본 연구는 섬애약쑥의 생리활성 규명을 위한 연구의 일환으로 물 추출물의 항염증 활성 및 간 염증에 대한 보호효과를 세포수준에서 확인하였다. 세포독성이 없는 $100{\sim}400{\mu}g/ml$의 농도 범위에서 섬애약쑥 추출물은 HepG2 세포에서 nitric oxide (NO)와 reactive nitrogen species (ROS)생성을 농도의존적으로 저해하였으며, 간염질환과 밀접한 관계가 있는 cytokine인 M-CSF와 IL-8의 발현을 감소시켰다. 또한 직접적인 간 손상을 나타낼 수 있는 지표인 AST와 ALT의 발현을 유의성 있게 감소시키는 결과를 얻을 수 있었다. 본 실험을 통해서 섬애약쑥물 추출물은 세포독성이 없는 $200{\sim}400{\mu}g/ml$의 범위에서 농도의존적으로 간 염증의 개선 효과를 가질 것이라는 단서를 확인하였다.
본 연구는 섬애약쑥의 생리활성 규명을 위한 연구의 일환으로 물 추출물의 항염증 활성 및 간 염증에 대한 보호효과를 세포수준에서 확인하였다. 세포독성이 없는 $100{\sim}400{\mu}g/ml$의 농도 범위에서 섬애약쑥 추출물은 HepG2 세포에서 nitric oxide (NO)와 reactive nitrogen species (ROS)생성을 농도의존적으로 저해하였으며, 간염질환과 밀접한 관계가 있는 cytokine인 M-CSF와 IL-8의 발현을 감소시켰다. 또한 직접적인 간 손상을 나타낼 수 있는 지표인 AST와 ALT의 발현을 유의성 있게 감소시키는 결과를 얻을 수 있었다. 본 실험을 통해서 섬애약쑥물 추출물은 세포독성이 없는 $200{\sim}400{\mu}g/ml$의 범위에서 농도의존적으로 간 염증의 개선 효과를 가질 것이라는 단서를 확인하였다.
Artemisia, a plant widely used as traditional herbal medicine in many countries, has drawn attention of the researchers. And its extracts or compounds are known to have an efficacy of antioxidant, anti-diabete, anti-cancer, anti-inflammation and neuroprotection. Sumaeyaksuk is a variant of the Artem...
Artemisia, a plant widely used as traditional herbal medicine in many countries, has drawn attention of the researchers. And its extracts or compounds are known to have an efficacy of antioxidant, anti-diabete, anti-cancer, anti-inflammation and neuroprotection. Sumaeyaksuk is a variant of the Artemisia argyi and major constituents are eupatilin and jaceosidin. This study was performed to investigate the effects of the sumaeyaksuk aqueous extract on inflammatory response induced by lipopolysaccharide (LPS) in human hepatoma HepG2 cells. To examine the potential hepatoprotective properties of sumaeyaksuk extract, cell viability, as well as nitric oxide (NO), reactive oxygen species (ROS), macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), interleukin-8 (IL-8) levels, alanine transaminase (ALT), and aspartate transaminase (AST) activities, were measured. Cytotoxic activity of extracts on HepG2 cells was measured by MTT assay. Sumaeyaksuk extract did not induce cytotoxicity at concentrations of $0{\sim}400{\mu}g/mL$. NO and ROS levels significantly decreased with increasing concentration of the extract. The secretion levels of M-CSF and IL-8 were suppressed by sumaeyaksuk extract in a dose-dependent manner. Moreover, ALT (75.4%) and AST (61.6%) levels significantly decreased in sumaeyaksuk extract-treated cells at $400{\mu}g/mL$. These results suggested that the sumaeyaksuk extract attenuates the LPS-induced hepatotoxicity resulting from regulation of inflammatory factors and could potentially be used as a hepatitis therapeutic agent.
Artemisia, a plant widely used as traditional herbal medicine in many countries, has drawn attention of the researchers. And its extracts or compounds are known to have an efficacy of antioxidant, anti-diabete, anti-cancer, anti-inflammation and neuroprotection. Sumaeyaksuk is a variant of the Artemisia argyi and major constituents are eupatilin and jaceosidin. This study was performed to investigate the effects of the sumaeyaksuk aqueous extract on inflammatory response induced by lipopolysaccharide (LPS) in human hepatoma HepG2 cells. To examine the potential hepatoprotective properties of sumaeyaksuk extract, cell viability, as well as nitric oxide (NO), reactive oxygen species (ROS), macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), interleukin-8 (IL-8) levels, alanine transaminase (ALT), and aspartate transaminase (AST) activities, were measured. Cytotoxic activity of extracts on HepG2 cells was measured by MTT assay. Sumaeyaksuk extract did not induce cytotoxicity at concentrations of $0{\sim}400{\mu}g/mL$. NO and ROS levels significantly decreased with increasing concentration of the extract. The secretion levels of M-CSF and IL-8 were suppressed by sumaeyaksuk extract in a dose-dependent manner. Moreover, ALT (75.4%) and AST (61.6%) levels significantly decreased in sumaeyaksuk extract-treated cells at $400{\mu}g/mL$. These results suggested that the sumaeyaksuk extract attenuates the LPS-induced hepatotoxicity resulting from regulation of inflammatory factors and could potentially be used as a hepatitis therapeutic agent.
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문제 정의
따라서 섬애약쑥 추출물이 간세포에 미치는 영향을 확인하고자 LPS로 염증이 유도된 HepG2 세포에서 효능을 검토하였다. LPS 처리한 HepG2 세포에 대한 섬애약쑥 물 추출물 처리에 의한 세포생존율을 평가한 결과 섬애약쑥은 400 μg/ml 농도까지 무처리 대조군에 비해 유의한 생존율의 감소가 확인되지 않았다(Fig.
본 연구에서는 황해쑥의 일종인 섬애약쑥의 기능성 규명 및 간기능 개선 식품소재 개발을 위한 기초 연구의 일환으로 섬애약쑥 열수 추출액을 대상으로 간 기능 개선 활성을 확인 하고자 하였다. 이를 위해 우선 항염증 활성지표를 확인하였으며 다음으로 간 독성 지표를 인간 간세포주인 HepG2 세포에서 검증하였다.
제안 방법
96 well plate에 세포농도 2.5×105 cells/ml로 분주한 다음 세포부착을 위해 24시간 배양한 후시료를 농도별로 처리하여 세포의 cytotoxicity를 확인하였다.
, Seoul, Korea)을 구입하여 사용하였다. ALT 및 AST 활성은 기질액인 L-aspartic acid 및 DL-alanine 1 ml에 배양액 0.2 ml를 가해 잘 혼합한 후 37℃에서 AST는 60분, ALT는 30분간 항온하였다. 정색시약 1 ml를 가하고 잘 혼합하여 실온에서 20분간 보관한 후 0.
AST 활성은 표준곡선을 이용하여 Karmen unit으로 나타내었다. ALT와 AST의 활성 비교를 위하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 대비한 시료 처리군의 활성을 비교하여 백분율로 나타내었다.
Dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA)는 세포막을 통해 확산되며 세포 내 esterase에 의해 효소적으로 가수분해 되어 비형광성 DCF-H가 되며, 세포 내 ROS가 존재할 경우 매우 빠르게 높은 형광을 띈 DCF로 산화된다[20]. DCFH-DA를 이용하여 세포 내 ROS 생성량을 측정함으로써 섬애약쑥 추출물의 산화적 스트레스를 저하시키는 효과를 확인하였다(Fig. 3). HepG2 세포의 ROS 생성을 확인하였을 때, LPS를 처리하지 않은 세포군에서는 DCF-DA로 염색된 세포가 적었고, LPS로 자극한 세포는 DCF로 염색된 세포가 많은 것으로 보아 세포 내의 ROS 생성이 활발한 것을 알 수 있었다.
Intracellular ROS 측정은 intracellular ROS assay kit (Cell biolabs, Arions, CA, USA)을 이용하여 측정하였다. 96 well black plate에 5×104 cell/well의 HepG2 cell을 black plate에 분주한 후 배양하여 세포를 well에 부착시켜 serum free DMEM 배지로 교환하였다.
LPS 처리를 통한 간세포 독성 유도 실험과 같은 방법으로 시료를 처리한 후 배양액을 취해 배양액 중에 유리된 alanine transaminase (ALT) 및 aspartate transaminase (AST) 효소의 활성을 측정하였다. ALT와 AST의 활성은 ALT, AST 측정용 시액(Asan pharmaceutical Co.
로 유지하면서 배양하였다. LPS를 통한 간세포 독성 유도 실험을 실시하기 전에 추출물의 독성을 확인하고자 HepG2 세포에서 cytotoxicity test를 수행하였다. 96 well plate에 세포농도 2.
Lysis buffer 100 μl를 첨가하여 혼합한 후 fluorescence microplate reader (VICTOR3™ Multilabel Plate Reader, PerkinElmer life and analytical sciences, Shelton, CT, USA)를 이용하여 excitation 485 nm, emisssion 535 nm에서 형광을 측정하여 LPS 단독 처리군과 시료 처리군에 대한 ROS 생성을 비교하여 상대적인 값으로 나타내었다.
M-CSF와 IL-8의 생성양은 Enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA) kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하였다. Anti-mouse M-CSF와 IL-8로 precoating된 96 well plate에 각각 배양액 50 μl 혹은 standard reagent를 넣은 후 biotinlylated antibody reagent 50 μl씩을 첨가하여 2시간 반응시켰다.
회수된 상층액 중 100 μl를 취해 그리스 시약 100 μl와 혼합하여 상온에서 10분간 반응시킨 후 microplate reader (Epoch, Bioteck, Winooski, VT, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO 생성 억제 활성은 LPS 단독 처리군 대비 시료 처리군의 NO 생성량을 비교하여 상대적인 값으로 나타내었다.
간 조직의 손상은 간소엽 중심부의 괴사를 관찰하거나 세포에서 유리되는 특정 효소의 유출을 측정함으로써 확인할 수 있는데 세포 내에서 유리되는 효소 중 AST와 ALT는 간 손상을 나타내는 대표적인 지표로써 간세포의 괴사와 간조직의 파괴가 진행됨에 따라 아미노기 전이효소가 혈중으로 유리되어 높게 나타나는 것으로 알려져 있으므로[7] 본 실험에서 간세포의 변성 및 괴사의 지표물질로 사용하였다. AST는 glutamate의 amino기를 oxaloacetate로 전이시켜주는 enzyme으로 amino기가 전이되면 glutamate는 α-ketoglutarate가 되고 oxaloacetate는 aspartate가 된다.
염증 반응 부위에서 NO의 과다발현은 많은 염증과 자가 면역 질환의 매개물질로 작용한다는 것은 잘 알려져 있다[8]. 그래서 각추출물들의 NO 생성 억제효과를 LPS 처리한 간암 세포주에서 실험하였다.
를 그리스 시약(griess reagent)으로 측정하였다. 그리스 시약(0.5%의 설파닐아미드, 2.5%의 인산 및 0.5%의 나프틸에틸렌아민)은 아질산염과 화학 반응하여 보라색의 아조염을 형성하고 이것은 NO의 농도와 일치하기 때문에, 아조염의 농도로부터 아질산염의 농도를 추정하기 위해 NO 생성정도를 비교하였다. 다양한 농도의 시료(100, 150, 200, 400 μg/ml)를 각 well에 처리한 다음, 30분 후에 LPS 1 μg/ml를 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 세포 상층액을 회수하였다.
다양한 농도의 시료(100, 150, 200, 400 μg/ml)를 각 well에 처리한 다음, 30분 후에 LPS 1 μg/ml를 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후 세포 상층액을 회수하였다.
또한 M-CSF은 염증 반응 시 분비가 촉진되는 cytokine으로, 급성 및 만성 간염이 있는 사람에서 M-CSF의 농도가 유의적으로 증가한다는 보고가 있으며[13], HepG2 세포에서도 내생적(endogenous)으로 발현되는 cytokine으로 알려져 있다[28, 33]. 따라서 기존의 연구 결과를 토대로 볼 때 간염 환자들에서 유의적으로 발현이 증가된 cytokine인 IL-8과 M-CSF가 HepG2 세포에서도 내생적으로 발현되기 때문에 이들은 적절한 in vitro 염증반응지표로 사료되어 본 실험에 적용하였다. 섬애약쑥물 추출물에 의한 HepG2 세포의 IL-8의 분비량을 측정하고, 이를 LPS 단독 처리 대조군에 대한 %비율로 나타내었다(Fig.
따라서 기존의 연구 결과를 토대로 볼 때 간염 환자들에서 유의적으로 발현이 증가된 cytokine인 IL-8과 M-CSF가 HepG2 세포에서도 내생적으로 발현되기 때문에 이들은 적절한 in vitro 염증반응지표로 사료되어 본 실험에 적용하였다. 섬애약쑥물 추출물에 의한 HepG2 세포의 IL-8의 분비량을 측정하고, 이를 LPS 단독 처리 대조군에 대한 %비율로 나타내었다(Fig. 4A). 그 결과 쑥 추출물은 400 μg/ml의 농도에서 약 20%까지 IL-8의 분비를 유의적으로 감소시켰다(p<0.
세포로부터 생성되는 NO의 양은 Giustarini 등(2008)의 방법[8]을 응용하여, 세포배양액 중에 존재하는 NO2-를 그리스 시약(griess reagent)으로 측정하였다. 그리스 시약(0.
5×105 cells/ml로 분주한 다음 세포부착을 위해 24시간 배양한 후시료를 농도별로 처리하여 세포의 cytotoxicity를 확인하였다. 시료의 cytotoxicity는 cell counting kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japan)을 이용하여 측정하였다.
섬애약쑥은 경남 남해군에서 재배된 것을 4월에 수확하여 사용하였다. 쑥은 잎의 끝에서부터 줄기를 따라 20 cm 정도에서 절단한 상부를 채취하였으며 흐르는 물에서 2회 세척한후 동결건조하여 추출에 사용하였다. 추출물의 제조를 위해 동결건조된 원물은 중량 100 g당 물 1 l를 첨가한 후 70℃에서 6시간 진탕추출하였고, 여액은 수거하여 동결건조를 통해 최종 건고물을 얻었으며 -70℃에 보관하면서 적정 농도로 증류수에 희석하여 사용하였다.
앞선 세포독성 결과에서 섬애약쑥의 경우 400 μg/ml 농도까지 세포독성이 없는 것으로 확인되었기 때문에 100, 150, 300, 400 μg/ml의 농도에서 NO 생성 억제 효과를 측정하였다.
앞선 실험결과들을 통해 섬애약쑥 추출물이 항염증 효과가 있음을 확인하였고, 이후 HepG2 세포에 어떤 cytokine을 조절하여 항염증 반응을 유도하는지 알아보기 위해 염증성 cytokine의 분비를 측정하였다. 인체를 대상으로 한 Huang 등[12]의 연구에 의하면 혈청 IL-1β, IL-2, IL-6, TNF-α가 급성 C형간염이나 만성 C형 간염 환자보다 간경화 및 간암 환자에서 더 높은 수준으로 유의적 증가를 보여 이들 지표가 간의 염증 보다는 간경화 및 간암 등과 같은 간기능 손상과 더 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
본 연구에서는 황해쑥의 일종인 섬애약쑥의 기능성 규명 및 간기능 개선 식품소재 개발을 위한 기초 연구의 일환으로 섬애약쑥 열수 추출액을 대상으로 간 기능 개선 활성을 확인 하고자 하였다. 이를 위해 우선 항염증 활성지표를 확인하였으며 다음으로 간 독성 지표를 인간 간세포주인 HepG2 세포에서 검증하였다.
대상 데이터
LPS 처리를 통한 간세포 독성 유도 실험과 같은 방법으로 시료를 처리한 후 배양액을 취해 배양액 중에 유리된 alanine transaminase (ALT) 및 aspartate transaminase (AST) 효소의 활성을 측정하였다. ALT와 AST의 활성은 ALT, AST 측정용 시액(Asan pharmaceutical Co., Seoul, Korea)을 구입하여 사용하였다. ALT 및 AST 활성은 기질액인 L-aspartic acid 및 DL-alanine 1 ml에 배양액 0.
섬애약쑥은 경남 남해군에서 재배된 것을 4월에 수확하여 사용하였다. 쑥은 잎의 끝에서부터 줄기를 따라 20 cm 정도에서 절단한 상부를 채취하였으며 흐르는 물에서 2회 세척한후 동결건조하여 추출에 사용하였다.
Student’s t-test 방법에 의하여 각각의 실험군과 대조군간의 유의성 차이를 검증하였다( * p<0.05, **p<0.01, 그리고 ***p<0.001).
데이터는 3회이상 반복실험한 결과를 평균±표준편차로 표현하였으며, 데이터의 통계처리는 Statistical Package for Social Science (Version 10, SPSS, IBM, Armonk, NY, USA)를 이용하여 분석하였다.
성능/효과
ALT의 활성도 LPS를 투여한 대조군이 정상군에 비해 약 2.6배 정도 증가하였고, 쑥추출물 400 μg/ml 처리군은 LPS 단독 대조군에 비해 75.4% 감소하였다.
3). HepG2 세포의 ROS 생성을 확인하였을 때, LPS를 처리하지 않은 세포군에서는 DCF-DA로 염색된 세포가 적었고, LPS로 자극한 세포는 DCF로 염색된 세포가 많은 것으로 보아 세포 내의 ROS 생성이 활발한 것을 알 수 있었다. 섬애약쑥 추출물을 100, 150, 200, 400 μg/ml의 농도를 세포에 전처리하고 30분후 LPS로 자극한 세포의 ROS 생성량을 fluorescence microplate reader를 이용하여 조사해본 결과, LPS를 단독으로 처리한 대조군에 비해 섬애약쑥 추출물 처리군에서 유의적으로 ROS 생성량을 감소시켰다(p<0.
LPS 처리한 HepG2 세포에 대한 섬애약쑥 물 추출물 처리에 의한 세포생존율을 평가한 결과 섬애약쑥은 400 μg/ml 농도까지 무처리 대조군에 비해 유의한 생존율의 감소가 확인되지 않았다(Fig. 1).
가장 감소 활성이 높았던 섬애약쑥 추출물 400 μg/ml 처리군은 대조군과 비교하였을 때 AST 생성이 61.6% 감소하였다.
가장 낮은 농도인 100 μg/ml에서도 40% 정도의 NO 생성억제 활성을 나타내어 높은 NO 생성억제 효율을 가지는 것으로 확인되었다(Fig. 2).
그 결과 쑥 추출물은 400 μg/ml의 농도에서 약 20%까지 IL-8의 분비를 유의적으로 감소시켰다(p<0.05).
또 다른 염증성 cytokine인 M-CSF의 분비량을 측정한 결과(Fig. 4B), 400 μg/ml의 쑥 추출물은 30%까지 M-CSF의 분비를 유의적으로 감소시켰다(p<0.05).
앞선 세포독성 결과에서 섬애약쑥의 경우 400 μg/ml 농도까지 세포독성이 없는 것으로 확인되었기 때문에 100, 150, 300, 400 μg/ml의 농도에서 NO 생성 억제 효과를 측정하였다. 섬애약쑥 추출물은 실험된 모든 농도에서 LPS 단독 처리군에 비해 NO 생성량이 유의적으로 감소하였으며 농도의존적인 NO 생성량 감소를 나타내었다. 가장 낮은 농도인 100 μg/ml에서도 40% 정도의 NO 생성억제 활성을 나타내어 높은 NO 생성억제 효율을 가지는 것으로 확인되었다(Fig.
섬애약쑥 추출물을 100, 150, 200, 400 μg/ml의 농도를 세포에 전처리하고 30분후 LPS로 자극한 세포의 ROS 생성량을 fluorescence microplate reader를 이용하여 조사해본 결과, LPS를 단독으로 처리한 대조군에 비해 섬애약쑥 추출물 처리군에서 유의적으로 ROS 생성량을 감소시켰다(p<0.001).
4% 감소하였다. 이상의 결과로부터 쑥 추출물은 염증성 cytokine의 조절을 통해 ALT와 AST 생성을 억제함으로써 간보호작용을 나타낼 것으로 추정된다.
후속연구
9 μg/ml)은 H9 암세포주에 50%의 세포 독성 발생시키고, CuZnSOD와 MnSOD 활성을 증가시킨다는 보고가 있다[26]. 앞선 연구 결과들에서는 쑥이 높은 독성을 가지고 있는 것으로 확인된 반면 본 실험에 사용한 섬애약쑥 추출물은 상대적으로 높은 농도에서도 세포독성이 유발되지 않았기 때문에 in vitro나 in vivo 실험에 폭넓게 사용이 가능할 것이다.
05). 이러한 염증성 cytokine 분비량 측정결과는 쑥 추출물이 세포생존율에 영향을 미치지 않는 농도에서 간염과 밀접한 관련이 있는 cytokine (IL-8, M-CSF)의 발현 조절을 보여주었으므로 이후 간염 치료를 위한 단서를 제시할 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
간질환의 특징은?
간질환은 만성간염에서 간경변증에 이르기까지 종류와 심한 정도가 다양한데, 간세포 파괴에 의한 해독능력 저하와 담즙분비 억제에 의한 독성물질 배설장애, 비타민 B2 , B3 및 C의 흡수 억제에 의한 전신 권태감, 소양감, 식욕부진, 피로 등의 증상을 동반하며, 간염, 알코올성 간질환, 지방간, 간경변, 간암 등의 질환이 발생하여 사망에까지 이르게 된다[16]. 간질환은 여러 가지 원인에 의해 발병되는 것이 특징이며, 특히 과도한 음주, 흡연, 약물 및 스트레스에 의한 빈도가 높다. 이러한 원인들에 의한 염증성 물질의 발생은 췌장염, 심근경색, 신경 장애 등의 질환을 유발하며 이외에도 간조직의 구조 및 기능에 치명적 손상을 초래하고 있다[10, 21, 22, 36].
섬애약쑥은 간 손상을 나타내는 지표에 어떠한 영향을 주는가?
세포독성이 없는 $100{\sim}400{\mu}g/ml$의 농도 범위에서 섬애약쑥 추출물은 HepG2 세포에서 nitric oxide (NO)와 reactive nitrogen species (ROS)생성을 농도의존적으로 저해하였으며, 간염질환과 밀접한 관계가 있는 cytokine인 M-CSF와 IL-8의 발현을 감소시켰다. 또한 직접적인 간 손상을 나타낼 수 있는 지표인 AST와 ALT의 발현을 유의성 있게 감소시키는 결과를 얻을 수 있었다. 본 실험을 통해서 섬애약쑥물 추출물은 세포독성이 없는 $200{\sim}400{\mu}g/ml$의 범위에서 농도의존적으로 간 염증의 개선 효과를 가질 것이라는 단서를 확인하였다.
LPS항원은 인체 내 무엇에 의해 인식되는가?
Lipopolysaccharide (LPS)는 인체 내 면역부위에서 항원으로 작용하는 대표적인 체내 염증 유발물질로 알려져 있다. LPS항원은 인체 내에서 자기방어 기능으로 인하여 macrophage와 같은 항원 제시세포에 의하여 인식된다. LPS는 주로 Toll-like receptor 계열에 의하여 인식되며 cluster of differentiation-14의 결합으로 인체 내에서 방어기전을 실행시킨다 [24].
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