타 및 인터류킨-6를 효과적으로 제어할 수 있는 우수한 천연물 소재라 판단된다.
7 세포에서 지방질다당류를 처리한 군에서 인터류킨-6와 인터류킨-1 베타 사이토카인 생성양이 무처리군과 비교하여 크게 증가하였지만, 포도가지 추출물을 농도별로 처리하였을 경우 지방질다당류에 의해 증가한 인터류킨-6, 인터류킨-1베타 사이토카인을 억제하였고, 인터류킨-1베타 사이토카인 억제 효능이 보다 더 낮은 농도에서 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 Fig. 3B에 나타낸 바와 같이 HMC-1 세포에서 PMA와 A23187 처리군과 비교하여 포도가지 추출물이 처리된 경우 종양괴사인자-알파와 인터류킨-6 사이토카인 생성을 억제하였으며, 종양괴사인자-알파 사이토카인 억제 효능이 보다 더 우수한 것을 확인 할 수 있었다. 종양괴사인자-알파, 인터류킨-1베타 및 인터류킨-6는 큰포식세포와 CD4+ 세포 중 Th1 세포에서 생성되는 전염증성 사이토카인으로 아토피 피부염을 가속화시켜 활성산소종과 활성질소종 등 산화적 스트레스 물질을 대량생산하여 주변 조직을 파괴한다(28-30).
2에 보이는 것처럼, 지방질다당류를 처리한 군에서 iNOS와 COX-2의 발현양이 무처리군과 비교하여 크게 증가하였지만, 포도가지 추출물을 처리한 군에서는 지방질다당류 처리군과 비교하여 iNOS와 COX-2의 발현양이 농도의존적으로 뚜렷한 감소 효능을 보였으며, 이것은 산화질소와 프로스타글란딘 E2 생성 억제 효과와 유사한 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 포도가지 추출물 처리 시 iNOS와 COX-2 단백질의 발현 억제를 통하여 산화질소와 프로스타글란딘 E2 생성을 억제함으로써 항염증 효능을 나타내는 것으로 사료된다. 생체에서 iNOS는 nNOS와 eNOS와 달리 면역반응에서 많은 양의 산화질소를 생성시키는 효소로 알려져 있으며(20), COX-2도 COX-1과 달리 염증반응에 프로스타글란딘 E2를 대량으로 생산할 수 있는 유도성 효소로 작용한다(27).
그러나 본 연구결과는 약 14배 레스베라트롤 함량이 높은 것으로 확인되었다. 이러한 결과들을 종합하면 플라보노이드류 성분이 다량 포함된 포도가지 추출물은 산화방지, 항염증 및 가려움증 억제 효능이 우수할 것으로 추측할 수 있다. 본 연구에서 함량 분석에 사용된 플로보노이드류 화합물 이외에 포도가지 추출물의 주성분으로 확인된 4번과 5번 peak는 HPLC 상에서 주요 성분으로서 추가 연구를 통해 분리정제 및 구조 동정을 해야 할 필요성이 제기되었다.
캠벨어얼리 포도가지 추출물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성을 알아본 결과 Table 1에 나타낸 바와 같이 DPPH 라디칼 소거 활성 IC50은 45.60±0.09 μg/mL을 나타내었고, ABTS 라디칼 소거 활성 IC50은 299.13±0.22 μg/mL을 나타내었다.
항가려움증 효과가 우수한 약물로 알려진 프레드니솔론(145.8±13.2회/60분)과 비교하였을 때 포도가지 추출물의 효과는 프레드니솔론 보다 효과가 높았다.
후속연구
이러한 결과들을 종합하면 플라보노이드류 성분이 다량 포함된 포도가지 추출물은 산화방지, 항염증 및 가려움증 억제 효능이 우수할 것으로 추측할 수 있다. 본 연구에서 함량 분석에 사용된 플로보노이드류 화합물 이외에 포도가지 추출물의 주성분으로 확인된 4번과 5번 peak는 HPLC 상에서 주요 성분으로서 추가 연구를 통해 분리정제 및 구조 동정을 해야 할 필요성이 제기되었다.
2회/60분)과 비교하였을 때 포도가지 추출물의 효과는 프레드니솔론 보다 효과가 높았다. 앞으로 포도가지 추출물을 대상으로 가려움 억제에 대한 분자적 기전을 규명할 필요가 있으며, 본 연구 결과 포도가지 추출물의 우수한 항가려움증 효과는 아토피 피부질환과 같은 피부 가려움증에 사용될 수 있는 매우 우수한 소재라 판단된다.
5%까지 나타내었다. 이러한 결과와 비교해 볼 때 겨울에 전정 시 버려지는 포도가지의 효능이 더욱 우수한 것을 나타내므로 부산물로서 포도가지를 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
지금까지 포도를 비롯한 포도씨, 포도 껍질, 포도 잎 등을 활용한 추출물 및 폴리페놀 성분이 세포 및 동물 실험에서 산화질소, 프로스타글란딘 E2, COX-2, 종양괴사인자-알파 같은 염증 인자들을 억제함으로써 우수한 항염 효능을 보인다고 보고되었다(22-26). 이러한 결과와 비교해 볼 때 포도가지 추출물은 항염증 효능이 뛰어난 소재라 생각되며, 향후 활용가치가 우수한 소재라 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
최근 산업화로 인하여 발생한 부작용은?
최근 산업화된 나라는 환경오염과 생활방식의 변화에 따른 아토피 피부염과 같은 알레르기성 피부질환이 급증하고 있다(1). 이러한 알레르기성 아토피 피부염은 과도한 면역세포 작용으로 인해서 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-α, TNF-α), 인터류킨-1베타(interleukin-1β, IL-1β), 인터류킨-6(IL-6) 등 일련의 전염증성 사이토카인(2)을 생산하게 되어 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, ·OH), 과산화음이온(superoxide anion, O2·−), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2) 등의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)과 이산화질소(nitrogen dioxide, NO2), 삼산화이질소(dinitrogen trioxide, N2O3) 등 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)을 대량 생산하기 때문에 주변 조직의 손상을 야기한다(3,4).
알레르기성 아토피 피부염은 어떤 조직 손상을 야기하는가?
최근 산업화된 나라는 환경오염과 생활방식의 변화에 따른 아토피 피부염과 같은 알레르기성 피부질환이 급증하고 있다(1). 이러한 알레르기성 아토피 피부염은 과도한 면역세포 작용으로 인해서 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-α, TNF-α), 인터류킨-1베타(interleukin-1β, IL-1β), 인터류킨-6(IL-6) 등 일련의 전염증성 사이토카인(2)을 생산하게 되어 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, ·OH), 과산화음이온(superoxide anion, O2·−), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2) 등의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)과 이산화질소(nitrogen dioxide, NO2), 삼산화이질소(dinitrogen trioxide, N2O3) 등 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)을 대량 생산하기 때문에 주변 조직의 손상을 야기한다(3,4). 특히 산화질소(nitric oxide, ·NO)와 O2−가 함께 반응할 경우 매우 반응성이 높은 reactive oxidant peroxynitrite anion (ONOO−)을 생산하여 심각한 조직손상을 야기한다(5).
염증을 동반하는 피부질환을 개선하기 위한 산화방지 물질로 대표적인 음식인 포도의 특징은?
포도는 안토시아닌(anthocyanin), 카테킨(catechin), 퀘세틴(quercetin) 및 레스베라트롤(resveratrol) 등의 폴리페놀을 다량 함유하고 있다(7). 특히 포도에 함유되어 있는 레스베라트롤은 외부환경으로부터 자신을 보호하기 위해 스스로 생성하는 저분자 파이토케미칼(phytochemical)의 일종으로 노화 방지(8), 항암(9), 항당뇨(10) 효과가 있을 뿐만 아니라 동맥경화 예방(11) 및 혈행 개선(12)에도 효과가 있는 것으로 알려지면서 이 분야의 연구자들에게 주목받고 있다.
참고문헌 (32)
Finlay AY. Quality of life in atopic dermatitis. J. Am. Acad. Dermatol. 45: S64-S66 (2001)
Shishido T, Nozaki N, Takahashi H, Arimoto T, Niizeki T, Koyama Y, Abe J, Takeishi Y, Kubota I. Central role of endogenous Toll-like receptor-2 activation in regulating inflammation, reactive oxygen species production, and subsequent neointimal formation after vascular injury. Biochem. Biophys. Res. Commun. 345: 1446-1453 (2006)
Wink DA, Hanbauer I, Grisham MB, Laval F, Nims RW, Laval J, Cook J, Pacelli R, Liebmann J, Krishna M, Ford PC, Mitchell JB. Chemical biology of nitric oxide: Regulation and protective and toxic mechanisms. Curr. Top. Cell Regul. 34: 159-187 (1996)
Bouayed J, Bohn T. Exogenous antioxidants-double-edged swords in cellular redox state: Health beneficial effects at physiologic doses versus deleterious effects at high doses. Oxid. Med. Cell Longev. 3: 228-237 (2010)
Iacopini P, Baldi M, Storchi P, Sebastiani L. Catechin, epicatechin, quercetin, rutin and resveratrol in red grape: Content, in vitro antioxidant activity and interactions. J. Food Compos. Anal. 21: 589-598 (2008)
Baxter RA. Anti-aging properties of resveratrol: Review and report of a potent new antioxidant skin care formulation. J. Cosmet. Dermatol. 7: 2-7 (2008)
Lee SM, Yang H, Tartar DM, Gao B, Luo X, Ye SQ, Zaghouani H, Fang D. Prevention and treatment of diabetes with resveratrol in a non-obese mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia 54: 1136-1146 (2011)
Azorin-Ortuno M, Yanez-Gascon MJ, Pallares FJ, Rivera J, Gonzalez-Sarrias A, Larrosa M, Vallejo F, Garcia-Conesa MT, Tomas-Barberan F, Espin JC. A dietary resveratrol-rich grape extract prevents the developing of atherosclerotic lesions in the aorta of pigs fed an atherogenic diet. J. Agr. Food Chem. 60: 5609-5620 (2012)
Kang HJ, Kim HS, Jeon IH, Mok JY, Han KS, Jang SI. Effects of antioxidant and blood flow improvement of grape leaf extract and resveratrol from vitis romaneti. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 42: 1736-1743 (2013)
Chang EH, Jeong SM, Park KS, Lim BS. Contents of phenolic compounds and trans-resveratrol in different parts of Korean new grape cultivars. Korean J. Food Sci. Thechol. 45: 708-713 (2013)
Blainski A, Lopes GC, de Mello JC. Application and analysis of the folin ciocalteu method for the determination of the total phenolic content from Limonium Brasiliense L. Molecules 18: 6852-6865 (2013)
Moreno DA, Carvajal M, Lopez-Berenguer C, Garcoa-Viguera C. Chemical and biological characterisation of nutraceutical compounds of broccoli. J. Pharm. Biomed. Anal. 41: 1508-1522 (2006)
Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic. Biol. Med. 26: 1231-1237 (1999)
Mihara K, Kuratani K, Matsui T, Nakamura M, Yokota K. Vital role of the itch-scratch response in development of spontaneous dermatitis in NC/Nga mice. Br. J. Dermatol. 151: 335-345 (2004)
Kim JH, Choi SK, Yu YS, Yoon KS, Seo JS. Physiologically active components and antioxidant capacity of grapevine leaves at growth stages. Korean J. Food Sci. Technol. 44: 772-778 (2012)
Bak MJ, Truong VL, Kang HS, Jun M, Jeong WS. Anti-inflammatory effect of procyanidins from wild grape (Vitis amurensis) seeds in LPS-induced RAW 264.7 cells. Oxid. Med. Cell Longev. 2013: 409321 (2013)
Filip GA, Postescu ID, Bolfa P, Catoi C, Muresan A, Clichici S. Inhibition of UVB-induced skin phototoxicity by a grape seed extract as modulator of nitrosative stress, ERK/NF-kB signaling pathway and apoptosis, in SKH-1 mice. Food Chem. Toxicol. 57: 296-306 (2013)
Yoon CS, Kim DC, Ko WM, Kim KS, Lee DS, Kim DS, Cho HK, Seo J, Kim SY, Oh H, Kim YC. Anti-neuroinflammatory effects of quercetin-3-O-glucuronide isolated from the leaf of Vitis labruscana on LPS-induced neuroinflammation in BV2 cells. Kor. J. Pharmacogn. 45: 17-22 (2014)
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